張廷瑞 白林壯 黃亮亮 蔣正杰 岑財(cái)貴 郜二虎 貝永建
(1.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,桂林,541000;2.玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院,玉林,537000;3.廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理中心,隆林,533400;4.國(guó)家林業(yè)和草原局調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院,北京,100714)
蛙科(Ranidae)林蛙屬(Rana)物種主要分布于歐亞大陸和美洲大陸,中國(guó)目前記錄分布有27種,其中廣西有4種,即徂徠林蛙(Ranaculaiensis)、寒露林蛙(R.hanluica)、越南趾溝蛙(R.johnsi)和貓兒山林蛙(R.maoershanensis)[1]。昭覺(jué)林蛙(R.chaochiaoensis)隸屬于蛙科林蛙屬,主要分布于四川、云南和貴州[1-2],關(guān)于昭覺(jué)林蛙在廣西是否有分布曾經(jīng)存在爭(zhēng)議。2006年,陸宇燕等[3]在廣西貓兒山采集到1種林蛙,經(jīng)形態(tài)鑒定為昭覺(jué)林蛙,并以《廣西兩棲動(dòng)物一新紀(jì)錄——昭覺(jué)林蛙》發(fā)表在《四川動(dòng)物》上。但在2007年,Lu等[4]因在貓兒山采集到的昭覺(jué)林蛙標(biāo)本形態(tài)特征不同于其他林蛙屬物種,又重新將其確定為新種——貓兒山林蛙,并于2010年通過(guò)16S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),分子生物學(xué)證據(jù)顯示,確定Yang等在廣西貓兒山采集到林蛙屬標(biāo)本為貓兒山林蛙,而不是昭覺(jué)林蛙[5]。費(fèi)梁等[2]和莫運(yùn)明等[6]認(rèn)為目前已有的資料和證據(jù)不足以說(shuō)明廣西分布有昭覺(jué)林蛙。因此,對(duì)于昭覺(jué)林蛙在廣西是否有分布還缺乏有力的證據(jù)。
2021年7月,調(diào)查人員在廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(24°34′5.06″ N,104°54′18.15″ E;海拔1 359 m)進(jìn)行全國(guó)第二次陸生野生動(dòng)物資源調(diào)查時(shí)采集到林蛙屬標(biāo)本1號(hào)(發(fā)現(xiàn)時(shí),該標(biāo)本剛被車(chē)輛碾壓致死),編號(hào)Ylussy0040,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定比較,與昭覺(jué)林蛙相似;經(jīng)分子生物學(xué)分析,確定該標(biāo)本為昭覺(jué)林蛙,為昭覺(jué)林蛙在廣西的分布提供了形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)證據(jù)。
取標(biāo)本的肝臟組織保存于95%乙醇溶液中,用于提取總DNA。Ylussy0040標(biāo)本浸泡在10%的福爾馬林溶液中,保存于玉林師范學(xué)院。
參照《中國(guó)兩棲動(dòng)物及其分布彩色圖鑒》[2]對(duì)標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)鑒定。
利用天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取總DNA。利用常規(guī)PCR擴(kuò)增12S rRNA(引物H56/L13和H1478/L1091)和16S rRNA(引物H10/L2A和H4551/L3975)部分基因片段,引物序列見(jiàn)表1,PCR擴(kuò)增條件和步驟參照Lyu等[7]的研究。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,將片段大小符合要求的產(chǎn)物交廣州艾基生物技術(shù)有限公司雙向測(cè)序,測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
表1 引物序列信息
從GenBank下載包含12S rRNA和16S rRNA的21個(gè)林蛙屬和蛙科部分相近物種的基因序列(表2),結(jié)合本次調(diào)查中的標(biāo)本序列,進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析,以無(wú)指盤(pán)臭蛙(Odorranagrahami)和黑斑側(cè)褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)為外群。在MEGA 7[8]中利用Align by Clustl W對(duì)所下載序列比對(duì),人工校對(duì)比對(duì)后的序列,結(jié)果基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算物種間的遺傳距離。使用貝葉斯法(Bayesian inference of phylogeny,BI)和最大似然法(maximum likelihood method,ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用PhyloSuit v1.2.2軟件選擇最適模型[9],構(gòu)建BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行5 000次Bootstrap重抽樣分析)。
表2 構(gòu)建林蛙屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的相關(guān)序列
Ylussy0040標(biāo)本吻端鈍尖、突出于下唇,吻棱明顯,頰部稍向外傾斜有一淺凹陷,瞳孔呈橢圓形,背側(cè)褶較寬厚而平直,在顳部上方不彎曲,從眼后直達(dá)胯部;體側(cè)棕紅色,散布不規(guī)則的小黑點(diǎn),四肢背面有粗細(xì)不一的黑色橫紋;背側(cè)褶色淺,其上的橘紅色小點(diǎn)明顯,背側(cè)褶間有隱約可見(jiàn)的不規(guī)則斑紋(圖1A);皮膚較平滑,有分散的圓疣,體背為紅棕色,并散有橘紅色小點(diǎn)(圖1B);手、趾指細(xì)長(zhǎng),上、下唇緣有灰黑色斑點(diǎn),腹面光滑,呈乳黃色或乳白色,近胯部及股腹面為橘紅色(圖1C)。經(jīng)形態(tài)學(xué)比較,采集于廣西隆林的林蛙標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙在形態(tài)特征上相符合。
圖1 標(biāo)本Ylussy0040的形態(tài)特征
標(biāo)本Ylussy0040的12S rRNA和16S rRNA基因片段經(jīng)過(guò)比對(duì)拼接后,得到的有效序列長(zhǎng)度為1 761 bp(12S rRNA長(zhǎng)度為731 bp,16S rRNA為1 030 bp),基因序列上傳到GenBank,登錄號(hào)為OL583993(12S rRNA)和OL444874(16S rRNA)。
基于BI和ML構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示出相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。BI發(fā)育樹(shù)顯示,采自隆林的林蛙標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本(四川昭覺(jué))聚為一支,且具有較高的支持率(100.0%)(圖2);ML發(fā)育樹(shù)顯示,采自隆林的林蛙標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本相聚后構(gòu)成單系,且具有較高的支持率(99.0%)(圖3)?;贙imura雙參數(shù)模型估算的遺傳距離表明,標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本之間的遺傳距離為0.4%,除標(biāo)本Ylussy0040外,其他物種之間的遺傳距離為1.0%~21.8%,Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本的遺傳距離遠(yuǎn)小于林蛙屬其他物種(表3)。
圖2 基于12S rRNA和16S rRNA基因序列構(gòu)建的林蛙屬部分物種貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
圖3 基于12S rRNA和16S rRNA基因序列構(gòu)建的林蛙屬部分物種最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
表3 基于12S rRNA基因和16S rRNA基因計(jì)算林蛙屬部分物種的遺傳距離
經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)合BI發(fā)育樹(shù)、ML發(fā)育樹(shù)和遺傳距離結(jié)果,確定采集于廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的標(biāo)本Ylussy0040為昭覺(jué)林蛙,明確了昭覺(jué)林蛙在廣西的分布。
廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)西部,云貴高原邊緣,在氣候帶上處于南亞熱帶。標(biāo)本Ylussy0040采集于海拔1 359 m的郁閉度較高的山地常綠闊葉林林緣(圖4),位于保護(hù)區(qū)的核心區(qū),周?chē)脖幻ⅲ酁槌>G闊葉林,采集點(diǎn)附近分布的兩棲類(lèi)動(dòng)物有飾紋姬蛙(Microhylafissipes)、澤陸蛙(Fejervaryamultistriata)和鋸?fù)仍笜?shù)蛙(Kurixalusodontotarsus)等。
圖4 廣西昭覺(jué)林蛙的發(fā)現(xiàn)地
廣西地處云貴高原的東南邊緣,跨中亞熱帶、南亞熱帶和北亞熱帶3個(gè)氣候區(qū),氣候溫暖濕潤(rùn),降雨量豐沛,地形地貌復(fù)雜,植被種類(lèi)多樣,孕育了豐富多樣的兩棲動(dòng)物,其中林蛙屬物種分布廣泛,由于大多數(shù)物種形態(tài)較為相似,導(dǎo)致在野外很難鑒定[2]。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,形態(tài)比較結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)分析方法對(duì)物種進(jìn)行鑒定已被廣泛應(yīng)用[10-15]。
昭覺(jué)林蛙的體色隨生境不同而改變,生活于林地的體色呈深棕色或棕黑色,生活于水邊的體色為淺棕色,生活于深草中的為黑褐色[16]。標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本相比,在形態(tài)上一致,與廣西的4種林蛙屬物種(徂徠林蛙、寒露林蛙、越南趾溝蛙和貓兒山林蛙)相比,標(biāo)本Ylussy0040體背為紅棕色,并散有橘紅色小點(diǎn),區(qū)別于徂徠林蛙(體背多為紅褐色或棕灰色而無(wú)深色斑)和貓兒山林蛙(體背面多為紅褐色或褐色,具有黑褐色條形斑或點(diǎn)狀斑),標(biāo)本Ylussy0040左右跟部重疊較多,區(qū)別于徂徠林蛙(左右跟部重疊)、寒露林蛙(左右跟部明顯重疊)和貓兒山林蛙(左右跟部?jī)H相遇),標(biāo)本Ylussy0040頰部有一淺凹陷,區(qū)別于越南趾溝蛙頰部凹陷。
昭覺(jué)林蛙主要分布于四川西南部、云南和貴州西部[2],標(biāo)本Ylussy0040的采集地在廣西百色市隆林縣的廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)。隆林縣位于云貴高原的邊緣,與云南和貴州的昭覺(jué)林蛙分布點(diǎn)很近,從地理位置上看,昭覺(jué)林蛙在隆林縣分布具有很大的可能性。另外,該標(biāo)本的采集地為海拔1 359 m的郁閉度較高的山地常綠闊葉林林緣,周?chē)脖幻?,環(huán)境潮濕,與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本的生境非常相似。
不同地理分區(qū)的同一物種會(huì)產(chǎn)生一定的遺傳分化,物種間遺傳距離越小,親緣關(guān)系就越近。本研究從GenBank下載包含12S rRNA和16S rRNA的林蛙屬和蛙科部分相近物種的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),計(jì)算遺傳距離,發(fā)現(xiàn)Ylussy0040與鎮(zhèn)海林蛙(Ranazhenhaiensis)、大別山林蛙(R.dabieshanensis)、峨眉林蛙(R.omeimontis)、長(zhǎng)肢林蛙(R.longicrus)、寒露林蛙和越南趾溝蛙的遺傳距離分別為3.8%、3.8%、3.9%、4.4%、4.7%和7.4%,和昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本的遺傳距離僅為0.4%,遠(yuǎn)小于其他林蛙屬物種的遺傳距離,且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與昭覺(jué)林蛙形成單系。因此,結(jié)合分子生物學(xué)分析和形態(tài)學(xué)比較,鑒定標(biāo)本Ylussy0040為昭覺(jué)林蛙,為昭覺(jué)林蛙在廣西分布提供了新證據(jù),也豐富了昭覺(jué)林蛙的分布信息。