張新月 劉晨萌 馬瑜徽 孟楠 蔣景英 余小河 王曉莉

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，山東濰坊 261053；2.北京航空航天大學(xué)，北京 100191；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南長沙 410008）

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是圍生期常見的嚴(yán)重疾病，可導(dǎo)致癲癇、永久性認(rèn)知和神經(jīng)功能障礙等并發(fā)癥［1］，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。氧化應(yīng)激在缺氧缺血 性 腦 損 傷 （hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）中發(fā)揮重要作用［2］，鐵死亡作為氧化應(yīng)激依賴性的新型程序性細(xì)胞死亡，不同于細(xì)胞凋亡、自噬和焦亡，多由鐵積累和谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的丟失誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化引起［3］。有研究表明，新生大鼠缺氧缺血可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元鐵死亡，引起HIBD［4］，但其發(fā)生鐵死亡的具體機(jī)制尚待闡明。硫氧還原蛋白-1（thioredoxin-1，Trx-1）作為抗氧化劑，可以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，在清除脂質(zhì)活性氧和還原氧化蛋白方面發(fā)揮重要作用［5］。已有研究表明Trx-1 在抑制帕金森病相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡中起關(guān)鍵性作用，可上調(diào)GPX4表達(dá)參與調(diào)控鐵死亡［6］。硫氧還原蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）是硫氧還原蛋白系統(tǒng)的內(nèi)源性抑制劑，可結(jié)合并負(fù)調(diào)控Trx-1，抑制其氧化還原調(diào)節(jié)能力，從而引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞死亡［7-8］。缺氧缺血（hypoxia-ischemia，HI）后是否通過TXNIP/Trx-1/GPX4通路導(dǎo)致鐵死亡，從而導(dǎo)致HIBD，目前尚不清楚。因此，本研究通過建立HIBD模型，觀察造模后海馬TXNIP/Trx-1/GPX4通路諸分子及鐵死亡的變化，并于側(cè)腦室注射TXNIP 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），沉默上游信號分子TXNIP mRNA的表達(dá)，觀察下游信號分子及鐵死亡的變化，從而探討HI后腦神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生機(jī)制，以期為HIE的臨床診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級7 日 齡Sprague-Dawley 新 生 大 鼠72 只［SCXK（魯）20190003，山東省濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司］，雌雄不限，平均體重（11.8±1.5）g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n=30）、HIBD 組（n=30） 及siRNA （TXNIP siRNA） 組（n=12）。假手術(shù)組與HIBD組根據(jù)造模后時間分為6 h、24 h、72 h 及7 d 4 個亞組，行Western blot 法檢測（n=3）；造模后24 h，假手術(shù)組與HIBD 組行激光散斑成像、組織切片檢測（n=6）；假手術(shù)組、HIBD組及siRNA組行組織鐵、血清鐵測定（n=4），實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）檢測（n=4）和Western blot法檢測（n=4）。

1.2 HIBD 模型的建立

采用經(jīng)典的Rice-Vannucci 法建立HIBD 模型［9］。7日齡新生大鼠乙醚吸入麻醉后，剪開頸部正中皮膚，分離損傷（右）側(cè)頸總動脈，電凝筆（RS-300，Roboz 公司，美國）電凝，消毒并縫合皮膚，置于低氧艙（DYC-Ⅲ，武漢七〇一研究所）內(nèi)缺氧（氧艙氧濃度8.0%±0.1%，溫度37℃）2 h，實驗過程中全程監(jiān)測，后放回母鼠籠中喂養(yǎng)。HIBD組與siRNA 組大鼠均建立HIBD 模型，假手術(shù)組大鼠僅分離右側(cè)頸總動脈，不予電凝及缺氧處理。

1.3 顱骨表面血流量測定

造模后24 h，HIBD 組和假手術(shù)組新生大鼠乙醚吸入麻醉后，手術(shù)剪沿頭背部正中縱向剪開皮膚，暴露顱骨，將新生大鼠置于激光散斑成像臺內(nèi)，調(diào)整焦距使圖像清晰。采用moorO2Flo 組織血流血氧實時成像系統(tǒng)觀察新生大鼠腦血流量，激光檢視光源，前囟到“人”字點設(shè)置感興趣區(qū)（region of interest，ROI）［10］，觀察過程中可滴入丙三醇保持顱骨表面濕潤。通過系統(tǒng)將原始散斑圖像轉(zhuǎn)換成腦血流圖像并計算ROI腦血流量。

1.4 側(cè)腦室注射TXNIP siRNA

siRNA組新生大鼠固定于立體定位儀上，正中剪開頭皮，于損傷側(cè)側(cè)腦室（坐標(biāo)AP：-0.5 mm，ML：-2 mm，DV：-2 mm）緩慢注入3 μL TXNIP siRNA 與轉(zhuǎn)染試劑混合液［11］，1 μL/min 緩慢注入，留針2 min后拔針縫合頭皮，復(fù)溫蘇醒后回母鼠身邊飼養(yǎng)。假手術(shù)組與HIBD組于相同部位注射3 μL 0.9%氯化鈉溶液。

1.5 標(biāo)本的采集與處理

造模后24 h，3 組新生大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉15 mg/kg，分別取血清和損傷側(cè)海馬組織，放至-80℃冰箱凍存，行血清鐵含量、組織鐵含量、Western blot及qPCR檢測；另行常規(guī)心臟灌注取腦組織，4%多聚甲醛后固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，浸蠟、石蠟包埋，取海馬層面腦組織行冠狀位連續(xù)切片，厚度為4 μm，每3~5 張切片取1 張切片，分別行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色、免疫熒光染色。

1.6 HE染色

石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，采用HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，G1120）染色，行蘇木精染核10 min后，鹽酸酒精分色30 s，去離子水沖洗，伊紅染液染漿2 min，無水乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)改變。

1.7 Western blot 法檢測新生大鼠損傷側(cè)海馬組織TXNIP、Trx-1及GPX4蛋白表達(dá)

造模后6 h、24 h、72 h 及7 d，Western blot 法檢測造模后新生大鼠損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)。造模后24 h，Western blot 法檢測造模后新生大鼠損傷側(cè)海馬組織TXNIP、Trx-1 蛋白表達(dá)。提取新生大鼠損傷側(cè)海馬組織，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，PC0020）測定蛋白濃度。制備12%SDS-PAGE分離膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入兔抗TXNIP、Trx-1、GPX4 （濃 度 均 為1∶500）， 鼠 抗GAPDH（Proteintech，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，濃度1∶10 000）一抗后，4℃冰箱過夜。次日，分別加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗。使用高性能成像系統(tǒng)（Protein Simple，美國） 曝光并拍照，采用Image J進(jìn)行灰度值測定。

1.8 免疫熒光染色法檢測新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞TXNIP、Trx-1及GPX4蛋白表達(dá)

造模后24 h，石蠟切片，脫蠟、水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，0.3%TritonX-100透膜，5%BSA-PBS封閉1 h 后，加入兔抗GPX4（1∶200，Affinity，英國）與鼠抗NeuN（1∶200，Chemicon，美國）一抗混合液或兔抗GPX4（1∶200，Affinity，英國）與鼠抗GFAP（1∶200，武漢博士德生物工程有限公司） 一 抗 混合液、兔抗Trx-1 （1∶200，Cell Signaling Technology， 美 國）、 兔 抗 TXNIP（1∶200，Affinity，英國），4℃冰箱過夜。次日37℃孵育箱復(fù)溫，0.01M PBS 洗滌3 遍后，滴加Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG （1∶200）、Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶200）熒光二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）混合液，37℃避光孵育1 h 后PBS 沖洗，含4'，6-二脒基-2-苯 基 吲 哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的熒光封片劑（F6507，Sigma，美國）封片。置于正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照并統(tǒng)計各組損傷側(cè) 海 馬CA1 區(qū)NeuN+GPX4+/NeuN+、 GFAP+GPX 4+DAPI+、TXNIP+DAPI+、Trx-1+DAPI+細(xì)胞數(shù)。

1.9 血清鐵測定

造模后24 h，3組取新生大鼠上層清亮血清，采用血清鐵測定試劑盒（A039-1-1，南京建成生物工程研究所），加入鐵顯色劑，取上清液置于96孔板中，酶標(biāo)儀在520 nm波長下測定各孔吸光度OD值。

1.10 損傷側(cè)海馬組織鐵測定

造模后24 h，采用組織鐵含量測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，BC4355）測定新生大鼠損傷側(cè)海馬組織鐵含量。3組分別稱取損傷側(cè)海馬組織，以1 g/mL 比例加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿。5 952 r/min，4℃離心10 min，取上清120 μL，加入組織鐵試劑，后加入60 μL 氯仿，充分震蕩混勻，室溫下10 000 r/min 離心10 min，吸取上層無機(jī)相200 μL置于96孔板，酶標(biāo)儀在520 nm波長下測定吸光度。組織鐵含量計算公式：每克組織中鐵 含 量（μg/g） =6.98× ΔA 測 定（定 義 為0.125 μmol/mL Fe3+標(biāo)準(zhǔn)液吸光度A-蒸餾水吸光度A）÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)（定義為樣本吸光度A-蒸餾水吸光度A）÷樣本質(zhì)量（g）。

1.11 qPCR 檢測新生大鼠損傷側(cè)海馬組織TXNIP、Trx-1、GPX4 mRNA表達(dá)

3組分別取新生大鼠損傷側(cè)海馬組織，提取樣本總RNA，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，采用Bio Rad CFX Manager熒光定量PCR儀，SYBR Green 熒光染料法進(jìn)行相對定量。采用20 μL體 系，加 入cDNA 模 板1 μL、無 酶 水7.8 μL、SYBR Premix 熒光定量反應(yīng)試劑10 μL，上游、下游引物各0.6 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，PCR 反應(yīng) 階段：95℃變 性10 s，60℃退 火10 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40 次，結(jié)果以Cq 值表示，采用2-△△Cq法比較TXNIP、Trx-1、GPX4 mRNA 在各組新生大鼠損傷側(cè)海馬組織中表達(dá)的差異。

引 物 序 列 為： GAPDH： 上 游（5'-3'）：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC， 下 游 （5'-3'）：TTTGAGGGTGCAGCGAACTT；TXNIP：上游（5'-3'）：CATGTTCCCGAATCGTGGTC，下游（5'-3'）：CTTGGAGCCAGGGACACTAA；Trx-1：上游（5'-3'）：AAGGAAGCTTTTCAGGAGGC，下游（5'-3'）：GGCAGTCATCCACGTCTACT；GPX4：上 游（5'-3）：AATTCGCAGCCAAGGACATC，下游（5'-3）：AGGCCAGGATTCGTAAACCA。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后24 h，新生大鼠損傷側(cè)腦血流量變化

造模后24 h，假手術(shù)組新生大鼠可維持一定的腦血流量；HIBD組損傷側(cè)ROI腦血流量急劇下降，低于假手術(shù)組［（687±75）PU vs（1 432±99）PU，t=14.654，P<0.001］。見圖1。

圖1 造模后24 h，新生大鼠損傷側(cè)腦血流量變化

2.2 造模后24 h，新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

造模后24 h，假手術(shù)組新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列緊密整齊，形態(tài)規(guī)則；HIBD組新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列疏松紊亂，形態(tài)不規(guī)則。見圖2。

圖2 造模后24 h，新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2.3 造模后，新生大鼠損傷側(cè)海馬組織TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表達(dá)水平變化

造模后6 h，HIBD 組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白表達(dá)水平低于假手術(shù)組（P<0.05）；造模后24 h，HIBD 組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白表達(dá)水平低于造模后6 h（P<0.05）；造模后72 h、7 d，HIBD 組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白表達(dá)水平高于造模后24 h（P<0.05）；造模后各時間點，HIBD 組GPX4蛋白表達(dá)水平均低于假手術(shù)組（均P<0.05），見圖3、表1。造模后24 h，siRNA 組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白、Trx-1 蛋白表達(dá)水平高于HIBD 組，但低于假手術(shù)組（均P<0.05）；HIBD組損傷側(cè)海馬組織GPX4 蛋白、Trx-1 蛋白表達(dá)水平低于假手術(shù)組；HIBD 組、siRNA 組損傷側(cè)海馬組織TXNIP 蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，且siRNA組TXNIP蛋白表達(dá)水平低于HIBD組（均P<0.05）。見圖4、表2。

圖3 各組新生大鼠造模后不同時間點損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)條帶圖

表1 新生大鼠造模后不同時間點損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)水平比較 （± s，n=3）

表1 新生大鼠造模后不同時間點損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)水平比較 （± s，n=3）

注：a示與同組造模后6 h相比，P<0.05；b示與同組造模后24 h相比，P<0.05；c示與同組造模后72 h相比，P<0.05。［HIBD］缺氧缺血性腦損傷；［GPX4］谷胱甘肽過氧化物酶4。

組別假手術(shù)組HIBD組t值P值造模后6 h 1.016±0.025 0.716±0.011 19.219<0.001造模后24 h 1.016±0.018 0.650±0.017a 25.595<0.001造模后72 h 1.011±0.025 0.813±0.046b 6.625 0.003造模后7 d 1.105±0.021a,b,c 0.858±0.032b 11.155<0.001 F值12.478 30.021 P值0.002<0.001

表2 造模后24 h，3組新生大鼠損傷側(cè)海馬組織GPX4、TXNIP、Trx-1蛋白表達(dá)水平比較 （± s，n=4）

表2 造模后24 h，3組新生大鼠損傷側(cè)海馬組織GPX4、TXNIP、Trx-1蛋白表達(dá)水平比較 （± s，n=4）

注：a 示與假手術(shù)組相比，P<0.05；b 示與HIBD 組相比，P<0.05。［HIBD］ 缺氧缺血性腦損傷；［siRNA］ 小干擾RNA；［TXNIP］硫氧還原蛋白互作蛋白；［Trx-1］硫氧還原蛋白-1；［GPX4］谷胱甘肽過氧化物酶4。

組別假手術(shù)組HIBD組siRNA組F值P值TXNIP 0.494±0.037 0.802±0.022a 0.619±0.019a,b 126.911<0.001 Trx-1 1.317±0.056 0.801±0.030a 1.167±0.058a,b 113.510<0.001 GPX4 1.001±0.018 0.850±0.022a 0.932±0.034a,b 35.256<0.001

2.4 造模后24 h，新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表達(dá)水平變化

NeuN 是神經(jīng)元標(biāo)志物，GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。造模后24 h，HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1區(qū)NeuN+GPX4+/NeuN+低于假手術(shù)組（P<0.05）；假手術(shù)組、HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)均幾乎未見GFAP+GPX4+細(xì)胞。HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)TXNIP+細(xì)胞數(shù)高于假手術(shù)組（P<0.05）；HIBD組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)Trx-1+細(xì)胞數(shù)低于假手術(shù)組（P<0.05）。見圖5~8，表3。

表3 造模后24 h，損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表達(dá)水平比較 （± s，n=6）

表3 造模后24 h，損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TXNIP、Trx-1、GPX4蛋白表達(dá)水平比較 （± s，n=6）

注：［NeuN］神經(jīng)元核抗原；［GPX4］谷胱甘肽過氧化物酶4；［TXNIP］硫氧還原蛋白互作蛋白；［Trx-1］硫氧還原蛋白-1；［DAPI］4',6-二脒基-2-苯基吲哚；［HIBD］缺氧缺血性腦損傷。

組別假手術(shù)組HIBD組t值P值NeuN+GPX4+/NeuN+0.157±0.008 0.046±0.006 27.081<0.001 TXNIP+DAPI+(個/mm2)99.2±13.2 265.0±33.6 12.141<0.001 Trx-1+DAPI+(個/mm2)206.1±28.0 102.3±10.6 9.174<0.001

圖5 造模后24 h，新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中鐵死亡的變化

2.5 3 組新生大鼠血清及損傷側(cè)海馬組織鐵含量變化

造模后24 h，HIBD 組與siRNA 組血清鐵、損傷側(cè)海馬組織鐵含量均高于假手術(shù)組；siRNA組血清鐵、損傷側(cè)海馬組織鐵含量均低于HIBD組（均P<0.05）。見表4。

表4 3組血清鐵及損傷側(cè)海馬組織鐵含量比較（± s，n=4）

表4 3組血清鐵及損傷側(cè)海馬組織鐵含量比較（± s，n=4）

注：a 示與假手術(shù)組相比，P<0.05；b 示與HIBD 組相比，P<0.05。［HIBD］缺氧缺血性腦損傷；［siRNA］小干擾RNA。

組別假手術(shù)組HIBD組siRNA組F值P值血清鐵(mg/L)3.103±0.092 4.529±0.216a 4.245±0.186a,b 75.811<0.001組織鐵(μg/g)1.663±0.134 2.183±0.096a 1.845±0.037a,b 29.062<0.001

2.6 3 組新生大鼠海馬組織TXNIP、Trx-1、GPX4 mRNA表達(dá)水平變化

造模后24 h，HIBD 組與siRNA 組損傷側(cè)海馬組織TXNIP mRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組；siRNA組TXNIP mRNA 表達(dá)水平低于HIBD 組（均P<0.05）。HIBD 組損傷側(cè)海馬組織Trx-1、GPX4 mRNA表達(dá)水平低于假手術(shù)組，siRNA組損傷側(cè)海馬組織Trx-1、GPX4 mRNA 表達(dá)水平高于HIBD 組（均P<0.05）。見表5。

表5 造模后24 h，3組損傷側(cè)海馬組織各mRNA表達(dá)水平比較 （±s，n=4）

表5 造模后24 h，3組損傷側(cè)海馬組織各mRNA表達(dá)水平比較 （±s，n=4）

注：a 示與假手術(shù)組相比，P<0.05；b 示與HIBD 組相比，P<0.05。［HIBD］ 缺氧缺血性腦損傷；［siRNA］ 小干擾RNA；［GPX4］ 谷胱甘肽過氧化物酶4；［Trx-1］ 硫氧還原蛋白-1；［TXNIP］硫氧還原蛋白互作蛋白。

組別假手術(shù)組HIBD組siRNA組F值P值GPX4 mRNA 0.032±0.002 0.014±0.002a 0.018±0.002a,b 67.677<0.001 Trx-1 mRNA 0.314±0.035 0.199±0.005a 0.246±0.013a,b 27.699<0.001 TXNIP mRNA 0.005±0.001 0.011±0.001a 0.008±0.001a,b 39.289<0.001

圖6 造模后24 h，新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞中鐵死亡的變化

圖7 造模后24 h，新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中TXNIP 蛋白表達(dá)的變化

圖8 造模后24 h，新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞中Trx-1蛋白表達(dá)的變化

3 討論

最新研究表明，鐵死亡是一種新型程序性細(xì)胞死亡，與HIBD密切相關(guān)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)造模后24 h，激光散斑成像結(jié)果顯示HIBD 組新生大鼠損傷側(cè)腦血流量低于假手術(shù)組，提示HIBD新生大鼠模型損傷側(cè)頸總動脈血流已阻斷；HE 染色結(jié)果顯示，新生大鼠損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，均提示HIBD模型建立成功。

本研究還發(fā)現(xiàn)HIBD組血清鐵、損傷側(cè)海馬組織鐵含量均高于假手術(shù)組，提示HI 后新生大鼠血液及組織中鐵含量超載可能導(dǎo)致鐵死亡。

GPX4是鐵死亡關(guān)鍵蛋白［13］。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模后各時間點HIBD 組損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)水平均低于假手術(shù)組，造模后24 h，HIBD組損傷側(cè)海馬組織GPX4蛋白表達(dá)水平較低，且低于造模后其他時間點，提示HI后可致GPX4蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致鐵死亡，這與文獻(xiàn)［14］報道一致，但HI 后海馬CA1 區(qū)鐵死亡的細(xì)胞定位尚不清楚。本研究采用NeuN/GPX4、GFAP/GPX4 免疫熒光雙標(biāo)染色，結(jié)果顯示造模后24 h，HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)NeuN+GPX4+/NeuN+低于假手術(shù)組，假手術(shù)組和HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)幾乎未見GFAP+GPX4+細(xì)胞，提示HI后，鐵死亡主要發(fā)生在海馬神經(jīng)元。

TXNIP 是Trx-1 的抑制劑，可與其結(jié)合并抑制Trx-1 的抗氧化功能，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，但TXNIP/Trx-1通路是否與HI后海馬神經(jīng)元鐵死亡相關(guān)尚不清 楚［15-16］。本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 造 模 后24 h，qPCR 與Western blot 結(jié)果提示HIBD 組損傷側(cè)海馬組織TXNIP mRNA 與蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，Trx-1、GPX4 mRNA與蛋白表達(dá)水平均低于假手術(shù)組，提示HI 可上調(diào)信號分子TXNIP 的表達(dá)，進(jìn)而抑制Trx-1、GPX4蛋白表達(dá)，導(dǎo)致鐵死亡。免疫熒光染色結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，HIBD 組損傷側(cè)海馬CA1 區(qū)TXNIP+細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組增多，Trx-1+細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組減少，進(jìn)一步說明HI 可通過TXNIP/Trx-1/GPX4通路調(diào)控鐵死亡。

為驗證HI 能否通過激活TXNIP/Trx-1/GPX4 通路導(dǎo)致新生大鼠鐵死亡，本研究采用損傷側(cè)側(cè)腦室注射TXNIP siRNA法干擾TXNIP基因表達(dá)，造模后24 h，siRNA組血清鐵、損傷側(cè)海馬組織鐵含量均低于HIBD 組，表明沉默TXNIP基因可抑制HIBD 新生大鼠血液中鐵超載及損傷側(cè)海馬組織鐵死亡。qPCR 和Western blot 檢測結(jié)果顯示，siRNA組損傷側(cè)海馬組織TXNIP mRNA 及蛋白表達(dá)水平低于HIBD 組，Trx-1、GPX4 mRNA 及蛋白表達(dá)水平高于HIBD 組，說明沉默TXNIP基因可調(diào)控HIBD 新生大鼠TXNIP 下游因子Trx-1、GPX4基因及其蛋白表達(dá)變化，引起鐵死亡，導(dǎo)致HIBD。

綜上，新生大鼠HI 通過激活TXNIP/Trx-1/GPX4通路，誘發(fā)新生大鼠海馬神經(jīng)元鐵死亡，進(jìn)而導(dǎo)致HIBD。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。