孫寶盛，張 顏，肖貴榜，楊玉能*，楊泓濤，李世春，鄧位喜*

（1遵義職業(yè)技術(shù)學院，貴州遵義 563006；2習水縣富興牧業(yè)有限公司，貴州遵義 563006）

0 引言

【研究意義】毛色是毛用、絨用和皮用畜禽品種的重要經(jīng)濟性狀之一。毛色也是一種可利用的遺傳標記（孟浩浩等，2014），是認定品種的主要條件之一（李曉鋒等，2012；宋宇寧，2017；Saleh et al.，2021）。因此，探討動物不同毛色的形成機制對于改善毛皮動物的經(jīng)濟性狀和遺傳育種等均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】針對動物毛色形成機制的探索，目前已引起越來越多學者的廣泛關(guān)注。哺乳動物的毛色是由黑色素細胞產(chǎn)生的2種不同類型黑色素，即真黑色素和褐黑色素的分布和比例所決定（鮑加榮等，2015；郭躍躍等，2017；劉海霞等，2021）。黑色素細胞產(chǎn)生的黑素小體是合成黑色素的唯一溶酶體細胞器（鄭會芹，2010；杜站宇等，2016b），黑素小體經(jīng)過一系列酶學反應(yīng)最終生成黑色素。黑色素的生成可分為4個階段，包括黑素細胞轉(zhuǎn)移和成熟、黑素體形成、黑素顆粒轉(zhuǎn)運及黑色素排出（李溯和丁勁松，2013）。黑色素合成后沉積于黑素小體內(nèi)，形成均勻一致的成熟黑素顆粒，沿微管、微絲運輸至黑素細胞的樹突上，再通過細胞吞噬等作用轉(zhuǎn)運至相鄰的角質(zhì)細胞（陳旭等，2020；劉海霞等，2021），隨后被胞內(nèi)的溶酶體降解，隨表皮細胞脫落而排出（孟舒等，2006；杜站宇等，2016a）。黑色素的合成過程主要涉及3種酶，即酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（Tyrosinase-related protein-1，TYRP-1）和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2（Tyrosinase-related protein-2，TYRP-2）（宋康康，2007）。其中，TYR是黑色素合成的關(guān)鍵酶。黑色素生物合成是一個由TYR催化體內(nèi)酪氨酸羥化而成的過程（陳清西和宋康康，2006）。黑色素小體內(nèi)TYR活性較強時，酪氨酸被TYR羥化為多巴，多巴再被氧化成多巴醌（鄭會芹，2010），經(jīng)過一系列反應(yīng)最終生成黑色素（郭躍躍等，2017），從而使畜禽的皮毛呈褐色或黑色（Peng et al.，2017）；當TYR活性較低導致黑色素生成減少或缺乏時，皮毛則呈現(xiàn)白色（岳丹等，2021）。高莉等（2011）研究表明，棕色羊駝的基因表達量明顯高于白色羊駝。除基因外，-和基因也是影響黑色素生成的重要候選基因（李麗莎等，2016）。黑素皮質(zhì)素受體1（Melanocortin 1 receptor，MC1R）又被稱為促黑素細胞激素受體（Melanocyte stimulating hormone，MSHR），屬于G蛋白受體，當其與促黑色素細胞激素如α-促黑激素（α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH）結(jié)合時，能激活膜上的環(huán)腺苷酸酶系統(tǒng)產(chǎn)生cAMP激活TYR，促進真黑色素的合成及黑色素細胞的增殖，進而調(diào)控毛色（FitzGerald et al.，2006；陳偉等，2012），即基因也是調(diào)控動物黑色素合成的重要基因。此外，α-MSH可通過激活黑色素生成的主要調(diào)節(jié)因子——小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalmia-associated transcription factor，MITF），而提高酪氨酸活性，促進真黑色素合成（孟浩浩等，2014；Kumaris et al.，2018）。黑色素合成的關(guān)鍵信號通路包括MC1R/α-MSH、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt，PI3K/Akt）及Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/βcatenin）等通路（趙美娟等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】黔北麻羊是貴州省的三大優(yōu)良地方山羊品種之一，受農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記保護（翁吉梅等，2018；周志楠等，2020）。黔北麻羊具有肩部羊毛為黑色、腹部為白色的獨特特征（羅衛(wèi)星等，2010），因此分析黔北麻羊毛色特征形成的分子機制，可為探究動物毛色的形成機理提供參考依據(jù)，但至今對于貴州地方品種黔北麻羊毛色差異分子機制的研究很少，調(diào)控其毛色的主要基因和通路也有待進一步挖掘?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選取黔北麻羊肩部黑色羊毛和腹部白色羊毛的皮膚組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，以期獲得調(diào)控其毛色差異的候選基因和通路，為揭示黔北麻羊特征毛色的形成機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取習水縣富興牧業(yè)有限公司的1歲黔北麻羊公羊（圖1），共3只，體狀相近。每只羊取肩部黑色羊毛下的皮膚組織塊，每塊皮膚組織為1個重復，共3個重復（Black-1、Black-2和Black-3），作為試驗組；每只羊再取腹部白色羊毛下的皮膚組織塊，共3個重復（White-1、White-2和White-3），作為對照組。黔北麻羊飼料由富興牧業(yè)有限公司提供，其飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理

黔北麻羊的日常飼養(yǎng)管理參照NY 5032—2006《無公害食品 畜禽飼料和飼料添加劑使用準則》。

1.3 樣品采集

在3只黔北麻羊肩部黑色羊毛區(qū)各取1小塊皮膚組織（刮毛），同樣在腹部白色羊毛區(qū)各取1小塊皮膚組織（刮毛），裝入凍存管經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。為避免基因表達受擾亂，取樣時不對皮膚進行局部麻醉。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組測序流程包括RNA提取、樣品質(zhì)檢、文庫構(gòu)建和質(zhì)控及上機測序等。（1）從-80 ℃冰箱取出皮膚組織提取RNA，并對樣品RNA進行質(zhì)檢。（2）構(gòu)建文庫。以帶有Oligo（dT）的磁珠富集組織mRNA，加 入Fragmentation Buffer 將mRNA 隨 機 打 斷，以mRNA 為 模 板，采 用 引 物Random Hexamers 合 成cDNA第一鏈；再加入緩沖液、dNTPs和DNA合成酶I合成cDNA第二鏈；利用AMPure XP Beads純化雙鏈cDNA，并進行末端修復、加ploy（A）尾和連接測序接頭，以AMPure XP Beads選擇片段大小；通過PCR富集構(gòu)建cDNA文庫。（3）文庫質(zhì)控。對cDNA文庫的插入片段長度和有效濃度進行質(zhì)控。（4）最后通過Illumina HiSeq4000測序平臺進行測序。

1.5 生物信息學分析

（1）對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，與參考基因組比對后進行基因表達水平分析。（2）使用主成分分析（Principal component analysis，PCA）評估組間的差異及組內(nèi)樣本生物學重復性。（3）然后進行基因表達差異分析。采用DESeq2進行差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs）篩選，篩選標準為表達差異倍數(shù)logFold Change＞1、校正后的＜0.05，繪制差異表達基因火山圖；然后對差異表達基因進行GO功能注釋分析：分別從生物學過程（Biological process）、細胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）三大功能對差異表達基因進行GO功能注釋分析，并通過Fisher精確檢驗出差異表達基因與參考物種基因組的差異顯著性，找到所有差異表達蛋白富集的功能類別。最后對差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析：一是基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行注釋；二是以KEGG信號通路為單位和參考基因組為背景進行富集分析，以確定受到顯著影響的代謝和信號轉(zhuǎn)導途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 黔北麻羊毛色樣本主成分分析結(jié)果

黔北麻羊不同毛色樣本間的主成分分析結(jié)果顯示，圖2右側(cè)的黑色羊毛試驗組（Black）和左側(cè)的白色羊毛對照組（White）間的樣本明顯分散，表明組間差異明顯；但組內(nèi)樣本明顯聚類，表明樣品表達模式的相似度很高?？梢姡甭檠虿煌珮颖具x擇合理、可靠性高。

2.2 黔北麻羊毛色差異表達基因火山圖

如圖3所示，黔北麻羊毛色差異表達基因火山圖能直觀展示2個毛色組樣品中差異表達基因的分布情況及其表達趨勢。與白色羊毛對照組相比，黑色羊毛試驗組存在509個顯著上調(diào)表達基因（紅色圓點）、195個顯著下調(diào)表達基因（綠色圓點），其余基因表達差異不顯著（黑色圓點）。

2.3 黔北麻羊黑白毛色組間與黑色素相關(guān)的顯著差異表達基因

與白色羊毛對照組相比，在黑色羊毛試驗組的509個顯著上調(diào)基因中篩選獲得5個與黑色素生成相關(guān)且表達差異顯著（表達差異倍數(shù)logFold Change＞1，校正后的＜0.05）的基因，分別是基因、基因、基因、角蛋白19基因（）和角蛋白79基因（）（表2）。TYR和TYRP1催化酪氨酸合成黑色素；MC1R可與α-MSH結(jié)合，激活酪氨酸激酶形成黑色素，合成的黑色素轉(zhuǎn)運至角質(zhì)形成細胞進行存儲，角質(zhì)形成細胞進一步分化形成角蛋白。因此，黑色羊毛試驗組、、、和等基因表達上調(diào)，意味著黑色素生成呈增長趨勢。

2.4 顯著差異表達基因GO功能注釋分析結(jié)果

顯著差異表達基因在生物學過程、分子功能和細胞組分三大GO功能中共注釋到6081條功能條目。其中，生物學過程注釋到4671條GO功能條目，有554條為顯著富集；分子功能注釋到881條GO功能條目，有145條為顯著富集；細胞組分注釋到529條GO功能條目，有69條為顯著富集。相對于白色羊毛對照組，在黑色羊毛試驗組顯著富集的前30條GO功能條目（圖4）中色素代謝過程（Pigment metabolic process）與黑色素合成代謝密切相關(guān)。

顯著差異表達基因的GO功能注釋分析還發(fā)現(xiàn)，在顯著差異表達基因參與的生物學過程、分子功能和細胞組分三大GO功能注釋分類中，除了上述色素代謝過程外，黑色羊毛試驗組還顯著富集于色素沉著（Pigmentation）、色素生物合成過程（Pigment biosynthetic process）、色素顆粒組織（Pigment granule organization）、色素顆粒膜（Pigment granule membrane）、黑素小體（Melanosome）、黑素小體膜（Melanosome membrane）、黑素小體組織（Melanosome organization）、黑色素生物合成過程（Melanin biosynthetic process）、黑色素代謝過程（Melanin metabolic process）、黑素細胞刺激素受體活性（Melanocytestimulating hormone receptor activity）、角質(zhì)形成細胞分化（Keratinocyte differentiation）、角質(zhì)形成細胞分化調(diào)節(jié)（Regulation of keratinocyte differentiation）等與黑色素形成相關(guān)的GO功能條目（表3）上，與黑色羊毛試驗組中生成黑色素相關(guān)基因、和等顯著上調(diào)的結(jié)果相對應(yīng)。

2.5 顯著差異表達基因KEGG信號通路富集分析結(jié)果

顯著差異表達基因的KEGG信號通路富集分析結(jié)果表明，相對于白色羊毛對照組，黑色羊毛試驗組顯著富集在25條通路上，排名前20（圖5）的KEGG信號通路分別是酒精中毒（Alcoholism）、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝（Glycine，serine and threonine metabolism）、甘油酯代謝（Glycerolipid metabolism）、核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）、AMPK信號通路（AMPK signaling pathway）、ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ABC transporters）、丙酸代謝（Propanoate metabolism）、乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、丁酸代謝（Butanoate metabolism）、脂肪酸延伸（Fatty acid elongation）、過氧化物酶體（Peroxisome）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）、PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine degradation）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism）、脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）及代謝途徑（Metabolic pathways），以代謝途徑（紅色氣泡）富集到的顯著差異表達基因最多。值得注意的是，在黑色羊毛試驗組顯著差異表達基因富集的KEGG信號通路中，與黑色素生成密切相關(guān)的是酪氨酸代謝通路（紅色框）。

將顯著差異表達基因標注到酪氨酸代謝通路（圖6）中發(fā)現(xiàn)，TYR可催化酪氨酸→半胱氨酸多巴→褐黑素，也可催化酪氨酸→多巴醌→無色多巴醌→多巴色素，然后一條途徑是生成5,6-二羥基-吲哚→酪氨酸酶催化生成吲哚-5,6-醌→真黑素，另一條途徑是生成二羥基吲哚羧酸，再被TYRP1催化生成真黑素。相對于白色羊毛對照組，黑色羊毛試驗組中參與黑色素生成通路的基因和基因表達顯著上調(diào)（紅色框），意味著黑色素生成增加。

相對于白色羊毛對照組，黑色羊毛試驗組中參與黑色素生成通路中的基因和基因上調(diào)（紅色），但兩組間參與黑色素生成（Melanogenesis）通路的Wnt/β-catenin、MAPK等信號通路富集程度均無顯著差異，PI3K/Akt和MC1R/α-MSH等其他與黑色素生成相關(guān)的信號通路也不存在顯著差異（圖7）。說明Wnt/β-catenin、MAPK、PI3K/Akt 和MC1R/α-MSH等經(jīng)典的黑色素生成信號通路并不是黔北麻羊生成黑色素的主要通路，而是酪氨酸代謝通路。

3 討論

TYR是黑色素合成過程中的關(guān)鍵限速酶。黑色素的生物合成是由TYR催化體內(nèi)酪氨酸羥化而啟動一系列生化反應(yīng)的過程（鄭會芹，2010）。酪氨酸可通過膜的主動運輸進入黑色素細胞內(nèi)完成黑色素合成（李文等，2007），第一階段是酪氨酸被TYR催化形成L-多巴，繼而氧化生成多巴醌；第二階段是多巴醌從2個不同途徑生成真黑素和褐黑素（陳清西和宋康康，2006）。本研究中，黑色羊毛試驗組的基因表達顯著上調(diào)，催化酪氨酸合成多巴醌，增加黑色素生成。因此，基因應(yīng)是黔北麻羊肩、腹部存在黑白毛色差異的主要調(diào)控基因之一。除TYR外，黑色素生成通路的關(guān)鍵酶還包括TYRP-1和TYRP-2等?；蚴堑谝粋€被克隆獲得的色素基因，對黑色素合成及黑色素細胞的發(fā)育、生存與功能均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用（李麗莎等，2016），是影響羊駝黑色素生成的重要候選基因之一（高莉等，2010）。本研究結(jié)果也表明，相對于白色羊毛對照組，黑色羊毛試驗組中的基因表達明顯上調(diào)，進而加速催化二羥吲哚羧酸（DHICA）生成5,6-IQCA，最終增加真黑素生成。因此，基因也是影響黔北麻羊黑白毛色差異的重要基因。

基因是控制毛色形成的主要候選功能基因之一，與黑色素細胞的生成密切相關(guān)（付冬麗，2013）。MC1R與α-MSH的親和力最高，MC1R/α-MSH是黑色素細胞接受機體激素調(diào)控的主要信號通路，對動物毛色形成起重要作用（任玉紅等，2012）。α-MSH激活黑色素細胞膜上的MC1R和腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，ATP轉(zhuǎn)變?yōu)閏AMP，激活酪氨酸激酶，活化在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離核糖體上合成的TYR（楊永升等，2004），而TYR催化黑素細胞從血液中攝取酪氨酸，經(jīng)高爾基復合體變成多巴，多巴在黑素體內(nèi)聚積到一定量后即釋放黑色素（李秋玲等，2008）。本研究結(jié)果表明，與白色羊毛對照組相比，黑色羊毛試驗組中的基因表達也顯著上調(diào)，從而導致黑色素生成增加，即基因也是形成黔北麻羊黑白毛色差異的重要基因。

黑素細胞在黑素小體中合成黑色素并轉(zhuǎn)運至周圍的角質(zhì)形成細胞進行存儲，黑色素停留在這些角質(zhì)形成細胞的細胞核上能發(fā)揮保護作用。在黑色素的生成過程中，角質(zhì)形成細胞接受紫外線照射后釋放的促黑激素（MSH）作用于黑素細胞表面的MSH受體，從而上調(diào)基因、基因和基因的表達（王秋楓，2003）。在本研究中，與白色羊毛對照組相比，黑色羊毛試驗組的基因和基因呈上調(diào)表達，而角質(zhì)形成細胞在分化過程中形成角蛋白，表明生成角蛋白的角質(zhì)形成細胞及其黑色素明顯增加，進而造成黔北麻羊肩、腹部的黑白毛色差異，與崔玉琮等（2017）研究發(fā)現(xiàn)角蛋白可激活羊駝皮膚黑色素細胞黑色素合成相關(guān)信號通路即促進黑色素合成的結(jié)論一致。

羊毛的毛色主要取決于黑色素的組成、數(shù)量和分布情況（郭躍躍等，2017），黑色素是在黑素小體中合成及貯存。本研究的GO功能注釋分析結(jié)果表明，黑色羊毛試驗組中的顯著差異表達基因主要富集于黑素小體、色素沉著、色素生物合成過程、黑色素生物合成過程及角質(zhì)形成細胞等與黑色素形成相關(guān)的GO功能條目上。黑色素的生成涉及以下KEGG信號通路：MC1R/α-MSH、PI3K/Akt、MAPK、Wnt/βcatenin及NO等（趙美娟等，2019；王歆悅等，2020；劉海霞等，2021；羅曉君等，2021）。但在本研究中，Wnt/β-catenin、MAPK、PI3K/Akt和MC1R/α-MSH等經(jīng)典的黑色素生成信號通路及其參與的Melanogenesis通路在黑色羊毛試驗組與白色羊毛對照組間的富集程度并無顯著差異。值得注意的是，相對于白色羊毛對照組，黑色羊毛試驗組中生成黑色素的酪氨酸代謝通路卻明顯富集，說明酪氨酸代謝應(yīng)是黔北麻羊生成黑色素的主要通路，而非Wnt/β-catenin、MAPK等經(jīng)典的黑色素生成信號通路。

4 結(jié)論

、、和等是調(diào)控黔北麻羊毛色的主要基因，酪氨酸代謝通路是調(diào)控黔北麻羊毛色的主要通路。、、和等基因的局部上調(diào)表達，激活酪氨酸代謝等信號通路而促使黑色素生成增加，是黔北麻羊肩部黑色羊毛和腹部白色羊毛存在差異的主要原因。