甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛檢測方法探索及方法優(yōu)化

譚桂莉

（南寧贏創(chuàng)美詩藥業(yè)有限公司，廣西 南寧 530100）

1 概述

原料藥甲硫氨酸的起始物料為 DL-甲硫氨酸，生產(chǎn)工藝為 DL-甲硫氨酸外消旋混合物形式生產(chǎn)甲硫氨酸；DL-甲硫氨酸的生產(chǎn)物料為丙烯醛和甲硫醇，在生產(chǎn)過程中生成中間產(chǎn)物3-甲硫基丙醛［CAS號為3268-49-3，英文名稱為3-（Methylthio）propanal］；中間產(chǎn)物進一步反應(yīng)生成DL-甲硫氨酸；中間產(chǎn)物3-甲硫基丙醛可能未完全反應(yīng)而存在于起始物料DL-甲硫氨酸中，并且隨著甲硫氨酸工藝流轉(zhuǎn)可能進入甲硫氨酸的產(chǎn)品中成為雜質(zhì)，因此需在甲硫氨酸產(chǎn)品中對其殘留含量水平進行評估。

目前，各國藥典中均收載有甲硫氨酸品種，因為甲硫氨酸的工藝有來源于發(fā)酵工藝和DL-甲硫氨酸外消旋混合物化學(xué)拆分工藝，因此在各國藥典收載的控制標(biāo)準(zhǔn)中均未提到對3-甲硫基丙醛的控制；3-甲硫基丙醛可作為食用香精［1］，在軟飲料、冷飲、糖果、焙烤制品、調(diào)味料及肉類中使用，不屬于毒性雜質(zhì)；按照國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）中對Q3A新原料藥中雜質(zhì)的要求［2］：對于每日最大劑量大于2 g的原料藥，原料藥中雜質(zhì)的鑒定閾值為0.05%。甲硫氨酸是氨基酸類別藥品，作為營養(yǎng)類型用藥，最大日劑量可以達到10 g，3-甲硫基丙醛的限度可以設(shè)0.05%的控制限。

從3-甲硫基丙醛的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)及從檢驗原理角度進行分析，氣相色譜儀和高效液相色譜儀檢驗方法都可以滿足對此物質(zhì)的檢驗要求。

2 分析方法開發(fā)

2.1 氣相色譜方法

《食品添加劑 3- 甲硫基丙醛》（GB 28341—2012）［1］中，3-甲硫基丙醛含量采用氣相色譜法測定。色譜柱為毛細(xì)管柱，固定相為 5% 苯基甲基聚硅氧烷，檢測器為氫火焰離子化檢測器（FID）。此方法僅適用于對高濃度3-甲硫基丙醛檢測，不適用于對3-甲硫基丙醛低濃度殘留檢測，檢測方法的靈敏度達不到原料藥中雜質(zhì)的鑒定閾值為0.05%的要求。

借鑒GB 28341—2012中氣相色譜法的色譜條件，因為3-甲硫基丙醛分子中含硫元素，所以檢測器選用火焰光度檢測器（FPD）代替 FID。檢測中的進樣口溫度仍為250 ℃，采用直接進樣法，此溫度下的甲硫氨酸已經(jīng)達到分解狀態(tài)；甲硫氨酸在高溫下可降解生成 3-甲硫基丙醛［3］。因此，直接進樣法不適用于甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛殘留檢測。

為消除高溫降解的影響，將直接進樣法改為頂空法測試［空定量環(huán) 90 ℃ /頂空傳輸管 100 ℃ /GC（氣相色譜儀）進樣口 190 ℃］，測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3-甲硫基丙醛對照液的水溶液為70 ℃，平衡 30 min后的氣相色譜結(jié)果顯示出現(xiàn)了遠(yuǎn)大于3-甲硫基丙醛峰的甲硫醇峰，而 3-甲硫基丙醛原樣瓶上層頂空氣體直接進樣只檢測到極少量的甲硫醇峰。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因為3-甲硫基丙醛峰在水溶液中可分解成甲硫醇?？紤]樣品的溶解度，水是甲硫氨酸供試液理想的溶劑。因此，GC方法不適用于甲硫氨酸產(chǎn)品中對3-甲硫基丙醛的控制。

2.2 高效液相色譜方法

《美國藥典》 42版（USP 42）采用高效液相色譜儀（HPLC）柱前衍生化法測定聚乙二醇3350中甲醛與乙醛的含量［4］，該方法中衍生化反應(yīng)原理如圖1所示；采用2-硝基苯肼衍生后液相色譜法測定3-甲硫基丙醛，理論上可以使用相似的方法測定。

圖1 二硝基苯肼衍生醛類方程式

醛類衍生化后生成醛2，4-二硝基苯腙（醛-DNPH）；故可采用乙腈/水流動相+反相C18 體系，研究測試不同品牌色譜柱、流動相成分比例、流速及柱溫對檢測方法專屬性的影響。

2.2.1 同一類型不同品牌色譜柱對檢測方法專屬性的影響

色譜條件如下。色譜柱：不同品牌的C18柱；流動相∶乙腈∶水 = 不同比例（v/v）；流速：不同；檢測波長：350 nm；進樣體積：20μL；色譜柱溫度：25 ℃；分析時間：50 min；樣品盤溫度：10 ℃。

在流動相為乙腈∶水=50∶50（v/v）的條件下，不同品牌的C18柱（規(guī)格為4.6 mm×250 mm，5μm），相同長度粒徑、碳載量及系孔徑，因不同的比表面積，柱行為也有所不同。CAPCAELL PAK C18：比表面積為 260 m2/g；ODS-3V：比表面積為450 m2/g。比表面積越大，柱保留越強；結(jié)果顯示這兩種色譜柱中的3-甲硫基丙醛與相鄰峰的分離度都達不到要求。

2.2.2 不同流動相成分比例對方法專屬性的影響

色譜柱為Poroshell 120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7μm，在0.7 mL/min條件下，兩個比例流動相條件［乙腈∶水=40∶60（v/v）和乙腈∶水=50∶50（v/v）］的結(jié)果比較：相同色譜柱在相同流速下，流動相中有機相乙腈的含量越高，目標(biāo)峰的出峰越快，目標(biāo)峰和相鄰峰的分離度都有改善。選用乙腈∶水=50∶50（v/v）作為流動相，可縮短檢測所需時間，進而提高檢驗效率。

2.2.3 不同流速對方法專屬性的影響

色譜柱為Poroshell120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7μm，選用乙腈∶水=50∶50（v/v）作為流動相,調(diào)整色譜條件下的流速，研究不同流速（0.7 mL/min 和 0.5 mL/min）下目標(biāo)峰和相鄰峰的分離度改善情況，研究表明兩種流速條件下的分離度沒有明顯改善。

2.2.4 不同柱溫對方法專屬性的影響

色譜柱為Poroshell120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7μm，選用乙腈∶水=50∶50(v/v) 作為流動相，調(diào)整色譜條件下的流速，研究不同柱溫（40 ℃、25 ℃、20 ℃）條件下的分離效果；研究表明峰保留時間隨著柱溫越來越低，則保留時間越往后，目標(biāo)峰和相鄰峰的分離度沒有明顯改善，而溫度高時保留時間往前移，可以縮短分析時間。

以上測試結(jié)果顯示，乙腈/水流動相體系檢測靈敏度明顯好于氣相色譜法。1 mg/L的3-甲硫基丙醛對照液表現(xiàn)出良好的信噪比。通過局部調(diào)整參數(shù)，雖然可以使目標(biāo)峰與相鄰峰的分離度改善，但是并未能達到理想的分離程度，需要進一步調(diào)整分析方法和條件。

2.3 高效液相色譜分析方法和條件優(yōu)化

乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）都是反向色譜柱方法開發(fā)中廣泛使用的兩種常見溶劑，而乙腈比甲醇有更高的洗脫能力，為了減小流動相的洗脫能力，將流動相體系從乙腈/水改為甲醇/水流動相進行測試。其他色譜條件不變，僅改變流動相的比例，研究3-甲硫基丙醛和相鄰峰的分離度改善情況。

色譜條件如下。色譜柱：Poroshell 120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7μm；流動相∶甲醇∶ 水 = 不同比例（v/v）；流速：0.7 mL/min；檢測波長：350 nm；進樣體積：20μL；色譜柱溫度：25 ℃；樣品盤溫度：10 ℃。

基于不同流動相成分比例的甲醇和水，使用反向高效液相色譜方法分離1 mg/L 3-甲硫基丙醛，結(jié)果如圖2所示。

圖2 反向高效液相色譜方法分離3-甲硫基丙醛的圖譜

由圖2可知：①甲醇∶水=60∶40（v/v），3-甲硫基丙醛的保留時間為 16.2 min，分離度符合要求；甲醇∶水=50 ∶ 50（v/v），3- 甲硫基丙醛的保留時間為 45.1 min，分離度符合要求。②流動相中甲醇∶水為50∶50或60∶40都有很好的分離度，皆可滿足檢驗的方法學(xué)要求。

考慮合理的分析時間，選擇以下色譜條件對檢驗方法進行確認(rèn)。

甲硫加標(biāo)供試液（L-Met1601180708+0.5 mg/L 3- 甲硫基丙醛）目標(biāo)峰峰純度測試，結(jié)果如圖3所示。

圖3 甲硫加標(biāo)供試液目標(biāo)峰峰純度測試圖譜

結(jié)果顯示：對照液目標(biāo)峰與相鄰峰可以實現(xiàn)基線分離，二極管陣列（DVD）檢測器峰純度測試分值為999.99。表明該方法具備良好的專屬性。

3 分析方法初步確認(rèn)

以上結(jié)果顯示： 2-硝基苯肼衍生后使用高效液相色譜儀（HPLC）方法檢測 3-甲硫基丙醛是可行的。為了進一步考察該方法對使用目的的適用性，對實施方法進行方法確認(rèn)。

3.1 色譜條件

色譜柱： Agilent Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7μm（貨 號：695975-902T； 批 號：USCFS13303）；流動相：甲醇∶水=60∶40（v/v）；流速：0.746 mL/min；檢測波長：350 nm；進樣體積：20 μL；色譜柱溫度：25 ℃；分析時間：30 min；樣品盤溫度：10 ℃。

3.2 溶液配制

流動相：取色譜純甲醇與超純水按60∶40（v/v）混勻，以0.45μm有機系濾膜過濾后使用。反應(yīng)液：稱取100 mg±5% 2，4-二硝基苯肼（生產(chǎn)廠家：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20170817）于容瓶中，加入300 mL 乙腈溶解后，加入 700 mL 超純水，再加入 60 μL濃硫酸混合均勻密封備用?？瞻祝喝》磻?yīng)液在 60 ℃水浴中反應(yīng) 30 min，冷卻后進樣。供試液配制：稱取甲硫氨酸供試品（L-Met1601180708） 0.2 g 到 10 mL 容量瓶中，加反應(yīng)液約 9.5 mL 溶解樣品后于 60 ℃水浴中反應(yīng) 30 min，冷卻后用反應(yīng)液定容至刻度。

（1）3-甲硫基丙醛對照液配制。稱取 3-甲硫基丙醛C（生產(chǎn)廠家：麥克林，批號：10219821）20 mg 于 100 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容到刻度，得對照液A，濃度為 200 mg/L。移取對照液 A 2.50 mL 到 50 mL 容量瓶中，以甲醇定容到刻度，得濃度為 10 mg/L，此溶液定為對照液 B。取對照液 A 0.5 mL 于 10 mL 容量瓶中，加反應(yīng)液約 9.5 mL 在 60 ℃水浴中反應(yīng) 30 min，冷卻后用反應(yīng)液定容，濃度為 10 mg/L，相當(dāng)于成品控制限度 0.05%。取對照液 B 0.5 mL 于 10 mL 容量瓶中加入反應(yīng)液約 9.5 mL 并在 60 ℃水浴中反應(yīng) 30 min，冷卻后用反應(yīng)液定容，濃度為 0.5 mg/L。

（2）加標(biāo)供試液配制。稱取 L-甲硫氨酸供試品（L-Met1601180708）0.2 g 到 10 mL 容量瓶中，加入 0.5 mL對照液B，用約 9 mL反應(yīng)液使樣品完全溶解后在 60 ℃水浴中反應(yīng) 30 min，冷卻，用反應(yīng)液定容。

3.3 確認(rèn)程序

按照《中華人民共和國藥典2020年版·四部》［5］中分析方法驗證指導(dǎo)原則要求：專屬性測試中目標(biāo)物應(yīng)不受其他峰干擾；線性回歸相關(guān)系數(shù)不小于0.99；進樣重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于1%；準(zhǔn)確性范圍：80%～120%；檢出限度（LOD）：信噪比大于3∶1；定量限度（LO）：信噪比大于10∶1。

3.3.1 專屬性

分別取空白、反應(yīng)后 0.5 mg/L 3-甲硫基丙醛對照液、供試液和加標(biāo)供試液進樣檢測。結(jié)果顯示：3-甲硫基丙醛保留時間約 17 min，空白、供試液和加標(biāo)供試液均顯示目標(biāo)峰檢測無干擾，符合方法學(xué)要求。

3.3.2 線性

分別從對照液A 或?qū)φ找築 吸取一定量溶液于 10 mL容量瓶中加入反應(yīng)液 10 mL 使成 0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L 和 5.0 mg/L 3- 甲硫基丙醛對照液于60 ℃水浴中反應(yīng) 30 min，冷卻進樣，以峰面積對濃度做線性回歸。結(jié)果顯示：在0.1～5 mg/L 范圍內(nèi)，濃度依次為0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L 的峰面積依次為 8.58、47.87、101.88、191.68、537.30，其線性相關(guān)系數(shù)R=0.999，滿足方法學(xué)不小于0.99的要求。

3.3.3 進樣重復(fù)性

取 0.5 mg/L 3- 甲硫基丙醛對照液連續(xù)進樣 6 次，結(jié)果 顯 示： 峰 面 積 依 次 為 47.87、47.70、47.06、47.36、47.19、47.59；3-甲硫基丙醛峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.66%，滿足方法學(xué)不大于1%的要求。

3.3.4 準(zhǔn)確性

分別取 3 份 0.5 mg/L 3- 甲硫基丙醛對照液、3 份供試液及 3 份加標(biāo)供試液 C 3- 甲硫基丙醛加標(biāo)濃度 0.5 mg/L，進樣，計算加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示：3份加標(biāo)供試液的加標(biāo)回收率依次為92.37%、91.58%、92.70%，滿足方法學(xué)加標(biāo)回收率在80%～120%的要求。

3.3.5 定量限和檢測限

分別配制 3 份 0.05 mg/L 3- 甲硫基丙醛對照液和 3份 0.02 mg/L 3- 甲硫基丙醛對照液進樣，計算目標(biāo)峰的信噪比。0.05 mg/mL 的信噪比分別為 11.5、9.3 和 8.6 ；0.02 mg/mL 的信噪比分別為 5.1、6.0 和 5.6；以信噪比約10 推算的方法的定量限約0.05 mg/L。結(jié)果顯示：所配制的檢測限測定用對照液信噪比均大于5。因此推斷，以信噪比約 3 推算的檢測限可能會達到 0.01 mg/L。

3.3.6 溶液穩(wěn)定性

取1份0.5 mg/L 3-甲硫基丙醛對照液多次進樣，時間間隔為 0、4.2 h、24.1 h 的峰面積依次為 47.87、47.59和48.16；峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）為0.59%；取1 份供試液多次進樣時間間隔為 0、13.0 h、23.0 h、30.3 h的3-甲硫基丙醛峰面積皆為0，顯示供試液在長達30 h的儲存期，供試液未降解出3-甲硫基丙醛。取1份加標(biāo)供試液多次進樣時間間隔為 0、13.0 h、23.0 h、30.3 h 的 3-甲硫基丙醛峰面積依次為 44.78、44.03、44.23、43.88，3-甲硫基丙醛峰面積的RSD% 為0.89%。結(jié)果顯示：加標(biāo)供試液可穩(wěn)定存放30 h。

4 結(jié)束語

本研究主要比較氣相色譜檢測方法和液相色譜檢測方法測定甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛殘留的可行性,研究結(jié)果證實氣相色譜法中氫火焰離子化檢測器（FID）和火焰光度檢測器（FPD）皆不適合甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛殘留的測定。

采用液相色譜檢驗方法，利用2，4-二硝基苯肼可衍生化醛類的方式，通過比較不同碳載量的C18色譜柱、不同填料孔徑和填料比表面積的柱子對方法分離效果的影響，篩出適合的色譜柱；再經(jīng)過優(yōu)化方法中的條件如柱溫、流動相配比及流速，得到適合甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛的檢測方法條件，依據(jù)《中華人民共和國藥典2020年版·四部》中分析方法驗證指導(dǎo)原則［5］對方法進行確認(rèn)，方法確認(rèn)結(jié)果符合規(guī)定，表明該方法可用于甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛的測定。