氯氰菊酯乳油4種色譜分析方法比較

馬 濤，許艷秋

(1.山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心(山西省標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量技術(shù)研究院)，山西 太原 030025；2.四川省農(nóng)藥檢定所，四川 成都 610045)

1 前言

氯氰菊酯化學(xué)式為C22H19Cl2NO3，相對(duì)分子量：416.3，CAS號(hào)：71697-59-1，結(jié)構(gòu)式如下：

氯氰菊酯原藥為無(wú)味晶體，熔點(diǎn)41.2～47.3℃，水中溶解度極小，易溶于多數(shù)有機(jī)溶劑。穩(wěn)定性：中性和弱酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下易水解[1]。氯氰菊酯的分子結(jié)構(gòu)上有3個(gè)不對(duì)稱碳原子，有8個(gè)異構(gòu)體[2]。是一種中等毒性殺蟲(chóng)劑，使用安全，在我國(guó)應(yīng)用廣泛，國(guó)內(nèi)取得農(nóng)藥登記廠家眾多。

目前，氯氰菊酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)采用的是正相液相色譜內(nèi)標(biāo)法(方法一)或者正相液相色譜外標(biāo)法(方法二)。但在日常應(yīng)用中，液相色譜法絕大多數(shù)應(yīng)用為反相方法，在儀器配備數(shù)量不足的情況下，需要應(yīng)用正相液相色譜法時(shí)，操作人員要拆開(kāi)液相色譜儀核心部件(泵)更換適配的泵桿密封圈等操作，還需要耗費(fèi)大量的時(shí)間用價(jià)格較高的色譜純異丙醇沖洗系統(tǒng)，工序繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作要求和難度高于反相方法。為此，在實(shí)際工作中探索了應(yīng)用相對(duì)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保性更好的反相液相色譜外標(biāo)法(方法三)和氣相色譜內(nèi)標(biāo)法(方法四)，是較為實(shí)用的分析方法。

2 試驗(yàn)部分

2.1 方法一[3]正相高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法

2.1.1 試劑和溶液 正己烷：色譜純；乙酸乙酯：色譜純；苯甲酸甲酯：分析純(不含干擾分析的雜質(zhì))；氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.4%；5%氯氰菊酯乳油。

2.1.2 儀器 液相色譜儀：Agilent1200，具有DAD檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent色譜工作站；色譜柱：150mm×4.6mm(id)不銹鋼柱，內(nèi)裝ZORBAX RX-SIL、5μm填充物；超聲波清洗機(jī)；過(guò)濾器：濾膜孔徑0.45μm。

2.1.3 液相色譜操作條件 流動(dòng)相：ψ(正己烷：乙酸乙酯)=99：1(V/V)，用移液管移取10mL乙酸乙酯置于990mL正己烷中，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，超聲15min；內(nèi)標(biāo)溶液：稱取0.38g苯甲酸甲酯于100mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，搖勻；流量：1.0mL/min；柱溫：室溫，30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm；進(jìn)樣體積：10μL；苯甲酸甲酯的保留時(shí)間約4.5min，低效順式體的保留時(shí)間約 6.9min，高效順式體的保留時(shí)間約8.0min，低效反式體的保留時(shí)間約8.9min，高效反式體的保留時(shí)間約10.0min。

典型的內(nèi)標(biāo)物和氯氰菊酯標(biāo)樣4個(gè)有效成分及對(duì)應(yīng)的氯氰菊酯乳油的正相液相色譜圖(圖1)。

圖1 內(nèi)標(biāo)物和氯氰菊酯標(biāo)樣(左)及氯氰菊酯樣品(右)正相液相色譜圖

2.1.4 測(cè)定步驟

2.1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取氯氰菊酯標(biāo)樣0.05g(精確至0.000 2g)，于15mL具塞玻璃瓶中，用移液管加入10mL內(nèi)標(biāo)溶液，搖勻，備用。

2.1.4.2 試樣溶液的配制 稱取含氯氰菊酯的試樣1.0 g(精確至0.000 2g)，于15mL具塞玻璃瓶中，用配制標(biāo)樣溶液的同一支移液管加入10mL內(nèi)標(biāo)溶液，搖勻，過(guò)0.45μm濾膜，備用。

2.1.4.3 測(cè)定 在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針氯氰菊酯峰總面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比的相對(duì)變化≤1.0%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行分析測(cè)定。

2.1.4.4 計(jì)算 采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣中的氯氰菊酯總峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比分別進(jìn)行平均。試樣中氯氰菊酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)按下式計(jì)算：

(1)

式中：

r1—標(biāo)樣溶液中氯氰菊酯峰總面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比的平均值；

r2—試樣溶液中氯氰菊酯峰總面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比的平均值；

m1—標(biāo)樣氯氰菊酯的質(zhì)量，g；

m2—試樣的質(zhì)量，g；

p—標(biāo)樣氯氰菊酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2.2 方法二[3]正相高效液相色譜外標(biāo)法

2.2.1 試劑和溶液 正己烷：色譜純；無(wú)水乙醚：色譜純；氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品：同2.1.1；5%氯氰菊酯乳油：同2.1.1。

2.2.2 儀器 同2.1.2。

2.2.3 液相色譜操作條件 流動(dòng)相：ψ(正己烷：無(wú)水乙醚)=98：2(V/V)，用移液管移取20mL無(wú)水乙醚置于980mL正己烷中，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，超聲15min；流量：1.0mL/min；柱溫：室溫，30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；進(jìn)樣體積：10μL；低效順式體的保留時(shí)間約7.1min，高效順式體的保留時(shí)間約8.2min，低效反式體的保留時(shí)間約9.1min，高效反式體的保留時(shí)間約10.3min。

典型的氯氰菊酯4個(gè)有效成分標(biāo)樣及對(duì)應(yīng)的氯氰菊酯乳油的正相液相色譜圖(圖2)。

圖2 氯氰菊酯標(biāo)樣(左)和氯氰菊酯樣品(右)正相液相色譜圖

2.2.4 測(cè)定步驟

2.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品0.03g(精確至0.000 2g)于25.0mL容量瓶中，用正己烷定容，于超聲波振蕩器中震蕩5min，使其全部溶解，冷卻至室溫過(guò)0.45μm濾膜，備用。

2.2.4.2 試樣溶液的配制 稱取含氯氰菊酯的試樣0.6g(精確至0.000 2g)于25.0mL容量瓶中，用正己烷定容，于超聲波振蕩器中震蕩5min，使其全部溶解，冷卻至室溫過(guò)0.45μm濾膜，備用。

2.2.4.3 測(cè)定 在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針標(biāo)樣溶液的響應(yīng)值相對(duì)變化≤1.5%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

2.2.4.4 計(jì)算 采用外標(biāo)法計(jì)算。將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣中的氯氰菊酯峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中氯氰菊酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)按下式計(jì)算：

(2)

式中：

A1—標(biāo)樣溶液中氯氰菊酯峰面積的平均值；

A2—試樣溶液中氯氰菊酯峰面積的平均值；

m1—標(biāo)樣氯氰菊酯的質(zhì)量，g；

m2—試樣的質(zhì)量，g；

p—標(biāo)樣氯氰菊酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2.3 方法三 反相高效液相色譜外標(biāo)法

2.3.1 試劑和溶液 甲醇：色譜純；超純水：電導(dǎo)率18.2MΩ.cm(25℃)；其余同2.1.1。

2.3.2 儀器 液相色譜儀：Agilent1100，具有DAD檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；其余同2.1.2。

2.3.3 液相色譜操作條件 流動(dòng)相：ψ(甲醇：水)=88：12(V/V)；流量：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；進(jìn)樣體積：10μL；氯氰菊酯的保留時(shí)間約8min-10min。

典型的氯氰菊酯標(biāo)樣及氯氰菊酯乳油的反相液相色譜圖(圖3)。

圖3 氯氰菊酯標(biāo)樣(左)和氯氰菊酯樣品(右)反相液相色譜圖

2.3.4 測(cè)定步驟

2.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品0.03g(精確至0.000 2g)于50.0mL容量瓶中，用甲醇定容，于超聲波振蕩器中震蕩5min，使其全部溶解，冷卻至室溫過(guò)0.45μm濾膜，備用。

2.3.4.2 試樣溶液的配制 稱取氯氰菊酯乳油試樣0.6g(精確至0.000 2g)于50.0mL容量瓶中，用甲醇定容，于超聲波振蕩器中震蕩5min，使其全部溶解，冷卻至室溫過(guò)0.45μm濾膜，備用。

2.3.4.3 測(cè)定 同2.2.4.3。

2.3.4.4 計(jì)算 同2.2.4.4。

2.4 方法四 氣相色譜內(nèi)標(biāo)法

2.4.1 試劑和溶液 丙酮：色譜純；鄰苯二甲酸二環(huán)己酯：分析純(不含干擾分析的雜質(zhì))；其余同2.1.1。

2.4.2 儀器 氣相色譜儀：Agilent7890，具有FID檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent色譜工作站；色譜柱：HP-5 30mm×0.32mm(id)×0.25μm毛細(xì)柱；超聲波清洗機(jī)：天津奧特賽恩斯儀器有限公司AS20500BDT；氫氣發(fā)生器；空氣發(fā)生器；過(guò)濾器：同2.1.2。

2.4.3 氣相色譜操作條件 進(jìn)樣口溫度：270℃；進(jìn)樣模式：分流；分流比：50：1；載氣：高純氮?dú)?；柱流量?.5 mL/min；柱流量控制模式：恒定流量模式；柱溫：260℃，保持15min；檢測(cè)器溫度：270℃；氫氣流量：30.0mL/min；空氣流量：300.0mL/min；尾吹氣流量：30.0mL/min；進(jìn)樣量：1.0μL；保留時(shí)間：氯氰菊酯約8.0min，內(nèi)標(biāo)物約4.4min。內(nèi)標(biāo)溶液：稱取0.25g鄰苯二甲酸二環(huán)己酯于25mL容量瓶中，用丙酮定容，搖勻，備用。

典型的內(nèi)標(biāo)物和氯氰菊酯標(biāo)樣及氯氰菊酯樣品的氣相色譜圖(圖4)。

圖4 內(nèi)標(biāo)物和氯氰菊酯標(biāo)樣(左)和氯氰菊酯樣品(右)氣相色譜圖

2.4.4 測(cè)定步驟

2.4.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取氯氰菊酯標(biāo)樣0.065g(精確至0.000 2g)，于10.0mL容量瓶中，用移液管準(zhǔn)確加入5.0mL內(nèi)標(biāo)溶液，再用丙酮定容，超聲10min，靜置，搖勻，加入進(jìn)樣小瓶時(shí)，稀釋3倍。

2.4.4.2 試樣溶液的配制 稱取氯氰菊酯試樣1.3g(精確至0.000 2g)，于10.0mL容量瓶中，用2.4.4.1中同一支移液管加入5.0mL內(nèi)標(biāo)溶液，再用丙酮定容，超聲10min，靜置，搖勻，過(guò)0.45μm濾膜，加入進(jìn)樣小瓶時(shí)，稀釋3倍。

2.4.4.3 測(cè)定 同2.1.4.3

2.4.4.4 計(jì)算 同2.1.4.4

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的選擇 氯氰菊酯分析檢測(cè)不需要拆分異構(gòu)體，因而可以采用不能完全分離異構(gòu)體的反相液相色譜法和氣相色譜法。

3.1.1 液相色譜法方法條件的選擇 從氯氰菊酯的紫外波長(zhǎng)掃描圖(圖5)可以看到，氯氰菊酯有兩個(gè)吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)在205nm附近，檢測(cè)波長(zhǎng)可選擇范圍較廣。

圖5 氯氰菊酯紫外吸收光譜圖

由于氯氰菊酯在常規(guī)溶劑中均能很好地溶解，且相對(duì)穩(wěn)定，流動(dòng)相選擇常規(guī)溶劑即可，根據(jù)相似相溶原理，調(diào)整流動(dòng)相的極性，得到各組份合適的出峰時(shí)間。

3.1.2 氣相色譜方法條件的選擇 氣相色譜方法條件，主要的有色譜柱、進(jìn)樣口和柱箱及檢測(cè)器溫度、內(nèi)標(biāo)物的選擇等，3個(gè)溫度值都要高于待測(cè)組分的沸點(diǎn)，選擇HP-5色譜柱及鄰苯二甲酸二環(huán)己酯作為內(nèi)標(biāo)物，可獲得滿意的分析結(jié)果。

3.2 精密度測(cè)定 采用上述4種方法測(cè)定同一5%氯氰菊酯乳油產(chǎn)品，每種方法平行測(cè)定6次，測(cè)定各方法的精密度。測(cè)定結(jié)果(表1)，方法一、方法二、方法三、方法四4種方法的平均值分別為4.99%、5.01%、5.00%、5.04%，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.080、0.085、0.090、0.083，變異系數(shù)分別為1.61%、1.70%、1.80%、1.65%。

表1 4種方法分析5%氯氰菊酯乳油精密度數(shù)據(jù)

3.3 準(zhǔn)確度測(cè)定 準(zhǔn)確度測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別稱取已知含量的5%氯氰菊酯乳油20份，各加入一定量的氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一種方法測(cè)定5份加標(biāo)后的樣品，測(cè)定其添加量的回收率。測(cè)定結(jié)果(表2)，可見(jiàn)方法一到四4個(gè)方法回收率范圍分別在99.04%～101.61%、98.81%～101.35%、98.02%～100.84%、99.55%～101.20%之間。

表2 4種方法分析5%氯氰菊酯乳油準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)

3.4 線性關(guān)系測(cè)定 2種內(nèi)標(biāo)法分別用各自配好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在各自色譜條件下分析。用氯氰菊酯與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比值(0.439、0.877、1.316、1.756、2.195五個(gè)水平)做橫坐標(biāo)，氯氰菊酯與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值做縱坐標(biāo)。得到正相液相色譜內(nèi)標(biāo)法線性回歸方程y=4.847 9x+0.069 3，R2=0.999 4，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7；氣相色譜內(nèi)標(biāo)法線性回歸方程y=0.7302x-0.008 9，R2=0.999 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7(表3、圖6)。

表3 方法一、四線性關(guān)系數(shù)據(jù)表

圖6 方法一(左)和方法四(右)線性關(guān)系圖

2種液相色譜外標(biāo)法，分別用各自配好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在對(duì)應(yīng)色譜條件下分析，進(jìn)樣量分別為1、2、5、10、15、20μL，以氯氰菊酯濃度值做橫坐標(biāo)，氯氰菊酯峰面積為縱坐標(biāo)，制作線性關(guān)系曲線。得到正相液相色譜外標(biāo)法線性回歸方程y=5 083x-7.553 2，R2=0.999 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6；反相液相色譜外標(biāo)法線性回歸方程y=53 514x+60.297，R2=0.999 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9(表4、圖7)。

表4 方法二、三線性關(guān)系數(shù)據(jù)表

圖7 方法二(左)和方法三(右)線性關(guān)系圖

3.5 4種分析方法結(jié)果比較 按照NY/T 2887-2016《農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量分析方法確認(rèn)指南》要求[4]，對(duì)于5%氯氰菊酯乳油產(chǎn)品，分析方法精密度要求變異系數(shù)<2.11%(計(jì)算公式：2(1-0.5logC)×0.67，此處C=0.05)、線性系數(shù)>0.99、添加回收率要求在97%～103%之間才合乎要求。從表1、2、3看出，4種方法精密度、準(zhǔn)確度、線性關(guān)系均符合要求，分析所用時(shí)間合適，均能滿足日常分析要求。

表5就4種分析方法經(jīng)濟(jì)性、環(huán)保性、便捷性和操作難度四個(gè)方面做比較?？煽闯觯瑲庀嗌V法因流動(dòng)相為高純氮?dú)?，所以?jīng)濟(jì)性和環(huán)保性最好，操作難度小，便捷性較好；反相液相色譜法最便捷，成本也低于正相液相色譜法；正相液相色譜法既不經(jīng)濟(jì)也不環(huán)保，更不便捷，操作難度大，非熟練技術(shù)人員比較難獲得好的數(shù)據(jù)結(jié)果。

表5 4種方法各項(xiàng)性能比較

4 結(jié)論

綜上所述，在實(shí)際應(yīng)用中，推薦使用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法或者反相液相色譜外標(biāo)法來(lái)完成氯氰菊酯乳油含量的檢測(cè)工作。