鄭雯， 鐘亞丹， 王炫， 劉慧婷， 楊斌， 劉軍

1.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091；2.佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528010

人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞，具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性，能被誘導(dǎo)分化成機體內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞類型[1-2]?；讓咏琴|(zhì)形成細(xì)胞(basal keratinocyte)位于表皮最底層細(xì)胞，可通過不斷自我更新，分化為角質(zhì)層的無細(xì)胞核鱗狀細(xì)胞，維持表皮的屏障作用[3-4]。目前認(rèn)為，基底層角質(zhì)形成細(xì)胞屬于表皮干細(xì)胞的一類，具有增殖與分化的潛能，對維持表皮的穩(wěn)態(tài)具有重要作用[5]?；讓咏琴|(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)角蛋白14(keratin 14，K14)和角蛋白5(keratin 5，K5)，對維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定發(fā)揮重要的作用，K5和K14均可作為基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)志物[6-8]。但現(xiàn)有的技術(shù)方法難以將基底層角質(zhì)形成細(xì)胞分離培養(yǎng)，且尚無利用標(biāo)志物成功分離培養(yǎng)基底層角質(zhì)形成細(xì)胞技術(shù)的相關(guān)報道，其研究和應(yīng)用都受到限制。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是在原核生物中存在的一種天然免疫系統(tǒng)。原核生物在遭到病毒入侵后，能夠把病毒DNA的一小段序列提取并存儲到自身基因組上的特定區(qū)域。當(dāng)病毒再次入侵時，原核生物能夠根據(jù)存儲的DNA片段對病毒進(jìn)行識別，對病毒的基因組DNA進(jìn)行切割，進(jìn)而消滅病毒[9-10]。根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)的生物學(xué)特性優(yōu)化的CRISPR/Cas9技術(shù)可實現(xiàn)對基因組的精確編輯，針對目的基因?qū)崿F(xiàn)點突變、基因敲除或敲入等操作，具有高效、便捷、低脫靶的優(yōu)點[11-13]。因此，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建一種keratin 5-IRES-eGFP 敲入的hESCs細(xì)胞系，并誘導(dǎo)hESCs分化為角質(zhì)形成細(xì)胞，實現(xiàn)對keratin 5陽性的基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)記，為后續(xù)分選獲得keratin 5陽性的基底層角質(zhì)形成細(xì)胞等研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株

CRISPR/Cas9質(zhì)粒 pSpCas9n(BB)-2A-GFP(PX461)購自Addgene公司，HEK-293T及hESCs細(xì)胞由本實驗室保存。感受態(tài)菌購自北京全式金公司。質(zhì)粒圖譜可于http://www.addgene.org網(wǎng)站查詢。

1.2 實驗試劑

DNA連接酶(T4 DNA ligase、10×T4 Ligation Buffer)購自NEB公司；質(zhì)粒保護(hù)的核酸外切酶(Plasmid Safe exonuclease、10×Plasmid Safe Buffer)購自 Epicentre公司；膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit、質(zhì)粒小提試劑盒QIAGEN Plasmid Mini Kit、PCR純化試劑盒QIAquick PCR Purification Kit購自 QIAGEN公司；Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；快速限制性內(nèi)切酶(Fast Digest Bbs I、FastAP、10× TM Fast Digest Buffer)、基因組DNA純化試劑盒(Gene JET Genomic DNA Purification Kit)。

1.3 實驗方法

1.3.1 sgRNA質(zhì)粒與打靶Donor載體的構(gòu)建 UCSC Genome Browser網(wǎng)站(http://genome.ucsc.edu/)中檢索人源keratin 5的基因序列，找出終止密碼子，參考張鋒實驗室團(tuán)隊的sgRNA預(yù)測網(wǎng)站(http: ∥crispr.mit.edu/)，針對目的基因keratin 5終止密碼子下游設(shè)計并合成相應(yīng)的sgRNA序列，將sgRNA連入pU6-EFsgRNA2.1scaffold載體(本實驗室保存)，篩選出正確的克隆，得到sgRNA質(zhì)粒。針對目的基因keratin 5斷裂位點設(shè)計上游同源臂keratin 5 Arm 1及下游同源臂keratin 5 Arm 2，將線性的Donor質(zhì)粒載體與keratin 5 Arm 1及keratin 5 Arm 2連接，再將本實驗室保存的IRES-eGFP連至帶有同源臂的Donor質(zhì)粒中，得到打靶Donor載體。

針對目的基因keratin 5終止密碼子下游設(shè)計并合成相應(yīng)的sgRNA序列，將sgRNA連入pU6-EFsgRNA2.1scaffold載體(本實驗室保存)，篩選出正確的克隆，得到sgRNA質(zhì)粒。針對目的基因keratin 5斷裂位點設(shè)計上游同源臂keratin 5 Arm 1及下游同源臂keratin 5 Arm 2，將線性的Donor質(zhì)粒載體與keratin 5 Arm 1及keratin 5 Arm 2連接，再將本實驗室保存的IRES-eGFP連至帶有同源臂的Donor質(zhì)粒中，得到打靶Donor載體。

1.3.2 293T細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及基因組DNA的提取 以每孔5×105個細(xì)胞接種至6孔板中，使用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞生長達(dá)到30%～40%時加入PEI轉(zhuǎn)染試劑與上述構(gòu)建的sgRNA質(zhì)粒，并設(shè)置一個無轉(zhuǎn)染sgRNA質(zhì)粒的293T細(xì)胞作為陰性對照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h收取HEK293T細(xì)胞，用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒按照說明書操作步驟提取細(xì)胞基因組DNA。

1.3.3 sgRNA切割效率檢測 針對sgRNA切割點上下游100～200 bp處設(shè)計PCR引物，進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件為：96 ℃ 30 s;94 ℃，5 s,60 ℃，30 s,72 ℃，10 s，40個循環(huán);72 ℃ 10 min，16 ℃放置。配置10%的聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，具體配方為：3%聚丙烯酰胺 3 mL；1%AP 55 μL；10×TAE 750 μL；TEMED 5 μL；水 3.69 mL。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，內(nèi)外槽加入1×TAE，電泳條件為12 mA，120 min；1×gelred液體浸泡凝膠5 min，自來水浸泡2 min后凝膠成像儀顯影。

1.3.4 電轉(zhuǎn)方法 將sgRNA質(zhì)粒，cas9質(zhì)粒(購自Addgene，編號：#44719)，打靶Donor載體共同電轉(zhuǎn)至hESCs細(xì)胞，其中sgRNA、cas9質(zhì)粒、打靶Donor載體電轉(zhuǎn)的數(shù)量比例為1∶4∶10。所用電轉(zhuǎn)儀為ECM 830型細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀，電轉(zhuǎn)條件為300 mA，4 ms。

1.3.5 篩選keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細(xì)胞系 電轉(zhuǎn)后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞系穩(wěn)定，用1 μg/mL的嘌呤霉素篩選2 d，通過有限稀釋法將80個左右的克隆鋪于96孔板中，培養(yǎng)半個月后，挑取單克隆細(xì)胞至24孔板進(jìn)行培養(yǎng)，收取細(xì)胞提取基因組DNA，隨后進(jìn)行PCR測序初步篩出陽性單克隆細(xì)胞。將初步鑒定為陽性單克隆細(xì)胞培養(yǎng)至穩(wěn)定后，通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入本實驗室保存的pCMV-cre的質(zhì)粒，待細(xì)胞系穩(wěn)定后，通過有限稀釋法將80個左右的克隆鋪于96孔板中，培養(yǎng)半個月后，將挑取的單克隆細(xì)胞至24孔板進(jìn)行培養(yǎng)后，收取細(xì)胞提取基因組DNA，隨后進(jìn)行PCR測序以及Sanger測序，篩出陽性克隆。

1.3.6 將hESCs誘導(dǎo)分化成為角質(zhì)形成細(xì)胞 在分化前3 d，將篩選的keratin 5-IRES-eGFP細(xì)胞系鋪在Matrigel包被的6孔板中培養(yǎng)，其中加入的培養(yǎng)液為ES培養(yǎng)基。在第0天時，將hESCs細(xì)胞移至Ⅰ型膠原蛋白包被的12孔板上培養(yǎng)，用含有1 μM RA和25 ng/mL BMP4的DMEM/F12的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)；第8～15天用含有1 μM RA和25 ng/mL BMP4的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)；第15天后，采用含25 ng/mL BMP4的KSFM的培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)至第30天后檢測。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒

將sgRNA連入pU6-EFsgRNA2.1scaffold載體后挑取單克隆，通過Sanger測序驗證，篩選出正確克隆，得到sgRNA質(zhì)粒(圖1A)。sgRNA質(zhì)粒制備完成后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過DNA-PAGE凝膠電泳驗證，選取切割效率最高的sgRNA進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 成功構(gòu)建打靶Donor質(zhì)粒

為獲取針對keratin 5目的基因的打靶Donor載體，通過PCR擴增獲得攜帶酶切位點的上、下游同源臂keratin 5 Arm 1和keratin 5 Arm 2。首先將上、下游同源臂克隆至線性化Donor載體中，再將IRES-eGFP連至帶有同源臂的Donor質(zhì)粒中并通過Sanger測序驗證(圖1B)。篩選出正確的打靶Donor載體，將其命名為keratin 5-IRES-eGFP-LoxP-neo(圖1C)。

圖1 sgRNA質(zhì)粒圖譜(1A)、打靶Donor載體keratin 5-IRES-eGFP-LoxP-neo的測序結(jié)果(1B)及其圖譜(1C)

2.3 成功挑選keratin 5-IRES-eGFP敲入的單克隆hESCs細(xì)胞株

PCR鑒定電泳結(jié)果顯示單克隆細(xì)胞系keratin 5-IRES-eGFP#3為純合敲入的hESCs細(xì)胞系，表明成功將IRES-eGFP-lox2272-CAG-NeoR-lox2272片段整合至keratin 5的兩條等位基因終止密碼子之后(圖2A)。獲得初步篩選的陽性細(xì)胞克隆keratin 5-IRES-eGFP#3后電轉(zhuǎn)表達(dá)Cre蛋白的質(zhì)粒pCMV-cre，刪除細(xì)胞克隆中除IRES-eGFP以外其它多余的Donor質(zhì)粒元件。再次挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，通過Cre-band條帶初步鑒定出刪除了多余的質(zhì)粒元件的細(xì)胞克隆(圖2B)，將其命名為keratin 5-IRES-eGFP#3-16。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，與打靶Donor載體進(jìn)行序列對比，可證實該細(xì)胞克隆中其它多余元件確已成功刪除(圖2C)。

圖2 純合敲入IRES-eGFP的單克隆細(xì)胞系keratin 5-IRES-eGFP#3 的PCR鑒定結(jié)果(2A)、成功刪除除IRES-eGFP以外其它多余的質(zhì)粒元件的單克隆細(xì)胞系keratin 5-IRES-eGFP#3-16的PCR鑒定結(jié)果(2B)及Sanger測序結(jié)果(2C)

2.4 將hESCs誘導(dǎo)成為角質(zhì)形成細(xì)胞

為誘導(dǎo)keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細(xì)胞系分化為基底層角質(zhì)形成細(xì)胞，在不同時間點加入多種細(xì)胞因子，進(jìn)行為期30 d的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)(圖3A)。分化培養(yǎng)30 d后，在白光視野下觀察該分化獲得的角質(zhì)形成細(xì)胞系ES-KC的細(xì)胞形態(tài)，可見其與角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT在形態(tài)上一致(圖3B)。通過免疫熒光染色鑒定，分化獲得的ES-KC細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)GFP與keratin 5，表明可將keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細(xì)胞系誘導(dǎo)分化為表達(dá)綠色熒光蛋白的基底層角質(zhì)形成細(xì)胞(圖3C)。

圖3 keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細(xì)胞系的分化培養(yǎng)方案(3A)、角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT和分化獲得的角質(zhì)形成細(xì)胞系ES-KC的白光視野圖(3B)及ES-KC的免疫熒光圖(3C)

3 討論

hESCs是經(jīng)體外分離、培養(yǎng)形成的一種原始多能干細(xì)胞，具有分化形成各種組織細(xì)胞的潛能，hESCs可經(jīng)誘導(dǎo)分化為基底層角質(zhì)形成細(xì)胞[14-15]。角蛋白14和角蛋白5可作為基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)志物，可以利用角蛋白14和角蛋白5實現(xiàn)對角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)記，但目前對基底層角質(zhì)形成細(xì)胞分離培養(yǎng)的研究及應(yīng)用仍有一定限制[16-18]。本研究試圖利用基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)志物角蛋白5完成對角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)記。首先通過CRISPR/Cas9技術(shù)靶向目的基因keratin 5對hESCs細(xì)胞系基因組進(jìn)行精確編輯，將綠色熒光蛋白報告基因整合至keratin 5下游，制備出keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs細(xì)胞系keratin 5-IRES-eGFP#3-16。在不同時間點加入多種細(xì)胞因子培養(yǎng)該細(xì)胞系，通過為期30 d的分化培養(yǎng)將hESCs細(xì)胞誘導(dǎo)分化為帶有綠色熒光蛋白的基底層角質(zhì)形成細(xì)胞，實現(xiàn)了對keratin 5陽性的人表皮基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)記。

綜上所述，目前研究尚缺少對基底層角質(zhì)形成細(xì)胞分離培養(yǎng)的細(xì)胞模型，本研究建立了keratin 5-IRES-eGFP#3-16細(xì)胞系及分化培養(yǎng)方案，可篩選出keratin 5 陽性的基底層角質(zhì)形成細(xì)胞，后續(xù)實驗中可以利用細(xì)胞流式技術(shù)將其分選出來，從而為臨床上表皮基底層角質(zhì)形成細(xì)胞異常的皮膚病研究提供細(xì)胞模型，用于疾病的機制研究。