游雪云，劉艷秋

（江西省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心 江西省出生缺陷防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006）

據(jù)報(bào)道，全球大約10~15%的夫婦患有不育不孕，而男性方面的因素大概占30~55%[1-2]。 有研究表明男性發(fā)生不育的原因較多且較繁雜， 如精索靜脈曲張[3-5]、性激素分泌功能紊亂[6-7]、生精管道梗阻[8-9]、遺傳因素[10-11]和營(yíng)養(yǎng)不良等[12]，其最終引起精子質(zhì)量的下降、 精子密度的減少甚至無(wú)精癥是導(dǎo)致男性不育的最主要原因。 弱精癥是一種危脅男性生殖健康的疾病， 同時(shí)也是困擾全球的一個(gè)醫(yī)學(xué)難題。 生精細(xì)胞氧化應(yīng)激是導(dǎo)致弱精癥的一項(xiàng)重要原因，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Pim2/c-Myc 高表達(dá)于弱精癥睪丸組織， 但其在生精細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用尚未明確。 為了研究弱精癥精子Pim2/c-Myc 蛋白與活性氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷關(guān)系，我們收集了弱精癥患者和正常志愿者精液， 采用免疫印跡方法對(duì)精子Pim2/c-Myc 蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)熒光探針檢測(cè)精子ROS 含量，以闡明Pim2/c-Myc 蛋白與ROS 的關(guān)系及確認(rèn)Pim2/c-Myc 蛋白的表達(dá)和弱精癥間的相關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2020 年1 月至12 月我院（江西省婦幼保健院） 生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行精液常規(guī)檢查標(biāo)本進(jìn)行研究。 弱精癥患者共計(jì)76 例，弱精癥患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：A 級(jí)精子 （快速前向運(yùn)動(dòng))<25%或A+B 級(jí)精子（前向運(yùn)動(dòng)的精子)<50%。其中，輕度弱精癥組(n=42)A 級(jí)精子>10%，中度弱精癥組(n=34)A 級(jí)精子<10%，其他精液常規(guī)參數(shù)正常。 正常對(duì)照組共50 例，正常對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)：（1）連續(xù)三次精液常規(guī)檢查結(jié)果：PR≥32%； 同時(shí)PR+NP≥40%，精子的密度≥15×106/mL；（2）各項(xiàng)臨床檢測(cè)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)；（3）各項(xiàng)性激素檢測(cè)值均在正常范圍內(nèi)；（4）無(wú)先天性、損傷性生殖系統(tǒng)疾病。所有受試者標(biāo)本均經(jīng)江西省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)， 受試者均被告知實(shí)驗(yàn)?zāi)坎⒑炇鹬橥鈺?shū)。

1.2 試劑 Percoll 液（Pharmacia，美國(guó)），TRIzol 試劑（Invitrogen，美國(guó)），兔抗Pim2/c-Myc 單克隆抗體(美國(guó)Abcam 公司)；兔抗GAPDH 多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)；HRP-羊抗兔多克隆抗體(美國(guó)Abcam 公司)；活性氧檢測(cè)試劑盒(Takara) 。

1.3 儀器 HT-IVOSII 型（美國(guó)Hamilton Thorne 公司）全自動(dòng)精子分析系統(tǒng)，Diff-Quik 精子快速染色試劑盒（深圳華康生物醫(yī)學(xué)），高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)beckman 公司)，Gallios 流式細(xì)胞儀(美國(guó)beckman 公司)。

1.4 標(biāo)本采集 本研究受試者均在禁欲3～7 d 后，收集精液于消毒的廣口無(wú)菌容器內(nèi)，37 ℃恒溫液化后，采用HT-IVOSII 型（美國(guó)Hamilton Thorne 公司） 全自動(dòng)精液分析系統(tǒng)檢查精子的常規(guī)參數(shù)及運(yùn)動(dòng)參數(shù)。 同時(shí)使用巴氏染色法，鏡下檢查精子形態(tài)和畸形率，并進(jìn)行精子計(jì)數(shù)。隨機(jī)選取正常人50例、輕度弱精癥42 例及中度弱精癥34 例樣品，進(jìn)行以下處理：向精液樣本中緩慢加入PMSF(終濃度為0.2 mmol/L )，室溫下10 000 r/min 離心10 min，底層沉淀即為精子, 上清為精漿；向精子沉淀中按洗滌緩沖液1∶1 比例緩慢加入洗滌緩沖液，室溫下10 000 r/min 離心10 min，緩沖液洗滌2 次；向沉淀中加入150~200 μL 細(xì)胞裂解液，置低溫超聲細(xì)胞破碎10 次，每次5 s，低溫孵育1 h，放置低溫離心機(jī)，40 C，12 000 r/min 離心20 min，取離心上清液，即為精子總蛋白提取物，按150 μL/管將提取物凍存深低溫冰箱（-800 C）中以備用。

1.5 采用Western blot 法檢測(cè)精子Pim2/c-Myc 蛋白的表達(dá) 從低溫冰箱（-80 ℃冰箱）中取出標(biāo)本，按照標(biāo)本蛋白濃度調(diào)整取樣量，以GAPDH 蛋白做為內(nèi)參，恒壓電泳（電壓設(shè)置為80v）1.5 h~2.0 h，蛋白濃縮膠擴(kuò)散結(jié)束進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為100 V，恒壓電泳2 h；切取目的蛋白部分電泳膠，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上； 室溫脫脂奶粉封閉2 h； 以Pim2/c-Myc 抗體(兔源，用封閉液1∶500)和GAPDH 抗體為第一抗體，HRP-山羊抗兔IgG(1∶3000)為第二抗體，進(jìn)行孵育；漂洗PVDF 膜，加入ECL 發(fā)光液，采用核酸蛋白分析儀進(jìn)行分析，Pim2/c-Myc 與GAPDH蛋白的比值作為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析樣本表達(dá)量。

1.6 采用熒光探針測(cè)定精子ROS 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，將三組（正常組、輕度弱精癥和中度弱精癥）精液分別取15 例樣本，10 000 r/min 離心10~15 min，取離心沉淀物按緩沖液1：1 的比例洗滌； 室溫下10 000 r/min 離心10~15 min，洗滌5 次，顯微計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106。 根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作步驟調(diào)整活性氧熒光探針DCFH-DA 濃度，使終濃度為10 μmol/L )，37 ℃避光孵育1 h。磷酸鹽緩沖液洗滌標(biāo)本3~5 次， 以使細(xì)胞的DCFHDA 充分除去。 熒光顯微鏡下觀察并采用流式細(xì)胞儀對(duì)活性氧進(jìn)行定量檢測(cè)[13]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示，中度組、輕度組與正常對(duì)照組分別進(jìn)行比較，采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精液常規(guī)參數(shù) 正常組與弱精癥組精液的常規(guī)檢查結(jié)果，見(jiàn)表1。 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，弱精子癥患者年齡、精液pH 值、精子的形態(tài)及精子密度等指標(biāo)無(wú)明顯差別(P>0.05)。然而，各弱精癥組A 級(jí)精子百分比和A+B 級(jí)精子百分比與正常組相比有顯著差異(P＜0.05)，且這些指標(biāo)改變與弱精子癥的嚴(yán)重程度相關(guān)(P＜0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 正常人與弱精癥患者精液常規(guī)參數(shù)

2.2 Western blot 法檢測(cè)Pim2/c-Myc 蛋白表達(dá)水平 Western blot 分析提示輕度弱精癥組及中度弱精癥組Pim2/c-Myc 蛋白的表達(dá)量均較正常對(duì)照組顯著增多， 而且這些蛋白的表達(dá)量與弱精子癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1—圖2。

圖1 弱精癥Pim2/c-Myc 蛋白的表達(dá)

圖2 Western Blot 檢測(cè)Pim2/c-Myc 的定量結(jié)果

2.3 弱精癥精子活性氧含量的增加 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，同正常組比較，輕度及中度弱精癥組精子活性氧含量明顯增加， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而且隨著弱精癥程度的加重，這種變化與Pim2/c-Myc 含量的變化是呈正相關(guān)的，見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)精子ROS 的定量結(jié)果

3 討論

最近研究報(bào)道， 不育男性存在的共同特征—睪丸組織的氧化應(yīng)激損傷， 它也許是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一[14]。 氧化應(yīng)激指的是當(dāng)機(jī)體在受到各種有害刺激時(shí)， 體內(nèi)高活性分子如ROS 產(chǎn)生過(guò)多，氧化物不能被徹底地清除，氧化和抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)失衡，導(dǎo)致組織器官的損傷。 精子活動(dòng)力與ROS 具有明顯相關(guān)性，ROS 是人體代謝產(chǎn)生的具有較強(qiáng)氧化能力的活性物質(zhì)總稱。 精子中產(chǎn)生的ROS 主要為O2-， 通過(guò)歧化反應(yīng)生成過(guò)氧化氫(H2O2)， 其濃度對(duì)精子活動(dòng)力的作用機(jī)制主要表現(xiàn)在兩方面。 其一，在理化因素的刺激下，ROS 產(chǎn)生過(guò)量會(huì)破壞精子及精漿的抗氧化防御系統(tǒng)， 引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而損傷精子的結(jié)構(gòu)與功能，尤其會(huì)造成線粒體膜的損傷及精子DNA 損傷等[15]。 其二，生理水平的ROS 在激素的產(chǎn)生、精子獲能、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 頂體反應(yīng)和精子運(yùn)動(dòng)能力等方面均發(fā)揮重要的作用。

c-myc 是一種常見(jiàn)的原癌基因， 有統(tǒng)計(jì)顯示，在約20%的癌癥人群中處于活化狀態(tài)。 通過(guò)招募組蛋白乙酰酶、 一些轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)調(diào)控蛋白等一系列途徑也發(fā)現(xiàn)，c-myc 參與了從果蠅到人類等高等生物細(xì)胞基因組中15%基因的調(diào)控。 真核生物的細(xì)胞周期是由許多調(diào)控因子的結(jié)合與激活來(lái)調(diào)控的， 在細(xì)胞周期的發(fā)展中起到關(guān)鍵點(diǎn)作用的是G1 期的調(diào)控，c-myc 在多個(gè)水平上對(duì)該關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控。 研究顯示，c-myc 在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，如肺癌、前列腺癌，乳腺癌等，在低分化腫瘤中，c-myc 高表達(dá)尤為明顯。pim 家族包括pim1，pim2 和pim3， 屬于序列上具有很高同源性的鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶。pim 蛋白激酶可通過(guò)增強(qiáng)致癌c-myc 和Ras 的活性而促進(jìn)轉(zhuǎn)化， 其在腫瘤發(fā)生過(guò)程中驅(qū)動(dòng)顯著的代謝變化。 有研究證明在缺乏pim 蛋白激酶，三重敲除（TKO）的所有三種同種型的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）不能耐受活化的K-Ras（K-RasG12V）的表達(dá)并經(jīng)歷細(xì)胞死亡。 將K-RasG12V 轉(zhuǎn)導(dǎo)到這些細(xì)胞中顯著增加了細(xì)胞活性氧（ROS）的水平。 有研究表明pim2 激酶在許多生理病理過(guò)程中通過(guò)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)錄因子和蛋白質(zhì)翻譯等。特異地在人、 小鼠和大鼠的睪丸組織中高表達(dá)，與X 染色體的失活密切相關(guān)[16]。

我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):pim2/c-myc 在男性弱精癥睪丸組織中表達(dá)增高， 生精細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶活性升高，而乳酸脫氫酶活性、丙二醛含量降低, 提示有誘導(dǎo)生精細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。 據(jù)此我們提出假說(shuō)：pim2/c-myc 抑制Nrf2 表達(dá)過(guò)量ROS，精子中產(chǎn)生的ROS 主要為O2-，通過(guò)歧化反應(yīng)可產(chǎn)生過(guò)氧化氫，導(dǎo)致睪丸生精細(xì)胞氧化應(yīng)激。在前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，本研究增加樣本量，進(jìn)一步探討pim2/c-myc 參與弱精癥生精細(xì)胞氧化應(yīng)激中的機(jī)制， 顯示精子pim2/c-myc 蛋白的表達(dá)與弱精癥有密切相關(guān)性， 免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明弱精癥患者特別是中度弱精癥患者精子pim2/c-myc 蛋白表達(dá)明顯升高。 為進(jìn)一步研究弱精癥pim2/c-myc蛋白和活性氧的相關(guān)性， 同免疫印跡相平行地運(yùn)用ROS 熒光探針檢測(cè)了精子ROS 的變化情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組對(duì)比，弱精癥組精子ROS 含量明顯升高，且升高與弱精癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。通過(guò)對(duì)精子pim2/c-myc 蛋白的表達(dá)量及ROS 水平的研究，驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)的最初設(shè)想：弱精癥患者精子pim2/c-myc 蛋白高表達(dá)伴隨著活性氧含量的增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷及精子活力下降，可能是弱精癥發(fā)病的分子機(jī)制之一。