無花果活性內生細菌的分離鑒定及生長條件優(yōu)化

李中源 曾忠秀 李夢霜 姜夢柯 楊林美 杜 欣 李淑英

（玉溪師范學院化學生物與環(huán)境學院，云南玉溪 653100）

無花果（Ficus carica Linn.）又名奶漿果、映日果、蜜果等，為?？崎艑俾淙~灌木或小喬木，現(xiàn)全國各地均有栽培，新疆南部尤多[1]。無花果具有極高的經(jīng)濟價值和食用價值，可作食用，亦可作藥用[2-3]。植物內生菌因具有作為新型抗菌藥物篩選源的巨大潛力而備受關注，關于內生菌的研究也成為近年來的熱點。內生細菌在與宿主長期協(xié)同進化的過程中，逐漸形成了對抗、互惠等多種關系，能夠直接或間接調節(jié)宿主的生長發(fā)育、協(xié)助宿主抵抗病蟲害及環(huán)境脅迫等。內生細菌在與宿主互作的過程中能夠產(chǎn)生豐富多樣的次級代謝產(chǎn)物，逐漸成為新型天然產(chǎn)物開發(fā)研究的資源庫。近年來，內生細菌及其次級代謝產(chǎn)物廣泛應用于新藥研發(fā)、生物防治等領域，展現(xiàn)出巨大的研究與開發(fā)價值[4-5]。

本試驗從無花果汁中分離出內生細菌19株，用金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus vulgaris）采用平板對峙法篩選到4株活性內生細菌，活性檢測后選擇活性最強的2株觀察其形態(tài)，研究生長條件及Cr6+對其生長的影響，以期為無花果活性內生細菌的深入開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為無花果（Ficus carica Linn.），于超市購買。

供試菌種為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），于湖北省工業(yè)微生物菌種保藏與研究中心購買；大腸桿菌（Escherichia coli）和變形桿菌（Proteus vulgaris），為我校微生物實驗室保存。

供試培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉10g，甘露醇10g，蒸餾水1000mL，pH值7.0～7.5。2種培養(yǎng)基均于121℃條件下滅菌30 min備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 無花果內生細菌的分離及純化。取新鮮無花果用無菌水沖洗后用75%乙醇浸泡2 min，然后用無菌水沖洗3次，再用3%NaClO浸泡3 min，之后用無菌水沖洗3次。沖洗消毒后的無花果用無菌刀切為小塊后轉入研缽，加100 mL無菌水與滅菌石英砂充分研磨。取0.5 mL菌液加入有4.5 mL無菌水的試管中，稀釋10倍，吹打均勻。同樣方法制成稀釋1 000倍的菌懸液，靜置15 min。取這兩種菌懸液的上清液各0.5 mL涂布LB平板，每個濃度涂3個LB平板，35℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，挑選生長良好的單菌落純化2～3次保存于4℃冰箱備用。同時，將最后一遍沖洗無花果的無菌水涂布于LB培養(yǎng)基上作對照，35℃培養(yǎng)24～48 h。

1.2.2 無花果活性內生細菌的篩選。用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌和分離純化得到的內生細菌于LB固體培養(yǎng)基平板上劃線（平板對峙法），于35℃下培養(yǎng)24～48 h后觀察抑菌線，篩選出活性內生細菌。

1.2.3 活性內生細菌細胞DAN提取、PCR擴增及測序。采用改良的CTAB法[6-7]提取DNA，經(jīng)電泳檢測后進行PCR擴增。

（1）PCR 擴增。 采用 30 μL 體系：提取所得 DNA 1 μL、前引物和后引物各 1 μL（細菌通用引物：前引物 27F5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和后引物1525R5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、Taq 酶5.5 μL（Ex Taq 0.1 μL、10×Ex Taq Buffer 3 μL、dNTP mixture 2.4 μL）。

擴增程序：94℃預變性 4 min，94℃變性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，33個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

（2）堿基序列測序。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海捷瑞生物工程有限公司進行堿基測序，將測序得到的16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比較。

1.2.4 活性內生細菌革蘭氏染色及芽孢染色。革蘭氏染色及芽孢染色參照文獻[8]進行?；钚詢壬毦囵B(yǎng)至24 h進行革蘭氏染色；培養(yǎng)至16 h開始進行芽孢染色[9]，時間間隔為2 h，培養(yǎng)至24 h后每隔0.5 h進行一次芽孢染色，最初出現(xiàn)芽孢的時間即為產(chǎn)芽孢時間。

1.2.5 無花果活性內生細菌活性檢測。采用牛津杯瓊脂擴散法來檢測內生菌抑菌效果，取活化的3株檢測指示菌分別制成菌懸液（5 mL無菌水洗脫3次），分別取0.5 mL傾注法接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)24 h；篩選出的內生細菌分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃恒溫120 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵培養(yǎng)液置于無菌離心管中，在轉速4 000 r/min下離心30 min，得到無細胞上清液；將接種了檢測指示菌的平板等分為3份，用口徑與牛津杯接近的打孔器在培養(yǎng)基上打孔后放入無菌牛津杯中，加無細胞上清液20 μL于牛津杯中，37℃培養(yǎng)48 h后測量其抑菌圈大小。

1.2.6 無花果活性內生細菌生長條件優(yōu)化。將2株有活性的無花果內生細菌斜面轉接2～3次，35℃下培養(yǎng)24 h備用；用5 mL無菌水洗脫斜面，重復3次，轉入無菌試管中備用。活化菌種及制備菌懸液后測定培養(yǎng)時間、初始pH值、溫度和重金屬離子（Cr6+）對活性內生細菌生長的影響。

（1）培養(yǎng)時間對2株活性內生細菌生長的影響。取LB液體培養(yǎng)基100 mL，加入1 mL菌懸液，每株活性內生細菌設3個平行，置于35℃、轉速120 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)，選用光電比濁法[8]制作細菌生長曲線。培養(yǎng)過程（96 h）中每隔12 h取樣1次，于可見分光光度計600 nm下測其吸光度，繪制2株活性內生細菌的生長曲線。

（2）初始pH值對2株活性內生細菌生長的影響。將LB液體培養(yǎng)基pH值分別調節(jié)為5、6、7、8，每種pH值分別接入不同菌株活性內生細菌，100 mL培養(yǎng)基接入1 mL菌懸液，不同菌株各pH值均設3個平行，置于35℃、轉速120 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，于可見分光光度計600 nm下測其吸光度。

（3）溫度對2株活性內生細菌生長的影響。取LB液體培養(yǎng)基，分別加入不同菌株菌懸液，100 mL培養(yǎng)基加 1 mL菌懸液，分別置于 16、30、37、45℃，轉速120 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，不同菌株同一溫度下各設3個平行，于可見分光光度計600 nm下測其吸光度。

（4）重金屬離子（Cr6+）對2株活性內生細菌生長的影響。取LB液體培養(yǎng)基配成Cr6+濃度分別為5、10、20、40、60、80 mg/L 的培養(yǎng)基，100 mL 培養(yǎng)基接入1 mL菌懸液，不同菌株同一Cr6+濃度各設3個平行，置于35℃、轉速120 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，于可見分光光度計600 nm下測其吸光度。

2 結果與分析

2.1 無花果活性內生細菌篩選結果及其形態(tài)學特征

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、濕潤度等特征從無花果汁中分離得到19株內生細菌，經(jīng)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變形桿菌篩選后得到2株活性內生細菌，編號分別為3251、3252。其中：3251單菌落為圓形，表面潤滑，菌落隆起，呈乳白色不透明狀；3252單菌落為圓形，表面潤滑，菌落隆起，呈淡黃色不透明狀。二者均為典型的細菌菌落特征。革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，2株內生菌均為革蘭氏陽性菌，桿狀。

2.2 無花果活性內生細菌16S rDNA序列測定及同源性比對結果

2株無花果活性內生細菌的16S rDNA序列片段大小均為1 500 bp左右（圖1），獲得序列號分別為KJ499776和KJ499777，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，二者均為芽孢桿菌屬細菌，16S rDNA同源性比對結果如表1所示。經(jīng)過生理生化特征試驗，依據(jù)芽孢桿菌命名規(guī)則，分別命名為Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252。

表1 16S rDNA同源性比對結果

2.3 無花果活性內生細菌芽孢染色結果

芽孢染色發(fā)現(xiàn)，Bacillus WHG3251芽孢形成時間為25 h，Bacillus WHG3252芽孢形成時間為26 h。譚麗雪等[9]研究發(fā)現(xiàn)，1株簡單芽孢桿菌芽孢形成時間為16 h，1株枯草芽孢桿菌芽孢形成時間為43 h。很多因素都會影響芽孢形成，比如營養(yǎng)缺乏、高濃度礦物元素、高細胞密度和輻射等都可引發(fā)營養(yǎng)體細胞的分化并形成芽孢。對特定的微生物而言，需要探索其合適的條件控制其芽孢的形成。本試驗2株來自無花果汁的芽孢桿菌產(chǎn)芽孢時間有一定差異，具體機制還需要進一步深入研究。

2.4 無花果活性內生細菌活性成分檢測結果

由表2可知，從無花果汁中分離篩選到的2株內生細菌經(jīng)過48 h發(fā)酵培養(yǎng)后都能產(chǎn)生活性物質，確定2株芽孢桿菌是有活性的內生細菌。根據(jù)抑菌圈直徑大小，Bacillus WHG3251對3株檢測菌種的抑菌效果明顯強于Bacillus WHG3252。說明無花果汁內存在可產(chǎn)生豐富多樣的次級代謝產(chǎn)物的活性內生細菌，可考慮作為新型天然產(chǎn)物開發(fā)研究的菌種來源，為新藥研發(fā)提供依據(jù)，本試驗篩選到的Bacillus WHG3251更具有藥物開發(fā)價值。

表2 無花果活性菌株發(fā)酵液活性成分抑菌效果 單位：cm

2.5 培養(yǎng)條件對無花果活性內生細菌生長的影響

2.5.1 培養(yǎng)時間對2株活性內生細菌生長曲線的影響。如圖2所示，2株無花果活性內生細菌在LB培養(yǎng)基中的生長周期較長，并且生長變化有一定差異。其中：Bacillus WHG3251在0～60 h生長緩慢，表現(xiàn)為生長環(huán)境適應調整期，60 h后增長迅速，96 h時生長達到較高水平；Bacillus WHG3252對生長環(huán)境的適應時間相對較長、衰亡時間較早，72 h后生長迅速，84 h時達到生長最高水平，96 h時已經(jīng)進入衰亡狀態(tài)。細菌生長與細菌類型有關[10-11]，同時受生長環(huán)境的影響。盡管細菌生長曲線沒有明顯的衰亡期，但這并不影響生長曲線的趨勢以及對菌株對數(shù)期和穩(wěn)定期的判斷[12]。

2.5.2 pH值對2株活性內生細菌生長的影響。培養(yǎng)基初始pH值是影響細菌生長及細菌群落結構的重要因素，不同細菌適宜初始pH值有差異。研究發(fā)現(xiàn)，大部分植物內生細菌生長最適pH值為7.0[13-14]。陳正培等[15]從百香果果漿中分離得到的3株內生細菌最適pH值均為5.5，認為與它們的存在環(huán)境有關。由圖3可知：初始pH值分別為7和6時，Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252這2株無花果內生細菌菌液吸光度最高，生長最旺盛；而pH值為8時，2株內生細菌生長受到明顯影響。說明Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252這2株內生細菌對堿性環(huán)境比較敏感，弱酸條件也不利于其生長，初始pH值分別以7和6最利于其生長。

2.5.3 培養(yǎng)溫度對2株活性內生細菌生長的影響。溫度對細菌生長影響顯著，培養(yǎng)溫度通過影響細胞內酶活力和細胞膜的通透性進而影響細菌的生長繁殖。由圖4可知：Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252這2株無花果內生細菌在30℃時生長較好，說明2株活性內生細菌屬于中溫型細菌；隨著培養(yǎng)溫度升高（37℃和45℃），2株無花果內生細菌的生長受到一定影響，溫度越高影響程度越大；低溫（16℃）條件下，無花果內生細菌生長較緩慢。

2.5.4 重金屬離子（Cr6+）對2株活性內生細菌生長的影響。微生物能吸收和轉化重金屬及其化合物，但是當環(huán)境中重金屬濃度增加到一定程度時，就會抑制微生物的生長代謝作用甚至引起微生物死亡[16]。研究者一般認為，微生物抗金屬的機制主要有生物吸附、胞外沉淀、生物轉化、生物累積和外排作用[17]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多微生物對金屬鉻尤其對六價鉻有抗性，其中有些微生物可以把鉻從高毒的六價還原成低毒的三價，具有巨大的應用潛力[18]。由圖5可以看出：培養(yǎng)基Cr6+濃度為10 mg/L時，對Bacillus WHG3251、Bacillus WHG3252的生長有促進作用，且對Bacillus WHG3252的促進作用較明顯；當Cr6+濃度超過20 mg/L時，對2株無花果內生細菌的生長都有抑制作用，高濃度Cr6+條件下2株無花果活性內生細菌有微弱生長。重金屬促進微生物生長的能力稱為毒物興奮效應[19]。鉻誘導可使SOD等含量顯著增加，提高活性內生細菌抗氧化能力，降低鉻脅迫導致的活性氧傷害[20]，因而一定濃度的重金屬離子處理會表現(xiàn)出對活性內生細菌的生長有促進作用。

3 結論與討論

本試驗從無花果汁中篩選到2株活性內生細菌，通過提取DNA和PCR擴增后堿基測序、NCBI數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)2株活性內生細菌均為芽孢桿菌屬細菌；經(jīng)生理生化驗證后，將2株活性內生細菌分別命名為Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252；芽孢染色后發(fā)現(xiàn)，Bacillus WHG3251芽孢形成時間為25 h，Bacillus WHG3252芽孢形成時間為 26 h；革蘭氏染色結果表明，2株活性內生細菌均為革蘭氏陽性菌，桿狀；發(fā)酵培養(yǎng)后，2株無花果活性內生細菌均有活性物質產(chǎn)生，可作為新藥物開發(fā)研究的資源庫，其中Bacillus WHG3251產(chǎn)生的活性物質的抑菌效果強于Bacillus WHG3252。對2株無花果活性內生細菌進行生長條件優(yōu)化研究發(fā)現(xiàn)：2株活性內生細菌生長時間有一定差異，Bacillus WHG3251在96 h時生長達到較高水平，Bacillus WHG3252在84h達到最高水平、96 h時已經(jīng)進入衰亡期；Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252這2株活性內生細菌生長最適pH值分別為7和6；2株活性內生細菌均為中溫菌，最適生長溫度為30℃；重金屬離子（Cr6+）對2株活性內生細菌生長的影響較明顯，Cr6+濃度為10 mg/L時對其生長表現(xiàn)出較強的促進作用，Cr6+濃度大于20 mg/L時表現(xiàn)為抑制作用。