趙冰怡 楊洪芹 潘啟誠 劉 藝 叢 琳 唐嘉雯 李雪竹

1.上海新高姿化妝品有限公司，廣東廣州，510000；2.廣州澳希亞實(shí)業(yè)有限公司，廣東廣州，510000

肌膚呈現(xiàn)平滑光亮、潤澤緊致的狀態(tài)與皮膚的保濕屏障系統(tǒng)密切相關(guān)，皮膚的保濕屏障功能由健康的皮膚角質(zhì)層維護(hù)和支持[1]。皮膚角質(zhì)層是由角質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞間脂質(zhì)組成，通常以“磚墻結(jié)構(gòu)”形容，“磚”為角質(zhì)細(xì)胞，“鋼筋”為連接角質(zhì)細(xì)胞的橋粒，“水泥”為角質(zhì)細(xì)胞間脂質(zhì)[2]。約50%的神經(jīng)酰胺、25%的膽固醇、15%的游離脂肪酸和極少量的磷脂及其他脂質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞間脂質(zhì)[2]，因此神經(jīng)酰胺在保濕系統(tǒng)中起重要作用，是皮膚角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)的重要組成部分，是維持皮膚屏障功能的關(guān)鍵物質(zhì)。干性皮膚往往會有角質(zhì)層含水量降低、經(jīng)皮水分丟失率（trans-epidermal water loss,TEWL）增高等問題，研究表明干性皮膚的神經(jīng)酰胺含量往往明顯低于正常皮膚或是神經(jīng)酰胺的種類發(fā)生變化，外用含神經(jīng)酰胺的保濕劑，尤其是含神經(jīng)酰胺3的保濕劑，可以修護(hù)皮膚屏障并改善皮膚干燥癥狀[3]。

1 神經(jīng)酰胺概述

鞘脂類物質(zhì)有3種，包括神經(jīng)酰胺、鞘磷脂和鞘糖脂，結(jié)構(gòu)式見圖1。當(dāng)R為氫時，該物膚角質(zhì)層中神經(jīng)酰胺分為12個亞類。神經(jīng)酰胺有兩種命名系統(tǒng)，方法一是根據(jù)色譜遷移排列次序?yàn)樯窠?jīng)酰胺1～8，以及之后按發(fā)現(xiàn)時間次序命名；方法二則是按分子結(jié)構(gòu)命名，末位字母為鞘氨醇基團(tuán)[4]。在2021版《已使用化妝品原料目錄》中可以使用的神經(jīng)酰胺NP、神經(jīng)酰胺AP、神經(jīng)酰胺EOP分別對應(yīng)神經(jīng)酰胺3、神經(jīng)酰胺6Ⅱ、神經(jīng)酰胺1。

圖1 鞘脂類的結(jié)構(gòu)式

神經(jīng)酰胺有兩條長鏈烴基（LCB中的碳鏈，F(xiàn)A中的碳鏈），具有疏水性。LCB中的2～3個羥基基團(tuán)質(zhì)為神經(jīng)酰胺；當(dāng)R為磷酸膽堿或磷酸乙醇胺時，該物質(zhì)為鞘磷脂（sphingoyelin, SM）；當(dāng)R為葡萄糖或半乳糖等糖類時，該物質(zhì)為鞘糖脂（glycosphingolipid, GL）。神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)中有兩條疏水鏈：一條長鏈氨基醇（long chain base, LCB），又稱鞘氨醇，一條脂肪酸鏈（fatty acid, FA），LCB中的氨基和FA中的羧基通過酰胺鍵連接。神經(jīng)酰胺中的LCB分為神經(jīng)鞘氨醇（sphingosine, S）、二氫鞘氨醇（dihydrosphingosine, DS）、植物鞘氨醇（phytosphingosine, P）和6-OH鞘氨醇（6-hydroxy sphingosine, H），結(jié)構(gòu)式見圖2。FA分為非羥基脂肪酸（nonhydroxyl fatty acid,N）、α-OH脂肪酸（α-hydroxyl fatty acid, A）和ω-OH脂肪酸（ω-hydroxyl fatty acid, EO），結(jié)構(gòu)式見圖3。LCB和FA的兩兩不同結(jié)合，可將皮與FA和LCB結(jié)合部位的酰胺鍵具有親水性，一端親水，一端疏水。這兩種性質(zhì)結(jié)構(gòu)可通過分子間非共價鍵作用力構(gòu)成緊密堆疊的網(wǎng)狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，因而具有良好的保水作用。此外，神經(jīng)酰胺可明顯促進(jìn)絲聚合蛋白（filaggrin, FLG）mRNA和蛋白的表達(dá)水平[5]，絲聚蛋白不僅是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，而且是保濕因子的主要來源，當(dāng)它從顆粒層進(jìn)入角質(zhì)層時，經(jīng)過一系列酶水解轉(zhuǎn)化為多羧酸類物質(zhì)及其他天然保濕因子，包括尿素、吡咯烷酮羧酸鈉、乳酸等，具有保濕功效。含ω-OH的神經(jīng)酰胺能共價結(jié)合于角化細(xì)胞的角化包膜的內(nèi)披蛋白上，借此將脂質(zhì)基質(zhì)和角化細(xì)胞連接起來，增強(qiáng)肌膚的屏障功能，減少外界刺激物進(jìn)入皮膚[6]。神經(jīng)酰胺輔助角質(zhì)層增厚的這種功效可修復(fù)皮膚受損，提升皮膚耐受力，減低皮膚炎癥，減少皮膚敏感發(fā)生[7-8]。另外，有研究顯示較低濃度的神經(jīng)酰胺可刺激成纖維細(xì)胞增殖，抑制金屬蛋白酶的表達(dá)，因此有一定的抗衰老功效[5]。

圖2 鞘氨醇的4種結(jié)構(gòu)式

圖3 脂肪酸的3種結(jié)構(gòu)式

神經(jīng)酰胺為高結(jié)晶性物質(zhì)，應(yīng)用于化妝品存在溶解度低、水分散差、易結(jié)晶析出等問題，制約了在化妝品中的應(yīng)用。目前神經(jīng)酰胺在化妝品的應(yīng)用主要以脂質(zhì)體、微膠囊、乳化復(fù)合體等形式出現(xiàn)。本研究擬評價一種神經(jīng)酰胺復(fù)合物保濕劑（神經(jīng)酰胺NP、神經(jīng)酰胺AP、神經(jīng)酰胺EOP）在長效保濕及修護(hù)改善皮膚屏障功能方面的效果和安全性。

2 實(shí)驗(yàn)材料及方法

2.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)、儀器及原料

皮膚角質(zhì)層水分含量：由皮膚水分含量測試儀（Corneometer? CM825, Courage & Khazaka）測得。數(shù)值越高，表示皮膚角質(zhì)層水合程度越高，表明產(chǎn)品的保濕效果越好。

皮膚經(jīng)表皮失水（TEWL）：由皮膚水分流失測試儀（Tewameter, TM300）測得。皮膚經(jīng)表皮失水率是反映皮膚水分丟失和屏障功能的重要參數(shù)。所測得數(shù)值越低，表示皮膚的屏障功能越好。

SK-Influx，INCI名稱為：水、月桂酰乳酰乳酸鈉、神經(jīng)酰胺NP、神經(jīng)酰胺AP、植物鞘氨醇、膽甾醇、黃原膠、卡波姆、神經(jīng)酰胺EOP、羥苯甲酯、羥苯丙酯，購于贏創(chuàng)特種化學(xué)（上海）有限公司。其余均為常規(guī)試劑和配方原料。

2.2 實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品

試驗(yàn)產(chǎn)品：保濕修護(hù)霜，配方見表1，配置方法按照常規(guī)膏霜制備即可。配方中使用的神經(jīng)酰胺為乳化復(fù)合體，涉及神經(jīng)酰胺NP、神經(jīng)酰胺AP、神經(jīng)酰胺EOP。

表1 保濕修護(hù)霜

空白膏霜：不含神經(jīng)酰胺復(fù)合物，其他配方組成成分與保濕修護(hù)霜一致。

2.3 穩(wěn)定性測試方法

制得樣品分別在45 ℃、5 ℃、-15 ℃冷熱循環(huán)條件下連續(xù)存放3個月觀察樣品是否有變色或其他異常現(xiàn)象；在自然光照射條件下連續(xù)放置3個月，觀察樣品是否有變色或其他異?，F(xiàn)象。

2.4 皮膚角質(zhì)層即時水分含量測試方法

按照受試者篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇12名受試者，選擇受試者左、右手臂內(nèi)側(cè)距離手掌基部5 cm處為試驗(yàn)部位，試驗(yàn)面積為3 cm×3 cm，實(shí)驗(yàn)部位分別涂抹等量的保濕修護(hù)霜1號、保濕修護(hù)霜2號和空白膏霜。試驗(yàn)前，受試者清潔雙臂內(nèi)側(cè)，在溫度（21±1） ℃、相對濕度（50±5）%環(huán)境下靜坐20 min，測試涂抹樣品前各試驗(yàn)部位皮膚水分含量起始值及使用各膏霜樣品后0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h時各試驗(yàn)部位皮膚即時水分含量測試值，取3次測量平均值作為測試值，結(jié)果以角質(zhì)層水分含量表示。由公式（Ⅰ）計(jì)算樣品皮膚水分含量變化率。

2.5 皮膚角質(zhì)層水分含量和皮膚經(jīng)表皮水分流失測試方法

按照受試者篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇12名受試者。選擇受試者左右手臂內(nèi)側(cè)按照隨機(jī)原則分別使用保濕修護(hù)霜1號、2號和空白膏霜。早晚各一次，連續(xù)使用28 d。在使用前、使用后第14天和第28天分別進(jìn)行測試。測試前，受試者用潔凈水清洗測試部位并擦干后暴露測試部位，需要在溫度（21±1） ℃、相對濕度（50±5）%環(huán)境下靜坐20 min。使用CM825皮膚水分測試探頭測定試驗(yàn)部位的角質(zhì)層水分含量，取3次測量平均值作為測試值，計(jì)算14 d和28 d皮膚水分含量變化率，如計(jì)算公式（Ⅰ）。使用TM300皮膚經(jīng)表皮水分流失測試儀測量受試者使用樣品前和使用14 d、28 d后皮膚經(jīng)表皮失水（TEWL），由公式（Ⅱ）計(jì)算樣品經(jīng)表皮水分流失率。

2.6 不良反應(yīng)測試方法

試驗(yàn)過程中，不良反應(yīng)觀測和評價共進(jìn)行了3次，分別是在D0（使用產(chǎn)品前）、D14（使用產(chǎn)品后第14天）和D28（使用產(chǎn)品后第28天）到訪時進(jìn)行。由皮膚科醫(yī)生詢問受試者在使用試驗(yàn)產(chǎn)品過程中是否出現(xiàn)面部皮膚瘙癢、刺痛、灼熱感等癥狀，并觀察記錄面部是否有紅斑、水腫、皮疹等不良反應(yīng)現(xiàn)象。根據(jù)表2的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，得分記入病例報(bào)告表，并根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性評估。

表2 不良反應(yīng)的評分標(biāo)準(zhǔn)

2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用重復(fù)測量方差分析對試驗(yàn)參數(shù)的基線值（D0）和回訪數(shù)值（D14和D28）進(jìn)行差異性分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異采用P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001進(jìn)行標(biāo)注。

3 結(jié)果與討論

3.1 穩(wěn)定性測試結(jié)果

樣品在45 ℃、5 ℃、-15 ℃冷熱循環(huán)條件下連續(xù)放置3個月均未出現(xiàn)分層、析出現(xiàn)象，45 ℃下膏體顏色有輕微變黃。在自然光照條件下連續(xù)放置3個月，無明顯色澤變化，說明樣品的穩(wěn)定性良好。

3.2 皮膚角質(zhì)層即時水分含量測試結(jié)果

使用不同樣品0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h后，皮膚角質(zhì)層即時水分含量增加率如圖4所示。

皮膚角質(zhì)層水分含量對皮膚的各項(xiàng)生理功能有序調(diào)節(jié)有著十分重要的作用。通過測定使用前后皮膚水分含量和皮膚經(jīng)表皮水分流失量可以客觀地評價樣品的補(bǔ)水保濕效果。圖4說明，使用保濕修護(hù)霜1號和保濕修護(hù)霜2號0.5 h和1 h后，涂抹部位的皮膚水分含量增加率明顯高于空白膏霜（P＜0.01或P＜0.001）。使用2 h、4 h、6 h、和8 h后，保濕修護(hù)霜涂抹部位的皮膚含水量仍高于空白膏霜區(qū)域，說明具有良好的即時保濕效果。綜上，說明神經(jīng)酰胺復(fù)合物可以提高皮膚的即時保濕作用。

圖4 即時水分含量增加率

3.3 皮膚14 d和28 d水分含量變化

受試者14 d和28 d皮膚水分含量增加率的測定結(jié)果見圖5。皮膚含水量可直接說明皮膚是否干燥，從而反映樣品是否保濕。從圖5可知，受試者使用14 d后，空白膏霜、保濕修護(hù)霜1號、保濕修護(hù)霜2號涂抹部位的皮膚水分含量分別提高了23.5%、43.6%、59.8%。受試者使用28 d后，3個部位的皮膚水分含量分別提高了37.5%、55.8%、65.7%。保濕修護(hù)霜涂抹部位的皮膚水分含量增加率顯著高于空白膏霜涂抹位置（P＜0.05）。說明神經(jīng)酰胺復(fù)合物可以提高皮膚的保濕作用。

圖5 皮膚水分含量增加率測定結(jié)果

3.4 皮膚14 d和28 d經(jīng)表皮水分流失量變化

皮膚經(jīng)表皮失水（TEWL）是反映皮膚水分丟失和屏障功能的重要參數(shù)。所測數(shù)值越低，表示皮膚的屏障功能越好，是評價化妝品修護(hù)功效的重要指標(biāo)。經(jīng)表皮水分流失減少率越高說明樣品的鎖水能力越強(qiáng)，修護(hù)效果越好。使用樣品后，雙臂內(nèi)側(cè)皮膚經(jīng)表皮失水值和經(jīng)表皮失水率的試驗(yàn)結(jié)果如表3、圖6所示。受試者使用14 d后，空白膏霜、保濕修護(hù)霜1號和保濕修護(hù)霜2號涂抹區(qū)域經(jīng)表皮水分流失分別降低了8.45%、15.51%和26.27%。受試者使用28 d后，空白膏霜、保濕修護(hù)霜1號和保濕修護(hù)霜2號涂抹區(qū)域經(jīng)表皮水分流失分別降低了10.53%、28.51%和38.10%。保濕修護(hù)霜涂抹部位的經(jīng)表皮水分流失減少率顯著高于空白膏霜涂抹區(qū)域（P＜0.05），說明神經(jīng)酰胺復(fù)合物可以提升皮膚的修護(hù)及鎖水能力。

圖6 經(jīng)表皮水分流失減少率測定結(jié)果

表3 手臂內(nèi)側(cè)皮膚經(jīng)表皮失水值 單位：g/hm2

3.5 不良反應(yīng)測試結(jié)果

將空白膏霜、保濕修護(hù)霜1號和保濕修護(hù)霜2號在試驗(yàn)過程中進(jìn)行不良反應(yīng)觀測和評價，受試者均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，提示此次試驗(yàn)中的空白膏霜、保濕修護(hù)霜1號和保濕修護(hù)霜2號具有較高的安全性。

4 討論與總結(jié)

皮膚中神經(jīng)酰胺主要位于表皮，具有保濕鎖水、信號傳導(dǎo)、免疫抗炎等功效。正常的皮膚屏障功能取決于皮膚“磚”和“水泥”的質(zhì)量，神經(jīng)酰胺是“水泥”中的重要成分，約占50%，它與游離的脂肪酸和膽固醇構(gòu)成疏水性的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，維持肌膚屏障穩(wěn)態(tài)。正常皮膚脂質(zhì)成分在角質(zhì)層可形成正交的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。干性皮膚神經(jīng)酰胺的質(zhì)與量均減少，導(dǎo)致細(xì)胞間形成異常的六角形堆積排列，破壞脂質(zhì)層穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，引起皮膚屏障功能受損。故外源性補(bǔ)充神經(jīng)酰胺可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞形成正交排列結(jié)構(gòu)，改變皮膚屏障功能，起到保濕修護(hù)功效。

神經(jīng)酰胺NP是人皮膚角質(zhì)層中含量最多的神經(jīng)酰胺，護(hù)膚品中最常添加。神經(jīng)酰胺EOP是超長鏈的（C＞30）含有ω-OH脂肪酸，這種特殊結(jié)構(gòu)對角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)形成層狀有序排列具有重要意義。神經(jīng)酰胺EOP降低會破壞脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)，使正交結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榱切文z結(jié)構(gòu)，影響皮膚屏障功能，甚至影響角質(zhì)形成細(xì)胞的生長與分化調(diào)節(jié)。神經(jīng)酰胺EOP的量與TEWL呈負(fù)相關(guān)[3]。含有神經(jīng)酰胺EOP和神經(jīng)酰胺NP混合配方的保濕劑在維持皮膚結(jié)構(gòu)和屏障功能中效果更好，一方面是因?yàn)镋OP和NP相鄰神經(jīng)酰胺分子的頭部基團(tuán)形成橫向氫鍵降低皮膚對水的滲透性，另一方面這兩種神經(jīng)酰胺之間存在的范德華力也可以在協(xié)同作用中發(fā)揮潛在作用[3]。另外，神經(jīng)酰胺AP具有補(bǔ)充皮膚天然保濕因子的作用。

本研究利用含有神經(jīng)酰胺AP、神經(jīng)酰胺NP和神經(jīng)酰胺EOP的復(fù)合物，評價其在保濕和修護(hù)方面的功效。研究證實(shí)該神經(jīng)酰胺復(fù)合物能夠改善皮膚水分含水量和經(jīng)表皮水分流失值。表現(xiàn)為使用后1 h內(nèi)，皮膚即時水分含量顯著增加，即時保濕效果可持續(xù)維持8 h。連續(xù)使用14 d后皮膚水分含量增加率顯著高于空白膏霜涂抹位置。使用后從第1天開始與基線相比角質(zhì)層含水量明顯提高且TEWL明顯降低，該效果在連續(xù)使用的28 d里持續(xù)存在。這與一些針對干性皮膚，混合了1、3、6Ⅱ型神經(jīng)酰胺的保濕劑在改善皮膚水分、TEWL、皮膚pH值、皮膚質(zhì)地、皺紋、皮膚紅腫方面效果保持一致。

綜上所述，本試驗(yàn)說明試驗(yàn)產(chǎn)品具有較好的安全性和穩(wěn)定性。皮膚水分含量增加率在回訪時間點(diǎn)顯著提高，皮膚經(jīng)表皮失水值在回訪時間點(diǎn)均顯著性下降，提示在該試驗(yàn)條件下，試驗(yàn)產(chǎn)品所含有的神經(jīng)酰胺復(fù)合物具有保濕鎖水、改善皮膚屏障和修護(hù)的功效。