高 莎 沈 璽

視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與色素上皮層分離是視網(wǎng)膜脫離(RD)患者視力喪失的主要原因。盡管常規(guī)手術(shù)治療可以復(fù)位視網(wǎng)膜，但RD誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致患者視功能恢復(fù)欠佳[1]。因此，研究RD病理?yè)p傷的過(guò)程，探索保護(hù)光感受器細(xì)胞的藥物，對(duì)于RD患者視覺(jué)穩(wěn)定具有重要意義。

腺苷A2A受體(A2AR)是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[2]，A2AR存在于小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中，A2AR拮抗劑ZM241385可抑制RD動(dòng)物模型視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白和白細(xì)胞介素-1表達(dá)，并可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平，減少光感受器細(xì)胞凋亡。然而，對(duì)于ZM241385在RD動(dòng)物模型視網(wǎng)膜中介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用仍需進(jìn)一步闡釋。

Müller細(xì)胞參與RD動(dòng)物模型視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和增殖反應(yīng)[3]，它也是光感受器細(xì)胞凋亡的主要細(xì)胞毒素來(lái)源[4-5]。視網(wǎng)膜中谷氨酰胺合成酶(GS)由Müller細(xì)胞合成，可以分解谷氨酸從而減輕谷氨酸堆積產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用，防止視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生退行性病變[6]。單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1和腫瘤壞死因子(TNF)-α是重要的炎癥細(xì)胞因子，在RD動(dòng)物模型視網(wǎng)膜中的含量均顯著增多[7-8]。本研究擬探討ZM241385對(duì)RD動(dòng)物模型視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取健康雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠48只作為研究對(duì)象，鼠齡7～9周，體質(zhì)量25～30 g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院提供。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵循美國(guó)視覺(jué)眼科研究學(xué)會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)定。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照+二甲基亞砜(DMSO)組、對(duì)照+ZM241385組、RD+DMSO組、RD+ZM241385組，每組12只，每只小鼠右眼用于實(shí)驗(yàn)。RD模型建立后，實(shí)驗(yàn)小鼠立即腹腔注射ZM241385(3 mg·kg-1，劑量不超過(guò)0.2 mL)或同體積DMSO，連續(xù)給藥3 d。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑ZM241385(美國(guó)Selleck生物科技有限公司)，抗β-actin抗體、抗MCP-1抗體(美國(guó)CST公司)，抗TNF-α抗體、抗Cleaved caspase 3抗體、抗B細(xì)胞淋巴瘤抗體(Bcl)-2(美國(guó)Abcam公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RD小鼠動(dòng)物模型的制備參照文獻(xiàn)[9]的方法，取實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1，腹腔注射)麻醉，去氧腎上腺素(50 g·L-1)和托吡卡胺(5 g·L-1)散瞳。在手術(shù)顯微鏡下剪開(kāi)角鞏膜緣后顳側(cè)球結(jié)膜。應(yīng)用30G針沿角膜緣后2 mm處制備鞏膜隧道，并穿刺角膜降低眼壓。將連接Hamilton 10 μL注射器的33G針頭通過(guò)鞏膜隧道插入周邊視網(wǎng)膜下腔，緩慢注入10 g·L-1透明質(zhì)酸鈉4 μL，使約60%的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與下方色素上皮層分離，隨后采用氧氟沙星眼膏涂眼。分析并排除視網(wǎng)膜下出血或未發(fā)生脫離的眼。

1.2.2 免疫熒光染色檢測(cè)視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞GS的表達(dá)注藥后3 d，通過(guò)腹腔注射過(guò)量20 g·L-1戊巴比妥鈉每組處死3只小鼠，摘出眼球置入40 g·L-1多聚甲醛固定液(4 ℃，過(guò)夜)中，制備視杯，采用梯度濃度蔗糖溶液脫水，OCT包埋。常規(guī)制作視網(wǎng)膜組織冰凍切片，用PBS漂洗(3次，每次5 min)；然后使用體積分?jǐn)?shù)0.1%的TritonX-10浸泡20 min，PBS漂洗(3次，每次5 min)；滴加山羊血清封閉液封閉30 min，PBS漂洗(3次，每次5 min)；滴加兔源GS抗體(1200)，于4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗(3次，每次10 min)；滴加Alexa-555標(biāo)記的抗兔二抗室溫避光孵育2 h，PBS漂洗(3次，每次5 min)；滴加含DAPI的封片劑封片后，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.3 Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α、Cleaved caspase 3和Bcl-2的表達(dá)注藥后3 d，通過(guò)腹腔注射過(guò)量20 g·L-1戊巴比妥鈉每組處死9只小鼠，摘出眼球，于冰上小心分離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，立即置于液氮罐中保存。將液氮保存的視網(wǎng)膜樣本稱重后按16加入預(yù)冷的高強(qiáng)度RIPA裂解液，4 ℃下充分勻漿。靜置1 h后，采用高速冷凍離心機(jī)離心(20 000 r·min-1，30 min)后吸出上清，采用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量，100 g·L-1SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用50 g·L-1脫脂牛奶封閉膜(37.5 ℃，1 h)，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量截取目的蛋白MCP-1、TNF-α、Cleaved caspase 3、Bcl-2和β-actin條帶，配制適當(dāng)濃度的兔源一抗，將PVDF膜放入其中，4 ℃孵育過(guò)夜。之后，采用TBST溶液漂洗(3次，每次5 min)，羊抗兔二抗孵育(37.5 ℃，2 h)后TBST溶液再次漂洗(3次，每次5 min)，滴加化學(xué)發(fā)光液顯色，以凝膠成像系統(tǒng)拍攝并用ImageJ軟件分析各蛋白灰度值。采用β-actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量(目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad軟件(Prism 8)進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行組間比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS的表達(dá)免疫熒光染色結(jié)果顯示：RD+DMSO組小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS熒光強(qiáng)度較對(duì)照+DMSO組顯著降低，而RD+ZM241385組小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS熒光強(qiáng)度較RD+DMSO組顯著升高(圖1)。這表明ZM241385可以促進(jìn)RD小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS的表達(dá)。

圖1 免疫熒光染色檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS的表達(dá) A:對(duì)照+DMSO組；B：對(duì)照+ZM241385組；C：RD+DMSO組；D：RD+ZM241385組。GCL為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，INL為內(nèi)核層，ONL為外核層。

2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α蛋白表達(dá)情況Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照+DMSO組、對(duì)照+ZM241385組、RD+DMSO組和RD+ZM241385組MCP-1相對(duì)表達(dá)量分別為0.30±0.02、0.31±0.04、0.70±0.03、0.32±0.02，TNF-α相對(duì)表達(dá)量分別為0.29±0.02、0.26±0.02、0.56±0.02、0.29±0.03。對(duì)照+DMSO組和對(duì)照+ZM241385組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α蛋白表達(dá)水平組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。RD+DMSO組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α蛋白表達(dá)水平較對(duì)照+DMSO組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)，而RD+ZM241385組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α蛋白表達(dá)水平較RD+DMSO組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)(圖2)。這表明ZM241385可以抑制RD小鼠視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α蛋白表達(dá)。

圖2 Western blot檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α蛋白的表達(dá)

2.3 各組小鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照+DMSO組、對(duì)照+ZM241385組、RD+DMSO組、RD+ZM241385組Cleaved caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.11±0.01、0.13±0.01、0.46±0.03、0.14±0.02，Bcl-2相對(duì)表達(dá)量分別為0.46±0.02、0.48±0.02、0.17±0.02、0.44±0.01。對(duì)照+DMSO組和對(duì)照+ZM241385組小鼠視網(wǎng)膜Cleaved caspase 3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與對(duì)照+DMSO組相比，RD+DMSO組小鼠視網(wǎng)膜Cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。而與RD+DMSO組相比，RD+ZM241385組小鼠視網(wǎng)膜Cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平顯著下降，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)(圖3)。這表明ZM241385可以抑制RD小鼠視網(wǎng)膜Cleaved caspase 3蛋白表達(dá)并可促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)。

圖3 Western blot檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜Cleaved caspase 3、Bcl-2蛋白的表達(dá)

3 討論

RD的主要病理學(xué)特征為視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和色素上皮層分離，分離后的神經(jīng)上皮層喪失了與色素上皮層的物質(zhì)交換和來(lái)自脈絡(luò)膜的血供，繼發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥等一系列反應(yīng)，導(dǎo)致光感受器細(xì)胞外節(jié)崩解縮短和光感受器細(xì)胞凋亡[10]。

在RD病理生理改變中，Müller細(xì)胞參與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生以及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和增殖反應(yīng)[3]，它也是光感受器細(xì)胞凋亡的主要細(xì)胞毒素來(lái)源[4-5]。視網(wǎng)膜中GS由Müller細(xì)胞合成，可以分解谷氨酸從而減輕谷氨酸堆積產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，防止視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生退行性病變[6]。以往對(duì)RD動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，RD造模2 d后即可發(fā)現(xiàn)GS表達(dá)下降，7 d后下降到幾乎檢測(cè)不到的水平[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，RD小鼠造模3 d時(shí)Müller細(xì)胞GS表達(dá)顯著下降，而應(yīng)用A2AR拮抗劑ZM241385可以有效上調(diào)RD動(dòng)物模型視網(wǎng)膜GS表達(dá)水平，GS分布自外核層貫穿整個(gè)神經(jīng)視網(wǎng)膜。本研究結(jié)果提示，阻斷A2AR可以提高RD動(dòng)物模型視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞GS表達(dá)水平，減少視網(wǎng)膜谷氨酸堆積，預(yù)防視網(wǎng)膜功能障礙，在RD治療中發(fā)揮積極作用。

MCP-1和TNF-α是重要的炎癥細(xì)胞因子，常參與各種視網(wǎng)膜病變[12-14]。研究報(bào)道，MCP-1在RD患者玻璃體[15]及RD大鼠視網(wǎng)膜[7]中表達(dá)增加。近期研究發(fā)現(xiàn)，RD導(dǎo)致Müller細(xì)胞中MCP-1表達(dá)增加，并導(dǎo)致脫離視網(wǎng)膜中CD11b+巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞顯著增多，而應(yīng)用MCP-1抗體阻斷或MCP-1基因缺陷小鼠可以有效抑制脫離視網(wǎng)膜巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)和光感受器細(xì)胞凋亡[16]。研究證明，RD大鼠視網(wǎng)膜TNF-α表達(dá)顯著增多[8]，經(jīng)MSC-Exos處理后RD動(dòng)物模型視網(wǎng)膜TNF-α表達(dá)降低，同時(shí)光感受器細(xì)胞凋亡減少。本研究發(fā)現(xiàn)，RD小鼠視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α表達(dá)均顯著增加，而ZM241385干預(yù)后RD小鼠視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α的表達(dá)均顯著降低。本研究結(jié)果表明，A2AR拮抗劑ZM241385可以抑制RD小鼠視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-α蛋白表達(dá)。

A2AR在不同病理狀況下的介導(dǎo)作用存在差異。在外周免疫細(xì)胞中激活A(yù)2AR具有抗炎作用[17-18]，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病中，阻斷A2AR可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[19]。最近，A2AR拮抗劑ZM241385干預(yù)已被證實(shí)可以減少膠質(zhì)細(xì)胞的活化并降低促炎因子的表達(dá)，從而提高實(shí)驗(yàn)性青光眼的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率[20]。此外，A2AR阻斷也已被證實(shí)可降低具有缺血樣損傷的大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[21]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[2]，A2AR存在于小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中，A2AR拮抗劑ZM241385可以抑制RD造模后Müller細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白和白細(xì)胞介素-1表達(dá)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化及視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激，減少光感受器細(xì)胞凋亡。本研究我們發(fā)現(xiàn)，ZM241385可以上調(diào)RD動(dòng)物模型小鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞GS表達(dá)水平，抑制視網(wǎng)膜MCP-1、TNF-蛋白表達(dá)，同時(shí)抑制凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved caspase 3表達(dá)，上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)。研究證實(shí)，ZM241385可以有效抑制RD造模后Müller細(xì)胞谷氨酸堆積細(xì)胞毒性，緩解視網(wǎng)膜神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減少光感受器細(xì)胞凋亡。因此，阻斷A2AR的藥物療法可能對(duì)抑制RD誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞凋亡至關(guān)重要。不過(guò)，為更好評(píng)估A2AR調(diào)控在RD疾病治療中的效果，A2AR拮抗劑的給藥方式仍需改進(jìn)。