張 豪，劉祎軒，朱慧媛，張朋威，雷艷茹，高超群，李東華，康相濤

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽資源(家禽)評價利用重點實驗室，鄭州 450000)

在現(xiàn)代商業(yè)生產(chǎn)中，家禽羽毛的數(shù)量和質(zhì)量越來越受到消費(fèi)者的關(guān)注，羽毛生長速度、質(zhì)量和脫毛方式對高價值家禽胴體的生產(chǎn)具有重要意義。在家禽規(guī)?；a(chǎn)中，15%的雞存在不同程度的羽毛發(fā)育問題，如脫毛和身體覆蓋不足等[1-2]，這些問題嚴(yán)重影響了雞的能量代謝、活體外觀和胴體質(zhì)量。羽毛生長不良不僅影響活體外觀，而且降低胴體質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化效率[3-4]。羽毛是一種起源于外胚層表皮細(xì)胞的角質(zhì)化衍生物[5]，其生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚。羽毛發(fā)育始于皮膚毛囊，它是一個由上皮(表皮)和間充質(zhì)(真皮)成分組成的復(fù)雜微器官，通過上皮和間充質(zhì)之間的關(guān)鍵分子相互作用調(diào)控羽毛的生長、替換及其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化[6-7]。在羽毛形態(tài)發(fā)生前真皮細(xì)胞的分化過程并沒有被預(yù)先決定，胚胎皮膚間充質(zhì)通過與發(fā)育中的表皮相互作用，使表皮基板下的間充質(zhì)細(xì)胞采用出芽或芽間分化的方式形成真皮凝聚物，凝聚物在隨后的形態(tài)發(fā)生過程中再進(jìn)一步形成毛乳頭[8-9]。在胚胎發(fā)育早期，皮膚上皮和間充質(zhì)可以通過細(xì)胞的緊密排列和一系列基因表達(dá)的變化來相互作用形成羽毛原基，羽毛原基進(jìn)一步分化，開始在羽毛芽的不同部位表達(dá)不同的信號、生長和細(xì)胞黏附分子，然后在毛囊內(nèi)長成細(xì)絲，通過孵化產(chǎn)生羽絨[9]。因此，探究家禽羽毛形態(tài)發(fā)生發(fā)育過程中上皮和間充質(zhì)的相互作用，了解家禽羽毛生長發(fā)育的分子機(jī)制，對于促進(jìn)羽毛生長進(jìn)而提高家禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

在雞胚胎期前6 d，雞胚皮膚發(fā)育不全，表皮層非常薄，很難區(qū)分皮膚的表皮和間充質(zhì)結(jié)構(gòu)[10]。在雞胚胎期第7天，胚胎背部從肱到腰骶出現(xiàn)羽芽，腰骶水平處有約7排羽芽，腿部出現(xiàn)明顯的羽芽，而在尾巴的每個側(cè)邊上羽芽較模糊。在雞胚胎期第9天時，羽芽更加明顯，新出現(xiàn)的羽芽靠近中腹線，與胸骨相連，并延伸至腹部兩側(cè)[11]。在雞胚胎發(fā)育的第7～9天是雞皮膚上皮和間充質(zhì)調(diào)控羽毛毛囊發(fā)育的關(guān)鍵時期。雞胚胎期第7天首次產(chǎn)生的背部羽毛在形態(tài)上被鑒定，第7～9天突出的毛囊建立了良好毛細(xì)血管供應(yīng)，并滲透到初期毛囊的毛乳頭中[12]，血管系統(tǒng)的建立對毛囊的后期生長至關(guān)重要。本研究通過下載GSE62882芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集，經(jīng)生物信息學(xué)分析篩選雞胚胎期第7～9天影響羽毛生長發(fā)育的關(guān)鍵基因及其參與的生物過程和信號通路，為進(jìn)一步探究皮膚上皮和間充質(zhì)在毛囊生長發(fā)育中的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)分析

GSE62882芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集以Affymetrix基因組陣列GPL3213平臺為基礎(chǔ)，從GEO數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載獲得，本研究中共有8個Cobb500肉雞樣本數(shù)據(jù)，其中胚胎期第7天背部皮膚上皮(E7 dorsal skin epithelium，E7ep)、胚胎期第9天背部皮膚上皮(E9 dorsal skin epithelium，E9ep)、胚胎期第7天背部皮膚間充質(zhì)(E7 dorsal skin mesenchyme，E7me)和胚胎期第9天背部皮膚間充質(zhì)(E9 dorsal skin mesenchyme，E9me)樣本數(shù)據(jù)各2個(表1)。將原始表達(dá)矩陣通過R語言中的limma包進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，以log2|FoldChange|>1且P<0.05為篩選條件，篩選出E7ep和E9ep、E7me和E9me的差異基因，并繪制火山圖及熱圖。

表1 GSE62882樣本數(shù)據(jù)

1.2 關(guān)鍵基因篩選

將E7ep和E9ep、E7me和E9me差異基因，以及E7ep/E9ep、E7me/E9me差異基因中共同上下調(diào)基因分別導(dǎo)入STRING version 11.5在線軟件(https:∥string-db.org/)，得到蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，同時將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行可視化。運(yùn)用STRINGAPP插件計算PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)，基于Degree選擇PPI網(wǎng)絡(luò)排名前十的關(guān)鍵基因，找出網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置的關(guān)鍵節(jié)點，并構(gòu)建PPI子網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 差異基因GO功能注釋

GO功能富集分析是大規(guī)?；蚬δ茏⑨尩某Ｓ梅椒?，本研究取E7ep和E9ep、E7me和E9me的差異基因運(yùn)用R語言中clusterProfiler程序包進(jìn)行功能注釋，獲取差異基因的GO條目。

1.4 差異基因的信號KEGG通路富集分析

KEGG是一個包含生物化學(xué)路徑的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫。本研究將E7ep和E9ep、E7me和E9me的差異基因，以及表皮與間充質(zhì)中共同上下調(diào)基因，利用R語言中clusterProfiler程序包進(jìn)行差異基因KEGG通路富集分析，獲取差異基因和共同上下調(diào)基因富集的信號通路。

2 結(jié) 果

2.1 E7ep和E9ep差異基因的篩選和PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

本研究共篩選出E7ep和E9ep差異基因626個，其中上調(diào)基因356個，下調(diào)基因270個(圖1)。選取前25個差異基因繪制熱圖，發(fā)現(xiàn)E7ep和E9ep差異基因包括SPINK5、LRRC17、GPIHBP1等(圖2)；將差異基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，經(jīng)Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的可視化結(jié)果，剔除孤立蛋白后，共得到119個節(jié)點及189條互作關(guān)系(圖3),基于Degree選擇PPI網(wǎng)絡(luò)排名前十的核心基因分別為WNT3A、FN1、WNT7A、FZD8、WNT3、WIF1、SHH、WNT9B、WNT4、WNT6(圖4)。

圖1 E7ep和E9ep差異基因的火山圖

圖2 E7ep和E9ep差異基因的熱圖

圖3 E7ep和E9ep差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 E7ep和E9ep差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)樞紐模塊分析

2.2 E7ep與E9ep差異基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

對E7ep和E9ep差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，差異基因參與細(xì)胞分化、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、組織發(fā)育、神經(jīng)形成、神經(jīng)元的形成、神經(jīng)分化、細(xì)胞黏著、生物黏附、多細(xì)胞有機(jī)體負(fù)調(diào)控等GO條目(圖5)，參與Wnt信號通路、黑色素合成、TGF-β信號通路、mTOR信號通路等信號通路(圖6)。

圖5 E7ep和E9ep差異基因的GO功能注釋

圖6 E7ep和E9ep差異基因的KEGG通路富集分析

2.3 E7me和E9me差異基因篩選和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本研究共篩選出E7me和E9me差異基因690個，其中上調(diào)基因269個，下調(diào)基因421個(圖7)。選取前25個差異基因制備熱圖(圖8)，發(fā)現(xiàn)E7me和E9me差異基因包括TAC1、FRK、PENK等；將差異基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，經(jīng)Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的可視化結(jié)果，剔除孤立蛋白后，共得到206個節(jié)點及326條互作關(guān)系(圖9)，基于Degree選擇PPI網(wǎng)絡(luò)排名前十的核心基因分別為FGF2、SDC1、ITGB3、BMP4、EGFR、ITGA9、FLT1、MYL10、RUNX2、PTPN11(圖10)。

圖7 E7me和E9me差異基因的火山圖

圖8 E7me和E9me差異基因的熱圖

圖9 E7me和E9me差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖10 E7me和E9me差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)樞紐模塊分析

2.4 E7me和E9me差異基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

對E7me和E9me差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，差異基因參與細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育過程、解剖結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生、動物器官發(fā)育、細(xì)胞表面受體信號通路、系統(tǒng)進(jìn)程、循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)展、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生的調(diào)控、心臟發(fā)育、肌肉系統(tǒng)過程等GO條目(圖11)，參與鈣信號通路、肌動蛋白骨架調(diào)控、EMC受體互作等信號通路(圖12)。

圖11 E7me和E9me差異基因的GO功能注釋

圖12 E7me和E9me差異基因的KEGG通路富集分析

2.5 皮膚上皮和間充質(zhì)中共同上下調(diào)基因的生物信息學(xué)分析

篩選雞胚胎從第7和9天發(fā)育過程中背部皮膚上皮和間充質(zhì)共同上下調(diào)基因，獲得共同上調(diào)基因26個(圖13A)，共同下調(diào)基因48個(圖13B)。將共同上下調(diào)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，通過Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的可視化結(jié)果。剔除孤立蛋白后，PPI網(wǎng)絡(luò)中共得到32個節(jié)點及34條相互作用關(guān)系，主要基因包括MYC、FGF18、RUNX2、JAG1、MSX2等(圖14)。將共同上下調(diào)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共同上下調(diào)基因主要富集在Wnt信號通路上(圖15)。

圖13 皮膚上皮與間充質(zhì)共同上調(diào)(A)和下調(diào)(B)基因

圖14 共同上下調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖15 皮膚上皮與間充質(zhì)共同上下調(diào)基因的KEGG通路富集分析

3 討 論

羽毛是雞的一個重要的外觀性狀，成雞羽毛的發(fā)育呈現(xiàn)從生長期、退行期到休止期的周期性生長，羽毛的生長性狀能夠反映雞的發(fā)育狀況，羽毛的正常生長和再生對提高家禽的福利和經(jīng)濟(jì)價值具有重要意義[13-14]。羽毛是由皮膚上皮和間充質(zhì)之間的一系列信號通路相互作用而形成的，上皮組織中的毛囊干細(xì)胞接收來自真皮間充質(zhì)細(xì)胞的信號，并將信號傳回真皮間充質(zhì)細(xì)胞，從而影響皮膚附屬物毛囊的生長發(fā)育[13]。目前關(guān)于雞胚胎皮膚毛囊發(fā)育的研究已有大量報道，但對早期毛囊發(fā)育過程中上皮和間充質(zhì)間相互作用調(diào)控毛囊的生長發(fā)育的研究較少，本研究分析GSE62882數(shù)據(jù)集中胚胎期第7、9天的背部皮膚上皮和間充質(zhì)的差異表達(dá)基因，篩選雞胚胎第7～9天發(fā)育過程中影響雞羽毛生長發(fā)育的關(guān)鍵基因、生物過程和信號通路，探究皮膚上皮和間充質(zhì)協(xié)同作用對毛囊生長發(fā)育的影響。

本研究共獲得E7ep和E9ep差異基因626個，這些差異基因存在189條互作關(guān)系，基于Degree獲得PPI網(wǎng)絡(luò)排名前十的核心基因分別是WNT3A、FN1、WNT7A、FZD8、WNT3、WIF1、SHH、WNT9B、WNT4、WNT6，主要集中在Wnt信號通路上，通過GO功能注釋和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，E7ep和E9ep差異基因主要富集在血管系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的生物過程和Wnt、TGF-β信號通路上。在個體皮膚附屬物中，WNT幫助形成局部生長區(qū)域，并形成發(fā)育中的羽毛，如WNT6過表達(dá)誘導(dǎo)不同羽毛區(qū)域的局部生長，WNT3A擴(kuò)大了羽毛道的大小、促進(jìn)了個體羽毛的形成[15-16]。TGF-β信號通路中最重要的成員是TGF-β超家族，該家族包含大量不同的多肽形態(tài)發(fā)生因子，包括TGF-β本身及BMP和GDF，能夠誘導(dǎo)毛囊進(jìn)入退行期，如在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2通過激活I(lǐng)FN-γ和BDNF誘導(dǎo)毛囊進(jìn)入退行期[17]。在毛囊生長發(fā)育初期，毛囊干細(xì)胞的激活需要抑制TGF-β信號通路中BMP的表達(dá)和激活Wnt信號通路中β-catenin的穩(wěn)定表達(dá)共同完成。Wnt、TGF-β信號通路對血管的生成具有重要的調(diào)控作用[15,18]。在雞胚胎第7～9天的發(fā)育過程中，胚胎皮膚上皮開始有血管和神經(jīng)的生成，毛囊周圍血管可提供毛囊生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)及各類細(xì)胞調(diào)控因子，進(jìn)而調(diào)控毛囊細(xì)胞的生長分化[19]。

本研究共獲得E7me和E9me差異基因690個，基于Degree獲得PPI網(wǎng)絡(luò)排名前十的核心基因分別是FGF2、SDC1、ITGB3、BMP4、EGFR、ITGA9、FLT1、MYL10、RUNX2、PTPN11。活化的內(nèi)皮細(xì)胞在FGF2的作用下開始增殖，并形成新的芽[18]，使細(xì)胞間的接觸松動，導(dǎo)致毛細(xì)血管融合形成動脈和靜脈。FGF2可以通過誘導(dǎo)雞皮膚形成致密的真皮組織，致密真皮組織進(jìn)一步發(fā)育成羽芽[20]。在表皮發(fā)育過程中，BMP信號傳導(dǎo)是皮膚上皮和間充質(zhì)相互作用過程中的關(guān)鍵途徑，具有抑制毛囊生長發(fā)育的作用[13,21]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR抑制劑能夠縮短羽芽之間的距離并增加羽芽的數(shù)量[22]；小鼠缺乏EGFR將不能長出毛發(fā)，小鼠皮膚中缺失EGFR將導(dǎo)致基質(zhì)細(xì)胞有絲分裂活性增加、毛囊凋亡和形成毛發(fā)的上皮細(xì)胞系分化受損[23]。但EGFR在禽類皮膚毛囊生長發(fā)育過程中是否有相似的作用仍需進(jìn)一步研究。E7me和E9me差異基因主要涉及肌肉發(fā)育、循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育和鈣信號通路，鈣信號通路能夠影響皮膚間充質(zhì)細(xì)胞的運(yùn)動方向，在加速傷口愈合、減少疤痕形成、傷口收縮和誘導(dǎo)毛發(fā)再生等過程中有廣泛的應(yīng)用[24]。

本研究共獲得胚胎期第7和9天雞背部皮膚上皮和間充質(zhì)中共同上調(diào)基因26個，共同下調(diào)基因48個，共同上下調(diào)基因PPI網(wǎng)絡(luò)中的主要基因包括MYC、FGF18、JAG1等。MYC在人和小鼠毛囊周期中已有報道，參與小鼠毛囊形態(tài)發(fā)生的不同階段及毛囊角化細(xì)胞的增殖或分化[25-26]，c-Myc蛋白是β-catenin下游的轉(zhuǎn)錄因子，在雞胚胎期第8～12天表達(dá)量顯著增加，在調(diào)節(jié)毛囊干細(xì)胞分化中是必不可少的[27]。FGF18在小鼠毛囊中高表達(dá)，可誘導(dǎo)休止期毛囊再生，在雞羽毛生長中的作用目前仍不清楚[28]。JAG1是Notch的配體，通過Notch信號通路參與毛囊的生長調(diào)控[29-31]。Notch信號通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)包括毛囊在內(nèi)的多細(xì)胞生物干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和發(fā)育的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在毛囊發(fā)育過程中，Notch1的活性是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵。Notch1在早期基板的形成中并不發(fā)揮作用，但與真皮內(nèi)陷毛乳頭的形成有關(guān)。Notch1敲除以后將會導(dǎo)致退行期提前，毛發(fā)逐漸變短[32-33]。對背部皮膚上皮和間充質(zhì)共同上下調(diào)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共同上下調(diào)基因主要富集在Wnt信號通路上。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎期第8～12天能夠促進(jìn)羽毛的生長和發(fā)育[34-35]。Wnt信號通路在背部皮膚上皮和間充質(zhì)互作中具有重要作用，在皮膚羽毛形成的誘導(dǎo)期，毛囊的形成依賴于單層上皮和真皮細(xì)胞濃縮物之間的一系列相互作用，上皮細(xì)胞接收來自底層間充質(zhì)的指示信號，而間充質(zhì)細(xì)胞需要表皮信號來形成毛乳頭。在毛囊基板形成之前，真皮間充質(zhì)細(xì)胞均勻地接受廣泛的上皮發(fā)出的Wnt信號，真皮間充質(zhì)細(xì)胞隨后產(chǎn)生第一個真皮Wnt信號，誘導(dǎo)表皮基底細(xì)胞定期聚集，導(dǎo)致毛發(fā)基板的形成，初始誘導(dǎo)后，發(fā)展中的基板產(chǎn)生Wnt配體，以誘導(dǎo)底層間充質(zhì)細(xì)胞形成真皮凝聚物[36]，最終形成皮膚毛囊的毛乳頭，而毛乳頭是毛囊生長發(fā)育的調(diào)控中心。在胚胎期第7～9天發(fā)育過程中，E7me和E9me差異基因在Wnt信號通路上并沒有富集，但是上皮和間充質(zhì)共同上下調(diào)基因富集在Wnt信號通路上，這可能與分析過程中數(shù)據(jù)樣本的選取有關(guān)，并不代表E7me和E9me差異基因在Wnt信號通路上沒有富集。

4 結(jié) 論

本研究通過對GSE62882的數(shù)據(jù)集中部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明在胚胎期第7～9天上皮和間充質(zhì)共同上下調(diào)基因主要富集在Wnt信號通路上，表明上皮和間充質(zhì)通過Wnt信號誘導(dǎo)皮膚毛囊的生長發(fā)育，為進(jìn)一步探究皮膚上皮和間充質(zhì)在毛囊生長發(fā)育中的作用提供理論參考。