基于形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定廣西昭覺(jué)林蛙的分布

張廷瑞 白林壯 黃亮亮 蔣正杰 岑財(cái)貴 郜二虎 貝永建

(1.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，桂林，541000；2.玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，玉林，537000；3.廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理中心，隆林，533400；4.國(guó)家林業(yè)和草原局調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京，100714)

蛙科(Ranidae)林蛙屬(Rana)物種主要分布于歐亞大陸和美洲大陸，中國(guó)目前記錄分布有27種，其中廣西有4種，即徂徠林蛙(Ranaculaiensis)、寒露林蛙(R.hanluica)、越南趾溝蛙(R.johnsi)和貓兒山林蛙(R.maoershanensis)[1]。昭覺(jué)林蛙(R.chaochiaoensis)隸屬于蛙科林蛙屬，主要分布于四川、云南和貴州[1-2]，關(guān)于昭覺(jué)林蛙在廣西是否有分布曾經(jīng)存在爭(zhēng)議。2006年，陸宇燕等[3]在廣西貓兒山采集到1種林蛙，經(jīng)形態(tài)鑒定為昭覺(jué)林蛙，并以《廣西兩棲動(dòng)物一新紀(jì)錄——昭覺(jué)林蛙》發(fā)表在《四川動(dòng)物》上。但在2007年，Lu等[4]因在貓兒山采集到的昭覺(jué)林蛙標(biāo)本形態(tài)特征不同于其他林蛙屬物種，又重新將其確定為新種——貓兒山林蛙，并于2010年通過(guò)16S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分子生物學(xué)證據(jù)顯示，確定Yang等在廣西貓兒山采集到林蛙屬標(biāo)本為貓兒山林蛙，而不是昭覺(jué)林蛙[5]。費(fèi)梁等[2]和莫運(yùn)明等[6]認(rèn)為目前已有的資料和證據(jù)不足以說(shuō)明廣西分布有昭覺(jué)林蛙。因此，對(duì)于昭覺(jué)林蛙在廣西是否有分布還缺乏有力的證據(jù)。

2021年7月，調(diào)查人員在廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(24°34′5.06″ N，104°54′18.15″ E；海拔1 359 m)進(jìn)行全國(guó)第二次陸生野生動(dòng)物資源調(diào)查時(shí)采集到林蛙屬標(biāo)本1號(hào)(發(fā)現(xiàn)時(shí)，該標(biāo)本剛被車(chē)輛碾壓致死)，編號(hào)Ylussy0040，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定比較，與昭覺(jué)林蛙相似；經(jīng)分子生物學(xué)分析，確定該標(biāo)本為昭覺(jué)林蛙，為昭覺(jué)林蛙在廣西的分布提供了形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取標(biāo)本的肝臟組織保存于95%乙醇溶液中，用于提取總DNA。Ylussy0040標(biāo)本浸泡在10%的福爾馬林溶液中，保存于玉林師范學(xué)院。

1.2 形態(tài)鑒定

參照《中國(guó)兩棲動(dòng)物及其分布彩色圖鑒》[2]對(duì)標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.3 分子鑒定

利用天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取總DNA。利用常規(guī)PCR擴(kuò)增12S rRNA(引物H56/L13和H1478/L1091)和16S rRNA(引物H10/L2A和H4551/L3975)部分基因片段，引物序列見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增條件和步驟參照Lyu等[7]的研究。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將片段大小符合要求的產(chǎn)物交廣州艾基生物技術(shù)有限公司雙向測(cè)序，測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 引物序列信息

從GenBank下載包含12S rRNA和16S rRNA的21個(gè)林蛙屬和蛙科部分相近物種的基因序列(表2)，結(jié)合本次調(diào)查中的標(biāo)本序列，進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，以無(wú)指盤(pán)臭蛙(Odorranagrahami)和黑斑側(cè)褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)為外群。在MEGA 7[8]中利用Align by Clustl W對(duì)所下載序列比對(duì)，人工校對(duì)比對(duì)后的序列，結(jié)果基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算物種間的遺傳距離。使用貝葉斯法(Bayesian inference of phylogeny，BI)和最大似然法(maximum likelihood method，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用PhyloSuit v1.2.2軟件選擇最適模型[9]，構(gòu)建BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行5 000次Bootstrap重抽樣分析)。

表2 構(gòu)建林蛙屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的相關(guān)序列

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述

Ylussy0040標(biāo)本吻端鈍尖、突出于下唇，吻棱明顯，頰部稍向外傾斜有一淺凹陷，瞳孔呈橢圓形，背側(cè)褶較寬厚而平直，在顳部上方不彎曲，從眼后直達(dá)胯部；體側(cè)棕紅色，散布不規(guī)則的小黑點(diǎn)，四肢背面有粗細(xì)不一的黑色橫紋；背側(cè)褶色淺，其上的橘紅色小點(diǎn)明顯，背側(cè)褶間有隱約可見(jiàn)的不規(guī)則斑紋(圖1A)；皮膚較平滑，有分散的圓疣，體背為紅棕色，并散有橘紅色小點(diǎn)(圖1B)；手、趾指細(xì)長(zhǎng)，上、下唇緣有灰黑色斑點(diǎn)，腹面光滑，呈乳黃色或乳白色，近胯部及股腹面為橘紅色(圖1C)。經(jīng)形態(tài)學(xué)比較，采集于廣西隆林的林蛙標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙在形態(tài)特征上相符合。

圖1 標(biāo)本Ylussy0040的形態(tài)特征

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

標(biāo)本Ylussy0040的12S rRNA和16S rRNA基因片段經(jīng)過(guò)比對(duì)拼接后，得到的有效序列長(zhǎng)度為1 761 bp(12S rRNA長(zhǎng)度為731 bp，16S rRNA為1 030 bp)，基因序列上傳到GenBank，登錄號(hào)為OL583993(12S rRNA)和OL444874(16S rRNA)。

基于BI和ML構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示出相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。BI發(fā)育樹(shù)顯示，采自隆林的林蛙標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本(四川昭覺(jué))聚為一支，且具有較高的支持率(100.0%)(圖2)；ML發(fā)育樹(shù)顯示，采自隆林的林蛙標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本相聚后構(gòu)成單系，且具有較高的支持率(99.0%)(圖3)?；贙imura雙參數(shù)模型估算的遺傳距離表明，標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本之間的遺傳距離為0.4%，除標(biāo)本Ylussy0040外，其他物種之間的遺傳距離為1.0%～21.8%，Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本的遺傳距離遠(yuǎn)小于林蛙屬其他物種(表3)。

圖2 基于12S rRNA和16S rRNA基因序列構(gòu)建的林蛙屬部分物種貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 基于12S rRNA和16S rRNA基因序列構(gòu)建的林蛙屬部分物種最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表3 基于12S rRNA基因和16S rRNA基因計(jì)算林蛙屬部分物種的遺傳距離

經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合BI發(fā)育樹(shù)、ML發(fā)育樹(shù)和遺傳距離結(jié)果，確定采集于廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的標(biāo)本Ylussy0040為昭覺(jué)林蛙，明確了昭覺(jué)林蛙在廣西的分布。

2.3 生境描述

廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)西部，云貴高原邊緣，在氣候帶上處于南亞熱帶。標(biāo)本Ylussy0040采集于海拔1 359 m的郁閉度較高的山地常綠闊葉林林緣(圖4)，位于保護(hù)區(qū)的核心區(qū)，周?chē)脖幻ⅲ酁槌＞G闊葉林，采集點(diǎn)附近分布的兩棲類(lèi)動(dòng)物有飾紋姬蛙(Microhylafissipes)、澤陸蛙(Fejervaryamultistriata)和鋸?fù)仍笜?shù)蛙(Kurixalusodontotarsus)等。

圖4 廣西昭覺(jué)林蛙的發(fā)現(xiàn)地

3 討論

廣西地處云貴高原的東南邊緣，跨中亞熱帶、南亞熱帶和北亞熱帶3個(gè)氣候區(qū)，氣候溫暖濕潤(rùn)，降雨量豐沛，地形地貌復(fù)雜，植被種類(lèi)多樣，孕育了豐富多樣的兩棲動(dòng)物，其中林蛙屬物種分布廣泛，由于大多數(shù)物種形態(tài)較為相似，導(dǎo)致在野外很難鑒定[2]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，形態(tài)比較結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)分析方法對(duì)物種進(jìn)行鑒定已被廣泛應(yīng)用[10-15]。

昭覺(jué)林蛙的體色隨生境不同而改變，生活于林地的體色呈深棕色或棕黑色，生活于水邊的體色為淺棕色，生活于深草中的為黑褐色[16]。標(biāo)本Ylussy0040與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本相比，在形態(tài)上一致，與廣西的4種林蛙屬物種(徂徠林蛙、寒露林蛙、越南趾溝蛙和貓兒山林蛙)相比，標(biāo)本Ylussy0040體背為紅棕色，并散有橘紅色小點(diǎn)，區(qū)別于徂徠林蛙(體背多為紅褐色或棕灰色而無(wú)深色斑)和貓兒山林蛙(體背面多為紅褐色或褐色，具有黑褐色條形斑或點(diǎn)狀斑)，標(biāo)本Ylussy0040左右跟部重疊較多，區(qū)別于徂徠林蛙(左右跟部重疊)、寒露林蛙(左右跟部明顯重疊)和貓兒山林蛙(左右跟部?jī)H相遇)，標(biāo)本Ylussy0040頰部有一淺凹陷，區(qū)別于越南趾溝蛙頰部凹陷。

昭覺(jué)林蛙主要分布于四川西南部、云南和貴州西部[2]，標(biāo)本Ylussy0040的采集地在廣西百色市隆林縣的廣西金鐘山黑頸長(zhǎng)尾雉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)。隆林縣位于云貴高原的邊緣，與云南和貴州的昭覺(jué)林蛙分布點(diǎn)很近，從地理位置上看，昭覺(jué)林蛙在隆林縣分布具有很大的可能性。另外，該標(biāo)本的采集地為海拔1 359 m的郁閉度較高的山地常綠闊葉林林緣，周?chē)脖幻?，環(huán)境潮濕，與昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本的生境非常相似。

不同地理分區(qū)的同一物種會(huì)產(chǎn)生一定的遺傳分化，物種間遺傳距離越小，親緣關(guān)系就越近。本研究從GenBank下載包含12S rRNA和16S rRNA的林蛙屬和蛙科部分相近物種的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，計(jì)算遺傳距離，發(fā)現(xiàn)Ylussy0040與鎮(zhèn)海林蛙(Ranazhenhaiensis)、大別山林蛙(R.dabieshanensis)、峨眉林蛙(R.omeimontis)、長(zhǎng)肢林蛙(R.longicrus)、寒露林蛙和越南趾溝蛙的遺傳距離分別為3.8%、3.8%、3.9%、4.4%、4.7%和7.4%，和昭覺(jué)林蛙模式標(biāo)本的遺傳距離僅為0.4%，遠(yuǎn)小于其他林蛙屬物種的遺傳距離，且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與昭覺(jué)林蛙形成單系。因此，結(jié)合分子生物學(xué)分析和形態(tài)學(xué)比較，鑒定標(biāo)本Ylussy0040為昭覺(jué)林蛙，為昭覺(jué)林蛙在廣西分布提供了新證據(jù)，也豐富了昭覺(jué)林蛙的分布信息。