程成鵬，賀稚非,2，唐春，李芳，廖林，李洪軍,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715) 3(四川高金實業(yè)集團股份有限公司，四川 遂寧，629000)

豬大腸又叫豬臟、肥腸、葫蘆頭，是豬的內(nèi)臟器官，包括盲腸、結(jié)腸和直腸，管壁分為黏膜層、黏膜下層、肌肉層、漿膜層，是我國飲食體系中常見的食材。同時豬大腸在中醫(yī)體系中還有潤燥、補虛、止渴止血等醫(yī)療養(yǎng)生價值[1]。但豬大腸存在口感堅韌，久煮不爛的缺點。

嫩度是影響肉感官的重要因素之一[2-3]，其在消費者的購買決策中，尤其是重復性購買中起著重大的作用。嫩度受到一系列生物和環(huán)境因素的影響，例如肌肉組成、脂肪含量、畜種和品種、鈣蛋白酶及鈣蛋白酶抑制蛋白、宰前和宰后的處理等[4]。目前物理嫩化方法主要有沖擊波法、超高壓法、滾揉法等。滾揉嫩化是通過機械作用對肉進行翻滾、摔打從而使肉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)松軟柔嫩，但這種方法存在交叉污染的風險[5]。超高壓技術(shù)是通過高壓破壞肌漿網(wǎng)膜和溶酶體膜，激活鈣蛋白酶，增加胞漿內(nèi)組織蛋白酶數(shù)量，從而降解肌原纖維蛋白，肉品得到嫩化，但該方法可能對肉品的色澤、持水力和風味造成一定的負面影響[6]。沖擊波是指在幾分之一毫秒產(chǎn)生的高達1 GPa的壓力波，具有低成本、效率高的優(yōu)點，該技術(shù)最先應用于牛肉的嫩化，但其對產(chǎn)品包裝要求較高，商業(yè)化推廣具有一定的局限性[7]。化學嫩化方法中常用嫩化劑主要有鹽類、有機酸、磷酸鹽等[8]。這些化學物質(zhì)主要是通過改變蛋白質(zhì)溶解度或影響蛋白酶作用從而提高食品嫩度[8]。生物嫩化方法主要是利用外源蛋白酶消化結(jié)締組織和肌肉蛋白質(zhì)[9]，降低肉的剪切力，從而達到嫩化的效果。目前，木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、獼猴桃蛋白酶的應用較為廣泛，其中木瓜蛋白酶為含疏基肽鏈內(nèi)切酶，穩(wěn)定性高，對蛋白質(zhì)、多肽類、酯類等物質(zhì)有著較強的水解能力[10-11]，可以作用于膠原蛋白和彈性蛋白從而水解肌肉蛋白并增加肉的嫩度[12]。

本研究通過響應面設(shè)計，以NaOH、木瓜蛋白酶為嫩化方法，對豬大腸進行嫩化處理，以得率、蒸煮損失、剪切力和感官評分為評價手段，對比研究化學和生物方法對豬大腸嫩化的最佳條件，填補豬大腸嫩化研究的空白，以期為豬大腸嫩化方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

豬大腸由四川高鑫食品股份有限公司提供，于-18 ℃的環(huán)境下貯藏。

1.2 主要試劑

NaOH，重慶躍翔化工有限公司；NaHCO3(純度≥99%)、CaCl2(純度≥99%)，均為分析純，上海源葉生物科技有限公司，木瓜蛋白酶(5萬U/g)、菠蘿蛋白酶(3萬U/g)，河北萬邦實業(yè)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

FA214A分析天平，上海豪晟科學儀器有限公司；C-LM3B型數(shù)顯式肌肉嫩度儀，北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司；磁力攪拌水浴鍋，常州恩培儀器制造有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 單因素試驗

研究不同NaOH質(zhì)量濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)、時間 (20、25、30、35、40 min)和溫度(25、30、35、40、45 ℃)對豬大腸嫩化效果的影響。研究不同木瓜蛋白酶質(zhì)量濃度(1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 g/L)、時間(70、80、90、100、110 min)和溫度(25、30、35、40、45 ℃)對豬大腸嫩化效果的影響。

1.4.2 樣品嫩化處理

將豬大腸置于4 ℃條件下解凍12 h，去除表面可見脂肪，清洗干凈，將其分為大小均勻,質(zhì)量約3.5 g的肉塊,每10 g豬大腸為1組。之后按照料液比1∶10(g∶mL)放入盛有嫩化劑的燒杯中，在恒溫水浴鍋中進行浸泡處理，一定時間后將豬大腸取出。

1.4.3 制成率測定

先將豬大腸水分濾干，之后用濾紙吸干表面水分，準確稱其質(zhì)量并記錄，制成率計算如公式(1)所示:

(1)

1.4.4 剪切力的測定

參照文獻[13-14]的方法，稍作修改，取適量豬大腸肉按照上述方法嫩化處理后，置于蒸煮袋中在90 ℃條件下進行恒溫水浴加熱，20 min后取出樣品。將處理好的樣品切成1 cm×1 cm×5 cm的長方體，用嫩度儀進行測試,每個樣品測3次取其平均值。

1.4.5 蒸煮損失測定

參考李明奇等[13]的方法稍做修改，將處理后的肉進行稱重，記為m1，然后置于蒸煮袋中，于90 ℃恒溫水浴鍋中蒸煮20 min后取出，用濾紙吸干表面水分并稱重，記為m2，每個樣品需平行測定3次。蒸煮損失計算如公式(2)所示：

(2)

1.4.6 感官評定

參考SALLAM[15]的方法略作修改，經(jīng)過感官評定實驗培訓，選擇10名(5男5女)食品科學學院研究生組成感官評價小組，按照感官評定實驗要求，對嫩化后的豬大腸色澤、咀嚼性、氣味、硬度和風味進行感官評定，感官評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards

1.4.7 響應面設(shè)計

以NaOH質(zhì)量濃度、時間和溫度為自變量進行單因素試驗，感官評分為響應值，用Design-Expert 8.0.6.1進行響應面試驗設(shè)計。試驗各因素水平見表2。

表2 感官評分響應面優(yōu)化的因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface optimization on sensory score

以木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)、時間和溫度為自變量進行單因素試驗，以剪切力為響應值，用Design-Expert 8.0.6.1進行響應面試驗設(shè)計。試驗各因素水平見表3。

表3 剪切力響應面優(yōu)化的因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface optimization on shear force

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行響應面分析, 單因素方差分析采用SPSS Statistics 19.0軟件進行處理，采用Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫩化劑對豬大腸嫩化效果對比

由圖1可知，NaHCO3、菠蘿蛋白酶對豬大腸剪切力影響比NaOH和木瓜蛋白酶小，CaCl2使豬大腸剪切力增加。NaOH、木瓜蛋白酶能夠明顯降低剪切力，其中NaOH降低豬大腸剪切力效果最好，但蒸煮損失比木瓜蛋白酶大?？赡苁且驗樨i大腸在堿液中表面膜和結(jié)締組織被部分破壞，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。木瓜蛋白酶水解膠原蛋白和彈性蛋白從而增加豬大腸的嫩度[8]。因此，綜合考慮選擇NaOH和木瓜蛋白酶這2種嫩化劑進行工藝優(yōu)化。

圖1 不同嫩化劑對豬大腸的嫩化效果對比結(jié)果Fig.1 Comparison of tenderizing effect of different tenderizing agents on pig large intestine

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 NaOH質(zhì)量濃度對豬大腸品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著NaOH質(zhì)量濃度的增加，得率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，當NaOH質(zhì)量濃度達到1 g/L時，得率達到最大，此時豬大腸吸水最多。NaOH質(zhì)量濃度在0.5～2 g/L時，蒸煮損失顯著下降。當達到2 g/L時，蒸煮損失達到最小。NaOH質(zhì)量濃度在0.5～1 g/L時，剪切力顯著下降，而感官評分顯著增加，達到最大值。之后隨著濃度的增加，剪切力和感官評分都有下降，但不顯著。這可能是因為適當濃度的堿液能夠使蛋白質(zhì)溶解暴露親水基團，從而提高吸水性和降低剪切力。當堿的濃度過大，會破壞豬大腸結(jié)構(gòu)，吸水過多，從而降低口感[16]。

a-得率和蒸煮損失；b-剪切力和感官評分圖2 NaOH質(zhì)量濃度對豬大腸品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the quality of pig large intestine

2.2.2 NaOH處理時間對豬大腸品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著處理時間的增加，得率和蒸煮損失都呈上升趨勢，說明處理時間對得率和蒸煮損失都存在顯著影響。剪切力和感官評分在20～25 min時分別呈顯著下降和上升的趨勢，并且感官評分在25 min時達到最大值，之后逐漸下降。說明在25 min時，豬大腸嫩度較好，感官品質(zhì)最佳。當時間為35 min時，剪切力顯著下降，此時感官評分較低。說明此時豬大腸內(nèi)部結(jié)構(gòu)已經(jīng)遭到破壞，咀嚼性差。

a-得率和蒸煮損失；b-剪切力和感官評分圖3 NaOH處理時間對豬大腸品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of NaOH treatment time on the quality of pig large intestine

2.2.3 NaOH處理溫度對豬大腸品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著溫度的增加，得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當溫度40 ℃時達到最大值，吸水最多。蒸煮損失在35～40 ℃時，顯著下降，說明此時豬大腸持水性較好。剪切力隨著溫度升高呈現(xiàn)一個先下降后上升的趨勢。當溫度為40 ℃時，達到最低值。感官評分隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢。當溫度達到40 ℃時，感官評分最高。說明溫度為40 ℃時，豬大腸品質(zhì)最佳。

a-得率和蒸煮損失；b-剪切力和感官評分圖4 NaOH處理溫度對豬大腸品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of NaOH treatment temperature on pig large intestine quality

2.2.4 木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)、處理時間和溫度對蒸煮損失和剪切力影響

由圖5-a可知，隨著木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)的增加蒸煮損失和剪切力都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。質(zhì)量分數(shù)達到2%時剪切力達到最小值。木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)處于2%～2.2%時蒸煮損失處于最小值且變化不大。根據(jù)前人研究，木瓜蛋白酶是一種低特異性巰基酶，它能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分子內(nèi)部的肽鏈—CO—NH—分解成多肽和氨基酸[17]。在適宜條件下，可以提高保水性，獲得更好的口感。當木瓜蛋白酶添加過量時，剪切力和蒸煮損失都上升。這是因為木瓜蛋白酶過量使用會導致蛋白水解過度，保水性和感官品質(zhì)下降[18]。如圖5-b所示，隨著酶處理的時間增加，蒸煮損失和剪切力都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，并且都在100 min時達到最小值。豬大腸嫩化是一定程度的水解，當木瓜蛋白酶處理時間適宜，可以有效降低豬大腸剪切力，提高嫩度。當處理時間超過100 min，豬大腸過度水解，失水老化，嫩度降低[8]。木瓜蛋白酶有最適的反應溫度，如圖5-c所示，當溫度處于25～35 ℃時，豬大腸的剪切力隨著溫度的升高而逐漸降低，木瓜蛋白酶嫩化效果十分明顯；當嫩化溫度大于35 ℃時，豬大腸的剪切力反而增加。因此，木瓜蛋白酶處理豬大腸最佳溫度為35 ℃，在此溫度條件下，豬大腸的嫩化和保水效果較好。

a-木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)；b-木瓜蛋白酶處理時間；c-木瓜蛋白酶溫度圖5 木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)、處理時間和溫度對蒸煮損失和剪切力影響Fig.5 Effects of papain mass fraction, treatment time and temperature on cooking loss and shear force

2.3 響應面法優(yōu)化豬大腸的嫩化工藝

2.3.1 響應面分析因素和水平選擇

響應面優(yōu)化豬大腸嫩化工藝試驗結(jié)果見表4和表5。

表4 感官評分Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 The design matrix and result of Box-Behnken experiments (sensory score)

表5 剪切力Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 The design matrix and result of Box-Behnken experiments (shear force)

運用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對表中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到堿處理后感官評分(Y1) 與3個嫩化因子A、B、C的關(guān)系如公式(3)所示:

Y1=7.68+0.45A-0.20B+0.25C+0.25AB-0.95AC-0.95BC-0.86A2-0.86B2-0.96C2

(3)

式中：Y1，感官評分；A，NaOH質(zhì)量濃度；B，堿處理時間；C，堿處理溫度。

得到木瓜蛋白酶處理后剪切力(Y2)與3個嫩化因子A、B、C的關(guān)系如公式(4)所示：

Y2=11.74-0.13A-0.15B-0.23C+0.022AB-0.16AC-0.030BC+2.03A2+0.29B2+0.71C2

(4)

式中：Y2，剪切力；A，木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)；B，時間；C，溫度。

回歸方程中每項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各個因素對響應值的影響程度，系數(shù)的正負則反映了影響的方向。

2.3.2 多元回歸模型分析

表6 感官評分多元回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance and multiple regression model on sensory scores

表7 剪切力多元回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance and multiple regression model (shear force)

2.3.3 響應面模型中各因素的交互效應分析

應用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行響應面分析，各因素對響應值的影響可以用等高線和響應曲面來表示，結(jié)果如圖6與圖7所示。

圖6顯示了不同NaOH質(zhì)量濃度(A)、時間(B)、溫度(C)對豬大腸感官評分的影響，響應面圖為曲面，說明3個因素之間有一定的交互作用，其中AC、BC之間存在極顯著交互作用(P<0.001)，AB之間存在高度顯著作用(P<0.01)。由圖6-a可知，當嫩化時間為24 min左右，NaOH質(zhì)量濃度為1.1 g/L左右時，豬大腸的感官評分最高，兩因素對比，NaOH質(zhì)量濃度對感官評分影響較大。在適宜NaOH濃度范圍內(nèi)，豬大腸的脂蛋白分解率會隨著NaOH質(zhì)量濃度提高而增加，擴散到豬大腸內(nèi)部的水分增加，從而增加制成率、增加嫩度。但NaOH質(zhì)量濃度過高，會使豬大腸吸水過多，豬大腸的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而保水性、感官品質(zhì)變差[19]。由圖6-b可知，當嫩化溫度在41 ℃左右，NaOH質(zhì)量濃度為1.1 g/L左右時，豬大腸的感官評分最高，且響應曲面的等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說明二者之間有顯著交互作用。這可能是因為適當濃度的堿液和溫度能夠使蛋白質(zhì)溶解暴露親水基團，提高吸水性和降低剪切力[18, 20-21]。由圖6-c可知，當嫩化溫度為41 ℃左右，嫩化時間為24 min左右時，豬大腸的感官評分最高。

a-NaOH處理時間和質(zhì)量濃度；b-NaOH處理溫度和質(zhì)量濃度；c-NaOH處理溫度和處理時間圖6 各因素的交互效應對感官評分的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on sensory score

a-木瓜蛋白酶處理時間和溫度；b-木瓜蛋白酶處理時間和酶用量；c-木瓜蛋白酶處理溫度和酶用量圖7 各因素的交互效應對剪切力的影響Fig.7 Effect of interaction of various factors on shear force

圖7顯示了不同木瓜蛋白酶質(zhì)量(A)、時間(B)、溫度(C)對豬大腸感官品分的影響，響應面圖為曲面，說明3個因素之間有一定的交互作用，其中AC之間存在顯著交互作用(P<0.05)。由圖7-a可知，當嫩化時間為102 min左右，嫩化溫度為36 ℃左右時，豬大腸的剪切力最低。肌內(nèi)結(jié)締組織的變化對肉的嫩度影響較大，其中肌束膜和肌內(nèi)膜中的膠原蛋白起關(guān)鍵作用[22]。隨著溫度升高到適宜范圍，膠原蛋白適當變性，豬大腸的剪切力降低。由圖7-b可知，當嫩化時間為102 min左右，酶用量為2.0%左右時，豬大腸的剪切力最高，由圖7-c可知，當嫩化溫度為36 ℃左右，酶用量為2.0%左右時，豬大腸的剪切力最高。

2.4 驗證試驗結(jié)果

結(jié)合回歸模型和響應曲面圖，得到2種嫩化劑嫩化豬大腸的感官評分和剪切力最佳工藝條件是:以NaOH為嫩化劑時最佳參數(shù)組合為NaOH質(zhì)量濃度為1.08 g/L，時間為24.2 min，溫度為40.63 ℃，此時豬大腸的感官評分為7.750。以木瓜蛋白酶為嫩化劑時最佳參數(shù)組合為木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)為2.01%，時間為101.69 min，溫度為36.32 ℃，此時豬大腸的剪切力為11.695 N。

為進一步驗證響應面優(yōu)化的準確性，根據(jù)實際操作對最優(yōu)條件進行調(diào)整，在NaOH質(zhì)量濃度為1.1 g/L，時間為24 min，溫度為41 ℃的條件下進行3次驗證實驗，得到嫩化后的豬大腸感官評分為7.4，與響應面優(yōu)化的結(jié)果相對誤差為4.73%，響應面優(yōu)化結(jié)果準確可信。在木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)為2.0%，時間為102 min，溫度為36 ℃的條件下進行3次驗證實驗，得到嫩化后的豬大腸剪切力為12.36 N，與響應面優(yōu)化的結(jié)果相對誤差為5.38%，響應面優(yōu)化結(jié)果準確可信。

3 結(jié)論

NaOH與木瓜蛋白酶來嫩化豬大腸制品，都可以顯著增加得率，降低剪切力。以NaOH為嫩化劑時最佳參數(shù)組合為NaOH質(zhì)量濃度為1.1 g/L，時間為24 min，溫度為41 ℃，此時豬大腸的感官評分為7.7。以木瓜蛋白酶為嫩化劑時最佳參數(shù)組合為木瓜蛋白酶質(zhì)量分數(shù)為2.0%，時間為102 min，溫度為36 ℃，此時豬大腸的剪切力為11.70 N。說明這2種嫩化劑對豬大腸的嫩化和品質(zhì)改善效果較好,有一定實用價值，可以為豬大腸的精深加工提供參考。