歐偉明 何龍楷 王曉鈺 楊雪松 王廣 李冰肖 金雅 韓莎莎 柳國勝

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科，廣東廣州 510632；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)系，廣東廣州 510632）

大腦皮質(zhì)的發(fā)育是神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSC）分化發(fā)育和成熟的過程［1-2］。NSC不斷進行增殖和凋亡，非對稱性分裂而來的子細胞在特定部位分化為具有層特異性表型的神經(jīng)元并逐漸成熟，最終形成大腦皮質(zhì)的各層神經(jīng)元，這些不同層次的神經(jīng)元擁有各自獨特的形態(tài)特征和電生理特性，共同維系著大腦皮質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能［3-5］。

動物模型體內(nèi)靶向調(diào)控大腦皮質(zhì)NSC 基因表達是研究基因?qū)Υ竽X皮質(zhì)發(fā)育影響的重要方法，目前體內(nèi)調(diào)控基因表達主要有以下幾種方法：模式動物構(gòu)建、腺相關(guān)病毒外源基因?qū)牒妥訉m內(nèi)電穿孔（in uteroelectroporation，IUE）技術(shù)等［6］。由于部分基因改變可導(dǎo)致胚胎死亡，因此無法進行模式動物構(gòu)建，而腺相關(guān)病毒外源基因?qū)胄枰辽?周的時間才可穩(wěn)定表達載體蛋白，因而不適用于部分胚胎發(fā)育學(xué)的研究。IUE技術(shù)是一種利用電穿孔技術(shù)注射DNA 質(zhì)粒，將基因引入子宮內(nèi)胚胎特定位置以便靶向調(diào)控目的基因表達的技術(shù)。IUE 技術(shù)誕生于20 世紀(jì)80 年代，是體內(nèi)研究胚胎神經(jīng)發(fā)育與基因功能的一種重要手段，通過調(diào)整電極的結(jié)構(gòu)和方向，可以轉(zhuǎn)染腦組織不同部位的神經(jīng)元（如大腦皮質(zhì)、海馬、腦干和小腦等），具有時間和空間的可調(diào)控性［7］。

在進行大腦皮質(zhì)發(fā)育相關(guān)研究時，可利用IUE技術(shù)將質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入鼠胚側(cè)腦室，電脈沖在細胞膜上產(chǎn)生瞬時孔隙，使質(zhì)粒DNA 進入大腦皮質(zhì)NSC，從而靶向調(diào)控發(fā)育中的鼠胚大腦皮質(zhì)區(qū)域的基因表達，可用于NSC 的增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和神經(jīng)元成熟等體內(nèi)研究［8］，對神經(jīng)發(fā)生的研究具有重要價值。與其他體內(nèi)靶向調(diào)控基因表達技術(shù)相比，IUE技術(shù)靶向調(diào)控大腦皮質(zhì)NSC 基因表達的優(yōu)勢還在于，質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入胚胎側(cè)腦室24 h 后即可在NSC 穩(wěn)定表達載體蛋白，從而迅速觀察到靶基因?qū)SC分化發(fā)育的影響［6］。

盡管利用IUE技術(shù)進行鼠胚大腦皮質(zhì)發(fā)育的研究在國外已得到應(yīng)用，但國內(nèi)目前對該技術(shù)的應(yīng)用尚處于探索階段。本研究詳細闡述如何利用IUE技術(shù)觀察大腦皮質(zhì)NSC 的增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和神經(jīng)元成熟，以期為國內(nèi)學(xué)者深入開展大腦皮質(zhì)神經(jīng)發(fā)生的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡C57BL/6J小鼠購于北京華阜康生物科技有限公司［SCXK（京）-2019-0008］，動物飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實驗動物中心［SYXK （粵） -2017-0174］。雄性小鼠1只，雌性小鼠7只，將2~3只雌性小鼠和1只雄性小鼠在同一籠里合籠過夜，次日早上檢查陰道精栓（陰道精栓呈淡黃色）觀察到陰道精栓的當(dāng)天即定義為孕0.5 d。所有操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求（IACUC-20210807-03）。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：ECM399胚胎電轉(zhuǎn)儀（BTX，美國）。試劑：綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP，ab13970，1∶1 000）、性別決定基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄 因 子 2 （SRY-related HMG box-containing transcription factor-2，Sox2，ab97959，1∶200）、T型盒結(jié)構(gòu)域神經(jīng)元蛋白2（T-box brain protein 2，Tbr2，ab23345，1∶100）、染色質(zhì)重塑復(fù)合物亞基蛋 白2 （chromatin remodeling complex subunit，Ctip2，ab18465，1∶200）、熒光二抗（1∶500）抗體均購自美國Abcam公司，多同源復(fù)合物蛋白3（polyhomeotic homolog 3，pH3，1∶400，9713）、剪切半胱天冬酶3（cleaved caspase-3，CC3，9661，1∶200）抗體均購自Cell Signaling Technology公司，4', 6- 二 脒 基-2- 苯 基 吲 哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，1∶1 000，C1002，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），質(zhì)粒去內(nèi)毒素中提試劑盒（9783S，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，中國），pCIG質(zhì)粒（P24992，武漢淼靈生物科技有限公司，中國）。

1.3 IUE實驗

（1）麻醉、備皮、消毒、鋪巾：稱量孕14.5 d孕鼠體重，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg，將孕鼠放置在37℃恒溫加熱板上，在以臍為中心約4 cm×4 cm方形區(qū)域上進行術(shù)前脫毛備皮，使用碘伏消毒手術(shù)區(qū)域3 次，在手術(shù)區(qū)域放置無菌手術(shù)單，完全覆蓋孕鼠。（2）暴露子宮：用剪刀在腹部切開約2 cm 手術(shù)切口，在切口周圍放置無菌紗布，并用加熱至37℃的0.9%氯化鈉溶液濕潤紗布，用鑷子暴露出子宮，將子宮放置在紗布上（圖1A）。（3）側(cè)腦室內(nèi)質(zhì)粒注射：輕柔地用左手拇指和食指穩(wěn)定胚胎（胚胎在羊膜袋中是可移動旋轉(zhuǎn)的，調(diào)整合適的位置以準(zhǔn)確地注射質(zhì)粒至腦室內(nèi)，在操作時注意不要損壞胎盤和血管，這對胚胎后續(xù)的存活非常重要）。在胚胎眼球上方約2 mm處可見透明側(cè)腦室，用微毛細玻璃管，輕輕戳入側(cè)腦室，術(shù)者會有2次輕微的落空感（對應(yīng)于毛細玻璃管穿過子宮，然后穿過胚胎的皮膚和顱骨），使用嘴式顯微注射管注入0.2~0.3 μL 混綠色染料（固綠）的質(zhì)粒DNA 至胚胎側(cè)腦室中，若側(cè)腦室由透明變?yōu)榫G色則說明注射成功（圖1B），質(zhì)粒濃度范圍為1 μg/μL（單一質(zhì)粒）至2 μg/μL（混合質(zhì)粒）。（4）電轉(zhuǎn)：將ECM399胚胎電轉(zhuǎn)儀電極夾的正極放在質(zhì)粒注射側(cè)，將負極放在胚胎頭的另一側(cè)，然后按下電擊按鈕，直至電穿孔完全結(jié)束（圖1C）。在電穿孔過程中可見胚胎的輕微收縮運動。電轉(zhuǎn)條件為：電壓40 V，脈沖5 次［7，9-10］；當(dāng)一側(cè)的所有胚胎都被電轉(zhuǎn)后，小心將子宮放回腹腔內(nèi)，開始電轉(zhuǎn)另一側(cè)。（5）術(shù)后縫合及觀察：胚胎電轉(zhuǎn)結(jié)束后進行手術(shù)切口縫合，將孕鼠放回鼠籠里。鼠籠下放置37℃恒溫加熱墊保證手術(shù)后孕鼠的體溫恒定，手術(shù)后15 min，孕鼠應(yīng)在鼠籠中自發(fā)活動。本實驗取7 只孕鼠，每只孕鼠電轉(zhuǎn)2~4 個胚胎，設(shè)為電轉(zhuǎn)組，余下未進行電轉(zhuǎn)操作的胚胎作為對照組。

圖1 子宮內(nèi)電穿孔操作示意圖

1.4 腦組織切片制備和免疫熒光染色

鼠胚電轉(zhuǎn)后于孕16.5 d 或孕17.5 d 取出胚胎并分離出鼠腦，于4%多聚甲醛過夜固定后，放置于30%蔗糖溶液中4℃保存。約24 h后可見組織塊沉于30%蔗糖溶液底部。將組織塊移入包埋盒，填充包埋劑，放置于-80℃冰箱長期保存。使用冰凍病理切片機，切成厚度為15~30μm 的冰凍切片。選擇目的切片后，冰凍切片取出浸泡于PBS中洗3次，每次5 min。用封閉液室溫封閉60 min，棄去封閉液，滴加用封閉液稀釋的相應(yīng)一抗，濕盒中4℃孵育36 h。浸泡于磷酸鹽緩沖液中洗3 次，每次5 min，滴加熒光二抗和DAPI，室溫避光孵育3 h，結(jié)束后清洗3 次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑并用蓋玻片封片。熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。采用Fiji軟件統(tǒng)計免疫染色陽性細胞的數(shù)量、形態(tài)和熒光表達強弱等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IUE實驗對小鼠胚胎生長發(fā)育的影響

電轉(zhuǎn)組胚胎的存活率約為90%，胚胎重為（0.874±0.024）g，頭重為（0.293±0.007）g，與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示IUE實驗不影響胚胎生長發(fā)育（表1）。

表1 2組胚胎存活率和體格發(fā)育情況比較

2.2 大腦皮質(zhì)NSC的增殖、凋亡、分裂和定向分化情況

本研究對孕14.5 d孕鼠胚胎大腦皮質(zhì)NSC電轉(zhuǎn)pCIG 質(zhì)粒，pCIG 質(zhì)粒表達重組增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）。孕16.5 d取材切片觀察腦室區(qū)NSC的增殖、凋亡、分裂和定向分化的情況。pH3標(biāo)記處于有絲分裂期的細胞，用pH3（紅色）和EGFP（綠色）進行雙標(biāo)可觀察調(diào)控目的基因后對NSC 增殖的影響，若兩者共標(biāo)細胞數(shù)量明顯增多或減少，則提示電轉(zhuǎn)調(diào)控的目的基因與NSC 的增殖功能相關(guān)（圖2A）。CC3 為細胞凋亡的標(biāo)記物，用CC3（紅色）和EGFP（綠色）進行雙標(biāo)可觀察目的基因后對NSC凋亡的影響，若兩者共標(biāo)細胞數(shù)量明顯增多或減少，則提示電轉(zhuǎn)調(diào)控的目的基因與NSC 的凋亡功能相關(guān)（圖2B）。在大腦皮質(zhì)發(fā)育過程中，腦室區(qū)的NSC不斷向外分化遷移，Sox2是NSC的標(biāo)記物，Tbr2 陽性細胞是由Sox2 標(biāo)記的NSC 分化而來的中間前體神經(jīng)元，用Tbr2（紅色）和EGFP（綠色）進行雙標(biāo)，可觀察調(diào)控目的基因后NSC 分化成為中間前體神經(jīng)元數(shù)量的變化（圖2C）。用Sox2（紅色）和EGFP（綠色）進行雙標(biāo)，可觀察調(diào)控目的基因后停留在NSC 階段未分化的細胞數(shù)量變化（圖2D），結(jié)合Tbr2 和Sox2 陽性細胞的統(tǒng)計結(jié)果，可觀察調(diào)控目的基因后對NSC定向分化的影響。γ-Tublin標(biāo)記細胞的中心體，當(dāng)細胞進入有絲分裂后期，中心體一分為二，分別牽引著紡錘絲和染色質(zhì)，通過測量兩個中心體之間的夾角可判斷該細胞是在進行對稱性分裂還是非對稱性分裂［11-12］，若該角度大于60°而小于等于90°，則定義為對稱性分裂，若該角度大于0°而小于等于60°，則定義為非對稱性分裂。對稱性分裂可產(chǎn)生2 個相同的NSC從而擴大神經(jīng)祖細胞池；而非對稱性分裂可產(chǎn)生1 個NSC 和1 個子代細胞（可為中間前體細胞、Ⅴ~Ⅵ層內(nèi)層神經(jīng)元或Ⅱ~Ⅳ層外層神經(jīng)元）。通過統(tǒng)計分析其角度，從而明確NSC 自我更新和分化的比例（圖2E~F）。放射狀膠質(zhì)細胞（radial glial cell，RGC）是在大腦皮質(zhì)發(fā)育過程中最主要的NSC，典型的RGC 呈現(xiàn)出放射軸形態(tài)，底部的胞體與腦室表面連接，向上伸出長長的放射軸，當(dāng)RGC 發(fā)育異常時，與腦室表面連接的胞體形態(tài)會出現(xiàn)紊亂和脫離，放射軸的末端“尾足”分支會增多。本研究中，孕16.5 d取材切片后在腦室區(qū)可觀察到呈典型放射軸形態(tài)的RGC（圖2G），在皮質(zhì)板區(qū)域可觀察RGC 放射軸尾足的結(jié)構(gòu)（圖2H），從而進一步研究目的基因?qū)GC 形態(tài)和功能的影響。

圖2 大腦皮質(zhì)NSC的增殖、凋亡、分裂和定向分化情況

2.3 大腦皮質(zhì)NSC的遷移和成熟情況

大腦皮質(zhì)的NSC 首先從腦室區(qū)分裂產(chǎn)生，在胚胎發(fā)育的過程中，經(jīng)過遷移區(qū)向外分化遷移，最終在大腦皮質(zhì)表面皮質(zhì)板區(qū)域形成成熟的神經(jīng)元。孕17.5 d 取材切片后，可見EGFP 陽性細胞存在于腦室區(qū)，此處細胞為未分化的NSC 和中間前體神經(jīng)元；遷移區(qū)的細胞為正在遷移的神經(jīng)元；皮質(zhì)板區(qū)域的細胞為成熟的神經(jīng)元（圖3A）?？赏ㄟ^統(tǒng)計EGFP陽性細胞在各個分區(qū)所占的百分率來明確NSC 遷移的情況。在大腦皮質(zhì)發(fā)育中，先形成Ⅴ~Ⅵ層神經(jīng)元，后形成Ⅱ~Ⅳ層神經(jīng)元。Ctip2（紅色）是大腦皮質(zhì)Ⅴ~Ⅵ層的標(biāo)記物，孕17.5 d已初步發(fā)育完全，可通過與EGFP雙標(biāo)來觀察NSC向大腦皮質(zhì)Ⅴ~Ⅵ層發(fā)育的情況（圖3B）。正在遷移的神經(jīng)元形態(tài)呈雙極神經(jīng)元形態(tài)，下端膨大部分為胞體，上端細長部分為樹突，以胞體為中心測量其遠端樹突的長度可確定遷移神經(jīng)元發(fā)育的情況（圖3C~E）。神經(jīng)元的成熟包括樹突、樹突棘和突觸形成等，孕17.5 d 皮質(zhì)神經(jīng)元樹突已初步形成，在大腦皮質(zhì)板區(qū)域可見大量發(fā)育成熟的神經(jīng)元，通過測量神經(jīng)元樹突分支的密度、長度和胞體的面積，確定神經(jīng)元成熟的情況（圖3F~G）。

圖3 大腦皮質(zhì)NSC 的遷移和成熟情況

3 討論

IUE實驗技術(shù)具有高效、操作簡單、可重復(fù)性強、費用低及胚胎發(fā)育研究適用范圍廣等優(yōu)勢［3］。IUE技術(shù)過程中胚胎的存活率高，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功率高，Baumgart 等［13］研究發(fā)現(xiàn)IUE 電轉(zhuǎn)后胚胎的存活率和轉(zhuǎn)染成功率均大于90%，本實驗結(jié)果與之一致。同時我們發(fā)現(xiàn)電轉(zhuǎn)組胚胎重、頭重指標(biāo)與對照組胚胎相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Comer 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，IUE電轉(zhuǎn)胎鼠出生后正常生長，可進行胚胎期調(diào)控大腦皮質(zhì)基因表達對小鼠行為學(xué)影響的相關(guān)研究。以上研究說明IUE實驗技術(shù)并不影響胚胎體格發(fā)育，是目前研究胚胎期大腦皮質(zhì)發(fā)育學(xué)與功能學(xué)的最佳實驗手段。

鼠胚神經(jīng)發(fā)生的高峰期是孕12.5~18.5 d，期間NSC神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因大量表達，在此時間段調(diào)控大腦皮質(zhì)NSC 靶基因的表達，可對大腦皮質(zhì)發(fā)育過程中靶基因功能進行充分研究。電轉(zhuǎn)時間點可結(jié)合研究目的和可操作性來進行選擇，一般選擇孕12.5~15.5 d 進行［9］，但孕12.5 d 和孕13.5 d 鼠胚腦室結(jié)構(gòu)不清，肉眼下電轉(zhuǎn)操作難度較大且鼠胚死亡率較高，從孕14.5 d開始鼠胚腦室結(jié)構(gòu)清晰可見，電轉(zhuǎn)后鼠胚存活率高。孕12.5~16.5 d 是NSC向中間前體神經(jīng)元大量分化的時期；孕14.5~18.5 d是NSC 向皮質(zhì)神經(jīng)元分化遷移的高峰時期；孕16.5~18.5 d是神經(jīng)元樹突和突觸早期發(fā)育的重要時期，本研究選擇孕14.5 d電轉(zhuǎn)既能保證胚胎的存活率和電轉(zhuǎn)成功率，又能通過在電轉(zhuǎn)后不同時間點取材，完整地觀察到NSC 增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和成熟的發(fā)育過程［15］，因此孕14.5 d也是國外研究選擇較多的電轉(zhuǎn)時間點［9，16］。

大腦皮質(zhì)正常的分層結(jié)構(gòu)和完整的神經(jīng)通路對認知、行為、運動、感覺和意識整合等高級功能至關(guān)重要，胚胎時期大腦皮質(zhì)的正常發(fā)育是保證生后大腦正常生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，大腦皮質(zhì)發(fā)育過程中NSC 的增殖、凋亡、定向分化、遷移和成熟等發(fā)生異常均會導(dǎo)致后代大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)障礙［17-18］。目前，利用IUE技術(shù)對NSC 的增殖、凋亡、定向分化、遷移和成熟等進行胚胎大腦皮質(zhì)發(fā)育研究的方法在國外已成熟開展：László等［19］通過IUE技術(shù)調(diào)控遷移α/β神經(jīng)元水解酶結(jié)構(gòu)域蛋白4 （alpha/beta-hydrolase domain-containing 4，Abhd4）的表達，發(fā)現(xiàn)Abhd4促進大腦皮質(zhì)遷移神經(jīng)元的凋亡；Da Silva等［20］研究利用IUE 技術(shù)與細胞周期標(biāo)志物EdU 和BrdU 進行雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)當(dāng)Wnt信號通路缺失時會導(dǎo)致大腦皮質(zhì)NSC增殖減少、細胞周期延長，進一步利用IUE技術(shù)上調(diào)Wnt信號通路能夠逆轉(zhuǎn)上述表型，從而揭示了Wnt信號通路在NSC增殖和細胞周期中的分子機制；Geng 等［21］研究利用IUE 技術(shù)結(jié)合實時錄像細胞工作站發(fā)現(xiàn)NSC 在缺失有絲分裂樣蛋白2（mtotic kinesin-like protein 2，Kif20a）時出現(xiàn)定向分化異常，缺失Kif20a促進NSC分化成為中間前體神經(jīng)元，NSC細胞數(shù)量減少，分化成為成熟神經(jīng)元的數(shù)量也隨之減少，最終導(dǎo)致皮質(zhì)變?。籒akagawa 等［22］通過IUE 技術(shù)聯(lián)合啟動子驅(qū)動質(zhì)粒調(diào)控大腦皮質(zhì)RGC 細胞運動介質(zhì)蛋白1（mediator of cell motility 1，Memo1）的表達，發(fā)現(xiàn)Memo1基因敲除后RGC 細胞的放射軸結(jié)構(gòu)紊亂，從而抑制NSC遷移；IUE技術(shù)也大量運用于神經(jīng)元成熟的研究中，Zhong等［23］通過IUE技術(shù)調(diào)控神經(jīng)元mTOR信號通路的表達，觀察電轉(zhuǎn)后神經(jīng)元樹突、興奮性和抑制性突觸等結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)突觸上γ-氨基丁酸受體的形成依賴于mTOR信號通路?？梢?，國外學(xué)者已利用IUE技術(shù)在胚胎NSC和大腦皮質(zhì)發(fā)育相關(guān)研究方面取得重要進展，但目前國內(nèi)對于IUE技術(shù)尚處于提高成功率［24］和轉(zhuǎn)染效率［25］的探索階段。

除本研究中所涉及的大腦皮質(zhì)NSC 增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和成熟等研究外，利用IUE技術(shù)在胚胎腦室內(nèi)轉(zhuǎn)染目的基因后，還可結(jié)合啟動子驅(qū)動表達質(zhì)粒、時差顯微鏡和腦片培養(yǎng)等技術(shù)，進行NSC 行為追蹤等多種胚胎神經(jīng)發(fā)生相關(guān)研究［6］。

綜上所述，利用IUE技術(shù)在胚胎腦室內(nèi)轉(zhuǎn)染目的基因，可進行大腦皮質(zhì)NSC 的增殖、凋亡、分裂、定向分化、遷移和成熟等神經(jīng)發(fā)育相關(guān)研究，IUE技術(shù)調(diào)控小鼠胚胎大腦皮質(zhì)NSC基因表達體系的建立，能對深入研究大腦皮質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因的生理功能和致病機制具有重要的方法學(xué)意義。