謝 琨，申紅遠(yuǎn)，鄭焱華，李婷婷，魏香蘭 西安市胸科醫(yī)院 藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，陜西西安 7000； 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 血液科，陜西西安7003

多發(fā)性骨髓瘤 (multiple myeloma，MM)是骨髓中漿細(xì)胞克隆性增殖所致的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是血液系統(tǒng)中僅次于非霍奇金淋巴瘤的第二常見的惡性腫瘤[1]。隨著免疫調(diào)節(jié)劑(來那度胺、泊馬度胺等)、蛋白酶體抑制劑(硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米等)、抗CD38單克隆抗體、自體造血干細(xì)胞移植和嵌合抗原受體T細(xì)胞等在內(nèi)的新治療手段的應(yīng)用，MM患者的治療效果已經(jīng)得到極大的改善。迄今為止，MM仍然是無法治愈的疾病，幾乎所有MM患者最終都將演變?yōu)閺?fù)發(fā)難治疾病狀態(tài)[2]，這表明迫切需要新的治療策略改善患者預(yù)后[3]。葡萄糖代謝異常是癌細(xì)胞的標(biāo)志[4-5]。即使在氧氣充足的條件下，癌癥細(xì)胞仍主要通過糖酵解，而不是通過更有效率的線粒體氧化磷酸化利用葡萄糖，這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)[6]。因此癌細(xì)胞對(duì)糖酵解的偏好使靶向腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑的干預(yù)手段有希望成為抗腫瘤的方向[7-8]。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)由兩種功能不同的多蛋白復(fù)合物組成——mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)。mTORC1是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)子，可調(diào)節(jié)和促進(jìn)MM細(xì)胞生長增殖，應(yīng)對(duì)化療毒性使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。mTOR也可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞葡萄糖代謝來影響細(xì)胞的生理活動(dòng)[9]，這提示我們mTORC1抑制劑(如雷帕霉素)具有潛在抗MM作用[10]。單用mTORC1抑制劑的抗腫瘤作用有限，因?yàn)镻I3K/AKT/mTOR通路中存在反饋激活機(jī)制，即mTORC1受到抑制時(shí)，ATK會(huì)活化，重新激活mTORC1信號(hào)，導(dǎo)致靶向mTORC1的藥物療效降低甚至出現(xiàn)耐藥[11]。2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)是葡萄糖的類似物，是使用最廣泛的糖酵解抑制劑之一。單獨(dú)應(yīng)用2-DG阻斷糖酵解對(duì)包括MM在內(nèi)多種惡性腫瘤并沒有產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效應(yīng)，原因是腫瘤細(xì)胞可通過磷酸戊糖途徑繞過2-DG的阻斷作用繼續(xù)為無氧糖酵解提供底物。這一過程中mTORC1發(fā)揮了重要作用，也反映了腫瘤細(xì)胞的代謝可塑性[12]。我們提出假設(shè)，mTOR在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞糖代謝過程中可能起作用，當(dāng)mTORC1和糖酵解均被抑制時(shí)，兩者在作用機(jī)制上存在互補(bǔ)，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同的抗骨髓瘤作用。我們研究發(fā)現(xiàn)mTORC1抑制劑雷帕霉素和糖酵解抑制劑2-DG聯(lián)用具有協(xié)同的抗腫瘤作用，使細(xì)胞周期阻滯、凋亡率增加。

材料與方法

1 細(xì)胞株 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株 RPMI8226購自武漢普諾賽公司，RPMI8226腫瘤細(xì)胞采用RPMI1640 培養(yǎng)液，10%(V/V)FBS，100 U/mL 青霉素，100 mg/L鏈霉素，37℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)。

2 主要試劑和儀器 Rapa 購于 Sigma 公司 (編號(hào)V900930，分子量914.17，純度≥95%)，2-DG(編號(hào)I0697，分子量639.71，純度＞99.0%)購于中國上海TCI公司，CCK-8購于中國上海尚寶公司(貨號(hào)ST1008)，PI/RNase染色緩沖液(貨號(hào)550825)和 Annexin V/碘化丙啶 (PI)檢測試劑盒(貨號(hào)556547)購于美國BD-PharminginTM公司(貨號(hào) ST1008)，抗 Bcl-2(貨號(hào) ab32124)、抗 P53(貨號(hào) ab26)、抗 Bax(貨號(hào) ab32503)、抗 CyclinD1(貨號(hào)ab16663)、抗GAPDH(貨號(hào)ab8245)抗體購于Abcam公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)，超凈工作臺(tái)(天津泰斯特公司)，酶標(biāo)儀(南京德鐵設(shè)備儀器公司)，倒置相差顯微鏡(德國Zeiss公司)，蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Omega Lum化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Aplegen公司)，四色流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)。

3 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將 RPMI8226 細(xì)胞按 2 × 104/孔的密度接種于96孔板，每孔200 μL，分為單藥 Rapa 組 (10 nmol/L、 20 nmol/L、 50 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L)、2-DG 組 (0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.8 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、5 mmol/L)及兩藥聯(lián)合作用組，合用組中Rapa(nmol/L)和2-DG(mmol/L)的工作濃度組合為20+0.2、50+0.5、80+0.8、100+1，固定Rapa和2-DG濃度比例為100∶1。對(duì)照組加入用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的DMSO，DMSO終濃度與單藥處理組相同?？瞻捉M只加入200 μL RPMI1640培養(yǎng)液。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞孵箱中孵育。48 h后各個(gè)處理組每孔均加入20 μL CCK-8工作液，37℃細(xì)胞孵箱孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm測定每孔吸光度值，并計(jì)算單藥及聯(lián)用組的抑制率，抑制率=[(對(duì)照孔-實(shí)驗(yàn)孔)/(對(duì)照孔-空白孔)] × 100%。

4 細(xì)胞周期分析 根據(jù)兩藥合用的最低合用指數(shù) (combination index，CI)(協(xié)同作用最佳)，我們選取單藥 Rapa(50 nmol/L)、2-DG(0.5 mmol/L)及兩藥聯(lián)用 (0.5 mmol/L 2-DG + 50 nmol/L Rapa)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用濃度。處理48 h后，離心(1 000 r/min)去上清，1.5 mL PBS 重懸并洗滌細(xì)胞兩遍，逐滴加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇，4℃固定過夜，離心 (1 000 r/min)棄乙醇，1 mL PBS 洗滌一遍，加入 500 μL PI/RNase 染色緩沖液，混勻后避光孵育20 min，上機(jī)檢測。

5 細(xì)胞凋亡檢測 MM 細(xì)胞經(jīng) Rapa(50 nmol/L)、2-DG (0.5 mmol/L)或聯(lián)合處理 48 h 后，收集各組細(xì)胞，細(xì)胞離心 (1 000 r/min)去上清，1.5 mL PBS 重懸并洗滌細(xì)胞兩遍，加入 500 μL 的 1 × 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入 Annexin V/FITC 5 μL，再加入 PI 15 μL，室溫黑暗中孵育 15 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。Annexin V/FITC1陽性和PI陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是早期凋亡細(xì)胞，Annexin V/FITC1和PI陽性則被認(rèn)為與晚期凋亡或壞死有關(guān)。6 Western blot檢測蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞用 RIPA裂解液在冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測各組蛋白濃度，用裂解液稀釋各組蛋白至相同濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，每組取30 μg 蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳(壓縮膠 80 V，分離膠 120 V)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上 (濕轉(zhuǎn)法，恒流 220 mA，35 min)。5% 的脫脂奶粉室溫封閉 1 h后，加入P53、Bcl-2、Bax、CyclinD1、GAPDH一抗(除GAPDH稀釋比例為1∶10 000，其他一抗稀釋比例均為 1∶1 000)，4℃孵育過夜，洗膜后加入對(duì)應(yīng)種屬辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗(稀釋比例1∶4 000)，室溫孵育1 h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(Millipore)檢測目的蛋白條帶。

7 計(jì)算藥物合用指數(shù) 使用 CompuSyn 軟件，按照Chou-Talalay方法計(jì)算合用指數(shù)。兩種藥物的聯(lián)合作用可以總結(jié)為CI＜1、CI=1、CI＞1分別表示協(xié)同作用、相加作用、拮抗作用[13]。

8 統(tǒng)計(jì)分析方法 GraphPad Prism 8.0 軟件 (San Diego，CA)用于數(shù)據(jù)處理、分析。使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。本研究的每個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，計(jì)量資料以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 2-DG 增強(qiáng)了 Rapa 對(duì) RPMI8226 細(xì)胞的毒性單 藥 Rapa(10 nmol/L、 20 nmol/L、 50 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L)、單藥 2-DG(0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.8 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、5 mmol/L)以及 Rapa(nmol/L)與2-DG(mmol/L)固定比例合用(20+0.2、50+0.5、80+0.8、100+1)處理48 h后，如圖1A和圖1B所示，與對(duì)照組相比，Rapa或2-DG單獨(dú)作用均顯著抑制RPMI8226細(xì)胞的活力，且呈濃度依賴性。如圖1C所示，當(dāng)RPMI8226細(xì)胞經(jīng)Rapa(nmol/L)和2-DG(mmol/L)以恒定比例(100∶1)共同作用時(shí)，與Rapa或2-DG單獨(dú)作用相比，Rapa和2-DG聯(lián)合作用對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株的生長有更強(qiáng)的抑制作用(P＜0.05)。

圖1 Rapa和2-DG處理48 h對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226增殖的影響(aP＜0.05, vs對(duì)照組；bP＜0.05, vs雷帕霉素單藥組；cP＜0.05, vs 2-DG單藥組)Fig.1 Effect of rapamycin and 2-DG on the growth in RPMI8226 cells after 48 h treatment (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs Rapamycin alone group; cP＜0.05, vs 2-DG alone group)

2 CompuSyn 軟件分析計(jì)算不同濃度 Rapa與 2-DG合用對(duì)RPMI8226細(xì)胞的CI值 利用CompuSyn軟件分析計(jì)算Rapa與2-DG合用的CI值及相關(guān)合用指標(biāo)，繪制不同濃度Rapa和2-DG作用于RPMI8226細(xì)胞的Fa-CI圖，圖2和表1顯示了本研究中所用兩藥組合的協(xié)同效應(yīng)結(jié)果，四個(gè)組合中 50 nmol/L Rapa + 0.5 mmol/L 2-DG 的 CI 值最小，協(xié)同效應(yīng)最強(qiáng)。

表1 雷帕霉素和2-DG的合用指數(shù)Tab.1 Combination index for combination of Rapamycin and 2-DG

圖2 CompuSyn軟件合成雷帕霉素和2-DG合用的Fa-CI圖，每一個(gè)圓形的點(diǎn)表示一個(gè)藥物組合具體的合用指數(shù)值Fig.2 Fa–CI plots were calculated based on the Chou –Talalay equation using CompuSyn software version 1.0.Each round symbol designated the CI (combination index) values for each Fa (fraction affected) at four different dose points lines

3 Rapa 聯(lián)合 2-DG 對(duì) RPMI8226 細(xì)胞周期的影響圖3A和圖3B所示，Rapa(50 nmol/L)或2-DG(0.5 mmol/L)單藥作用 48 h 降低了 RPMI8226 細(xì)胞S期的比例，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，與Rapa單獨(dú)作用相比，Rapa(50 nmol/L)聯(lián)合2-DG(0.5 mmol/L)作用48 h明顯增強(qiáng)了這一趨勢。Rapa與2-DG合用進(jìn)一步降低了RPMI8226細(xì)胞DNA合成期(S期)的比例，使細(xì)胞周期明顯阻滯在G0/G1 期 (P＜0.05)。

圖3 Rapa和2-DG對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226周期的影響(aP＜0.05, vs對(duì)照組；bP＜0.05, vs雷帕霉素單藥組；cP＜0.05, vs 2-DG單藥組)Fig.3 Effect of rapamycin and 2-DG on cell distribution in RPMI8226 cells (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs Rapamycin alone group;cP＜0.05, vs 2-DG alone group)

4 Rapa 聯(lián)合 2-DG 對(duì) RPMI8226 細(xì)胞凋亡的影響圖4A和圖4B所示，單藥Rapa(50 nmol/L)作用于RPMI8226 48 h后，引起細(xì)胞輕度凋亡(約10%凋亡率)，而 2-DG (0.5 mmol/L)在 48 h 后未能誘導(dǎo)MM 細(xì)胞凋亡。Rapa(50 nmol/L)聯(lián)合2-DG(0.5 mmol/L)作用 48 h 后，RPMI8226 的細(xì)胞凋亡率(約20%)顯著高于Rapa單藥組(P＜0.05)。

圖4 Rapa和2-DG對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226凋亡的影響(aP＜0.05, vs對(duì)照組；bP＜0.05, vs雷帕霉素單藥組；cP＜0.05, vs 2-DG單藥組)Fig.4 Effect of rapamycin and 2-DG on apoptosis in RPMI8226 cells (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs Rapamycin alone group;cP＜0.05, vs 2-DG alone group)

5 Rapa 聯(lián)合 2-DG 使 RPMI8226 細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax和P53表達(dá)增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)降低 Westernblot結(jié)果顯示 Rapa(50 nmol/L)和 2-DG(0.5 mmol/L)單藥作用48 h，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1表達(dá)水平較對(duì)照組降低，Rapa(50 nmol/L)和2-DG(0.5 mmol/L)合用 48 h，CyclinD1 的表達(dá)水平進(jìn)一步降低。Rapa(50 nmol/L)和 2-DG(0.5 mmol/L)單藥作用48 h增加Bax和P53的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)，與對(duì)照組和單藥組比較，合用組進(jìn)一步增加Bax和P53的表達(dá)，Bcl-2的表達(dá)更低(P＜0.05)，見圖5。在蛋白水平顯示出合用Rapa和2-DG對(duì)RPMI8226細(xì)胞具有明確的周期阻滯和增強(qiáng)凋亡的藥理學(xué)作用。

圖5 Rapa和2-DG對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(aP＜0.05, vs對(duì)照組；bP＜0.05, vs雷帕霉素單藥組；cP＜0.05, vs 2-DG單藥組)Fig.5 Effect of rapamycin and 2-DG on cell cycle and apoptosis related protein in RPMI8226 cells (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs Rapamycin alone group; cP＜0.05, vs 2-DG alone group)

討 論

代謝重編程是癌細(xì)胞的特征，表現(xiàn)出對(duì)有氧糖酵解的依賴。癌細(xì)胞有氧糖酵解的特征是葡萄糖消耗的增加和乳酸生成速率的提高，這一現(xiàn)象最早由Warburg在20世紀(jì)20年代描述，此后被稱為Warburg效應(yīng)[4]。在腫瘤研究中，葡萄糖代謝是腫瘤代謝研究最多的一個(gè)分支。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長[14-15]。PI3K/AKT/mTOR通路參與腫瘤細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)，其中mTOR是Warburg效應(yīng)的中心調(diào)控因子，也可以作為癌基因和腫瘤抑制基因的下游效應(yīng)分子[7]。靶向mTOR通路的化合物在癌癥治療方面具有一定的應(yīng)用潛力[16]。然而單用mTORC1抑制劑時(shí)，腫瘤細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中從mTOR到AKT存在一個(gè)反饋機(jī)制，mTORC1被抑制能導(dǎo)致ATK活化，AKT活化導(dǎo)致該信號(hào)通路對(duì)mTOR抑制劑的抵抗和耐藥。在骨髓瘤細(xì)胞中，mTORC1抑制劑Rapamycin抑制mTOR信號(hào)通路，會(huì)導(dǎo)致AKT的磷酸化水平升高并激活，同時(shí)抑制AKT和mTORC1才能產(chǎn)生協(xié)同的抗骨髓瘤作用[11]。抑制糖酵解活性在癌癥治療中一直是有吸引力的研究方向[17]，但至今使用糖酵解抑制劑的臨床試驗(yàn)并沒有取得成功。2-DG單藥治療在人異種移植動(dòng)物腫瘤模型中無效，與化療方法聯(lián)合僅能輕度減慢腫瘤的生長。這是因?yàn)?-DG抑制糖酵解的關(guān)鍵酶-己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)后，腫瘤細(xì)胞通過磷酸戊糖旁路途徑繞過HK2催化的下游糖酵解步驟繼續(xù)為糖酵解提供代謝底物，而該旁路代謝過程依賴mTORC1[12]。這提示我們mTORC1抑制劑可以協(xié)同2-DG，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤活性。Zhao等[18]發(fā)現(xiàn)mTORC1抑制劑Rapa與糖酵解抑制劑2-DG聯(lián)合主要通過糖酵解途徑對(duì)肝癌細(xì)胞具有協(xié)同抗腫瘤作用。Jiang等[19]報(bào)道m(xù)TOR復(fù)合物1/2抑制劑與糖酵解抑制劑對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡增加、葡萄糖攝取降低。張雪燕等[20]證實(shí)2-DG通過抑制己糖激酶的活性、抵抗阿霉素誘發(fā)的mTOR活化，降低糖酵解活性，增強(qiáng)白血病多藥耐藥細(xì)胞K562/ADM對(duì)化療藥的敏感性。高琪等[21]研究發(fā)現(xiàn)2-DG抑制糖酵解，同時(shí)下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)，從而下調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)改善腫瘤微環(huán)境，可增強(qiáng)抗血管生成藥的抗腫瘤作用。

Rapa對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞均有細(xì)胞周期阻滯作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中，CCK-8結(jié)果提示Rapa和2-DG均能抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖，呈濃度依賴性，當(dāng)兩藥合用時(shí)顯示出比單藥更強(qiáng)的抑制作用，CI值均＜1，說明具有協(xié)同作用。細(xì)胞周期分析顯示Rapa和2-DG合用組使MM細(xì)胞更多地阻滯在G0/G1期，S期比例顯著下降，說明兩藥合用能發(fā)揮更大的細(xì)胞周期阻滯作用。當(dāng)Rapa(50 nmol/L)單獨(dú)作用MM細(xì)胞48 h時(shí)，發(fā)生了少量的凋亡，與2-DG(0.5 mmol/L)聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著增加，表明促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞凋亡也是合用組發(fā)揮協(xié)同作用的重要途徑。Western blot也從蛋白水平揭示了合用組細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1的表達(dá)較單藥組和空白對(duì)照組顯著下調(diào)，合用組促凋亡蛋白P53、Bax的表達(dá)較單藥組顯著升高，而合用組凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)較單藥組顯著下降，我們猜想這些蛋白表達(dá)水平的變化與MM細(xì)胞糖酵解受到抑制有關(guān)。Vijay等[10]解釋了Rapa對(duì)MM細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用主要是通過自噬而不是凋亡來介導(dǎo)的。在本實(shí)驗(yàn)中，我們推測Rapa聯(lián)合2-DG對(duì)MM細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用部分是通過細(xì)胞自噬介導(dǎo)的，這一機(jī)制需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

總之，我們證明了mTOR和糖酵解的雙重抑制降低了多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖率和存活率，兩藥合用具有協(xié)同作用。我們從細(xì)胞周期阻滯、凋亡增加等機(jī)制解釋了這一現(xiàn)象。這種組合將是治療MM的一種有前景的方法，并為后續(xù)進(jìn)一步研究其機(jī)制，尤其是致癌信號(hào)與腫瘤細(xì)胞代謝之間的相互作用提供了初步的基礎(chǔ)。這些觀察結(jié)果需要在臨床前試驗(yàn)中進(jìn)一步確認(rèn)。