趙守彰， 孫秀業(yè)

1. 遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110101；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 康復(fù)科，遼寧 沈陽(yáng)110801

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rlaeumatoidarthritis，RA)屬于自身系統(tǒng)性免疫疾病，其主要病理改變包括關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成，骨組織侵蝕，骨關(guān)節(jié)被破壞等[1-3]。 目前，RA 的治療依舊以非甾體類抗炎藥、腎上腺皮質(zhì)激素及抗風(fēng)濕性藥物為主，但以上藥物均不能從本質(zhì)上解決問(wèn)題，且長(zhǎng)期服藥所帶來(lái)的不良反應(yīng)也嚴(yán)重影響疾病的治療效果[4]。 威靈仙是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛之效，威靈仙內(nèi)含有豐富的皂苷類物質(zhì)，威靈仙總皂苷(total saponins of clematis，TSC)在抗炎止痛、調(diào)節(jié)免疫中具有良好的臨床效果，但關(guān)于TSC 在治療RA 中的具體機(jī)制尚處于研究階段[5-6]。 Toll 樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號(hào)通路是RA 發(fā)生發(fā)展中的重要通路，TLR 廣泛表達(dá)于天然免疫細(xì)胞與特異性免疫性細(xì)胞表面，主要通過(guò)髓樣分化蛋白(myeloid differential protein-88，MyD88)依賴途徑，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factorkappa B，NF-κB)，釋放炎性細(xì)胞因子與活化蛋白C，促進(jìn)RA 進(jìn)展[7-8]。 本研究旨在探討TSC 是否可通過(guò)TLR 信號(hào)通路發(fā)揮治療功效。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取60 只SD 雄性大鼠，體質(zhì)量(200 ±20)g，購(gòu)自成都可恩生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(川)2021-235。

1.2 試劑及藥品 完全弗氏佐劑(SIGMA 公司)、蘇木素染液(珠海貝索生物公司)，水合氯醛、75%酒精、甲醛溶液、乙醇、二甲苯等試劑均購(gòu)自江萊生物有限公司，白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司，DAB 顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，β-actin抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TLR4、MyD88、NF-κB p65 抗體購(gòu)自英國(guó)Bioss。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物由南京Realgene 生物技術(shù)有限公司合成。 TSC 購(gòu)自陜西寶雞宣威生物技術(shù)有限公司，經(jīng)UV 檢測(cè)含量為90.7%，陽(yáng)性對(duì)照藥物甲氨蝶呤購(gòu)自上海信誼藥廠。

1.3 儀器及設(shè)備 HERASE 型離心機(jī)(德國(guó))、2H12003 型顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯光學(xué)有限公司、EG1160 型生物組織自動(dòng)包埋機(jī)購(gòu)自德國(guó)LEICA 儀器有限公司，EPS 300 型電泳儀、VE-180型電泳槽、VE-186 型轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自上海天能公司，DNP-9052 BS-Ⅲ型恒溫箱購(gòu)自上海三發(fā)公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型建立 (1)動(dòng)物分組:將60 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為6 組，分別為空白對(duì)照組、RA 模型組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC 低、中、高組，每組各10 只。

(2)RA 模型大鼠建立:適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，除空白對(duì)照組外，其余大鼠經(jīng)左后足跖皮內(nèi)注射FCA 0.1 ml 進(jìn)行建模，具體操作參照文獻(xiàn)[9]，取1 g/L的FCA 溶液1.5 ml 與等體積2 g/L 的膠原溶液，3 000 r/min攪拌3 min 形成穩(wěn)定乳液，利用注射器向大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)處注射0.1 mol/L 的乳液，10 d后，注射膠原與不完全佐劑混合乳液0.05 ml 加強(qiáng)免疫。 造模成功標(biāo)準(zhǔn):24 h 內(nèi)，大鼠足部出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)性腫脹，48 h 內(nèi)繼發(fā)全身性關(guān)節(jié)炎，有前肢、側(cè)肢腫脹表現(xiàn)，耳部、尾部有炎性結(jié)節(jié)表現(xiàn)。

(3)藥物處理:陽(yáng)性藥物對(duì)照組大鼠建模次日給予甲氨蝶呤灌胃，以成人用量經(jīng)表面積轉(zhuǎn)化為大鼠等效劑量，將甲氨蝶呤溶于生理鹽水，配置為濃度為0.051 mg/ml 的溶液，按照1 ml/100 mg 用量灌胃。 參照文獻(xiàn)[5]中相關(guān)劑量，分別給予TSC 低、中、高劑量組50、100、200 mg/kg/d TSC 灌胃。 空白對(duì)照組及RA 模型組均給予等體積生理鹽水灌胃。灌胃處理15 d 后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.2 血清炎癥因子檢測(cè) 采用10%水合氯醛麻醉大鼠，采集腹主動(dòng)脈血，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，置于-80℃冰箱待用。 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)大鼠IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平，按照試劑盒相關(guān)規(guī)定進(jìn)行操作。

1.4.3 大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)及左后足厚度測(cè)量 分別于建模前后及給藥前后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠左后足關(guān)節(jié)厚度及踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，計(jì)算踝關(guān)節(jié)腫脹度。 根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹度劃分關(guān)節(jié)炎指數(shù)，腫脹度＜5% 計(jì)0 分、5% ~15%計(jì)1 分、16% ~30%計(jì)2 分、31% ~60%計(jì)3 分、腫脹度＞60%計(jì)4 分。

腫脹度＝建模后(給藥后)踝關(guān)節(jié)厚度-建模前(給藥前)踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)

1.4.4 大鼠踝關(guān)節(jié)病理組織觀察 取麻醉后大鼠將其處死，手術(shù)者離斷大鼠注射側(cè)踝關(guān)節(jié)，固定于4%多聚甲醛，脫鈣、脫水處理，石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下攝片，觀察其踝關(guān)節(jié)病理改變。按照滑膜炎(滑膜襯層細(xì)胞成數(shù)、血管翳、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、新生血管)、骨/軟骨破壞(骨侵蝕、軟骨侵蝕、關(guān)節(jié)粘連、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞)、關(guān)節(jié)修復(fù)(新生骨、關(guān)節(jié)軟骨)等3 個(gè)方面行病理組織學(xué)評(píng)分(病理學(xué)積分)，按照各項(xiàng)的嚴(yán)重程度，分別得0 ~3 分，正常為0 分、輕度為1 分、中度為2 分、重度為3 分，總得分0 ~40 分，得分越高提示大鼠踝關(guān)節(jié)病理改變?cè)絿?yán)重。所有操作及病理結(jié)果均由同一位操作者進(jìn)行，減少因個(gè)體差異所導(dǎo)致的誤差。

1.4.5 Western blot 檢驗(yàn) 10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉后處死大鼠，取大鼠注射側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織，加入RIPA 細(xì)胞裂解液1 ml，4℃、1 200 r/min離心15 min，收集含有組織總蛋白的上清液，BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳，濃縮膠80 V、30 min，分離膠120 V、1 h，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜，PBST 漂洗5 min，5%脫脂奶粉搖床室溫封閉2 h，依照說(shuō)明書，采用封閉液配置一抗，濃度:TBST 一抗2 000 ∶1，4℃孵育12 h，加入二抗，抗TLR4 1∶200，抗MyD88 1 ∶200，抗NF-κB p65 1 ∶200，抗NF-κB p65 磷 酸 化(phosphorylation of NF-κB p65，p-NF-κB p65)1 ∶200，抗β-actin 1 ∶1 000，抗GAPDH 1∶1 000， 室 溫 下 孵 育2 h， PBST 洗 滌10 min、3 次，應(yīng)用ECL 超敏發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光與X 膠片顯影，定影，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析灰度條帶圖片，定量分析各組TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白表達(dá)量及p-NF-κB p65 蛋白水平。

1.4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，剪碎，滴加Trizol 溶液，提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct計(jì)算TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 表達(dá)量。 逆轉(zhuǎn)錄條件為37℃，反應(yīng)15 min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活條件為85℃，反應(yīng)15 s。 在95℃下激活DNA 聚合酶5 min進(jìn)行PCR，循環(huán)40 次，反應(yīng)條件為95℃、10 s，60℃、30 s 最終延伸75℃下反應(yīng)10 min，最后溫度維持在4℃。 引物序列如下，actin 上游引物:5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′， 下 游 引 物: 5′-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3′； NF-κB 上 游 引 物: 5′-GGCATGCGTTTCCGTTACAA-3′，下 游 引 物:5′-ATTGGGTGCGTCTTAGTGGT-3′；MyD88 上游引物:5′-CGGAGGCATCCAACAAACTGC-3′，下 游 引 物:5′-GAGGACAATGCTCTGGGGAG-3′；TLR 上 游引 物:5′-GAGGACAATGCTCTGGGGAG-3′， 下 游 引 物: 5′-ATGGGTTTTAGGCGCAGAGT-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)、足墊厚度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較 RA 模型組大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)、足墊厚度以及關(guān)節(jié)炎指數(shù)水平均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC 低、中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)、足墊厚度以及關(guān)節(jié)炎指數(shù)水平均低于RA 模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC 低、中劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)、足墊厚度以及關(guān)節(jié)炎指數(shù)水平相似，均高于TSC 高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理改變程度比較 RA模型組大鼠病理學(xué)積分高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC 低、中、高劑量組大鼠病理學(xué)積分均低于RA 模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC 低、中劑量組大鼠病理學(xué)積分相似，均高于TSC高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 見表2。

表1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)、足墊厚度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較(ˉx±s)

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理改變程度比較(ˉx±s，積分/分)

2.3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 RA 模型組大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平均高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC 低、中、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平均低于RA 模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC低、中劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平相似，均高于TSC 高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 見表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較(ˉx±s)

2.4 各組大鼠Toll 樣受體信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 RA模型組MyD88、NF-κB p65、TLR4 蛋白及p-NF-κB p65 蛋白水平均高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC低、中、高劑量組MyD88、NF-κB p65、TLR4 蛋白及p-NF-κB p65 蛋白水平均低于RA 模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC低、中劑量組MyD88、NF-κB p65、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白水平相似，均高于TSC 高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 見表4。

表4 各組大鼠Toll 樣受體信號(hào)通路蛋白表達(dá)及踝關(guān)節(jié)組織p-NF-κB p65 蛋白水平比較(ˉx±s)

2.5 各組大鼠Toll 樣受體信號(hào)通路中各信號(hào)分子基因表達(dá)情況比較 RA 模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織內(nèi)MyD88、NF-κB p65 及TLR4 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC 低、中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)組織內(nèi)MyD88、NF-κB p65 及TLR4 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量均低于RA 模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。 陽(yáng)性藥物對(duì)照組及TSC 低、中劑量組大鼠血清踝關(guān)節(jié)組織內(nèi)MyD88、NF-κB p65 及TLR4 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量相似，均高于TSC 高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表5。

表5 各組大鼠Toll 樣受體信號(hào)通路中各信號(hào)分子基因表達(dá)情況比較(mRNA 相對(duì)表達(dá)量，ˉx±s)

3 討論

威靈仙是我國(guó)傳統(tǒng)祛風(fēng)濕性藥物，臨床研究表明，威靈仙熏洗能有效緩解關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)疼痛與腫脹癥狀，改善其關(guān)節(jié)功能[10]。 TSC 提取自威靈仙，是威靈仙的有效成分，被證實(shí)有良好的抗炎止痛功效。 本研究利用弗氏完全佐劑法制備RA 大鼠模型，并分別向RA 模型大鼠行50、100、200 mg/kg/d的TSC 灌胃處理，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度TSC 灌胃處理后的RA 大鼠踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)、足墊厚度及踝關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)水平均更低；病理組織觀察發(fā)現(xiàn)，TSC 處理后的RA 模型大鼠踝關(guān)節(jié)病理改變更輕，且呈劑量依耐性減輕。 這說(shuō)明TSC 可有效改善RA 模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹及RA 病理改變。

炎癥反應(yīng)是RA 致病機(jī)制中的重要組成部分。有研究報(bào)道，IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量與RA 病情嚴(yán)重程度之間存在密切聯(lián)系，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致RA持續(xù)存在、病情遷延的重要原因[11-12]。 本研究中，RA 模型組大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 較空白對(duì)照組大鼠明顯升高，說(shuō)明RA 大鼠體內(nèi)存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，機(jī)體抗炎機(jī)能降低。 而經(jīng)不同濃度TSC灌胃處理后的RA 大鼠血清IL-6、IL-1β 及TNF-α水平均較RA 模型組下降，提示TSC 可降低RA 大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。

TLR 是RA 研究中重要的模式識(shí)別受體，其信號(hào)通路與多種自身免疫性疾病相關(guān)。 TLR 結(jié)合內(nèi)源性配體，通過(guò)其損傷分子模式識(shí)別后，由細(xì)胞表面MyD88 介導(dǎo)下游NF-κB 向核內(nèi)傳遞信號(hào)，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥因子IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子表達(dá)，TLR4還可以通過(guò)激活MyD88/NF-κB 通路誘導(dǎo)激活蛋白-1 產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)， 參與RA 的發(fā)生與發(fā)展[13-15]。

為探討TSC 是否通過(guò)TLR 信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)，減輕RA 病理改變，本研究行Western blot 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度TSC 處理后的大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)MyD88、NF-κB p65 及TLR4 蛋白表達(dá)量均較RA 模型組降低，p-NF-κB p65 蛋白水平也較RA模型組降低。 NF-κB 是細(xì)胞內(nèi)較常見的核轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)，NF-κB p65 可活化NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，激活與早期炎癥及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因，產(chǎn)生IL-6、TNF-α 等大量炎癥因子，參與RA 的發(fā)生及進(jìn)展。 此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)TLR 信號(hào)通路中各信號(hào)分析基因表達(dá)量結(jié)果與Western blot 結(jié)果一致，且隨著TSC 濃度的增加，RA 小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)MyD88、NF-κB p65、TLR4 蛋白及基因表達(dá)量均呈劑量依耐性降低。 這說(shuō)明TSC 可能通過(guò)調(diào)控TLR 信號(hào)通路，發(fā)揮抗RA 功效。 但受限于研究設(shè)計(jì)與研究條件，本研究并未對(duì)TSC 治療RA 的其他可能途徑進(jìn)行研究，存在一定的不足。

綜上所述，TSC 可能通過(guò)抑制TLR 信號(hào)通路(TLR4/MyD88/NF-κB p65)，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，減輕RA 大鼠踝關(guān)節(jié)病理改變及關(guān)節(jié)腫脹度。