陶依玲，閆亞丹，李鑫玉，翁懷峰，文亞峰，邵鳳俠

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.福建省霞浦國(guó)有林場(chǎng)，福建 霞浦 355100）

柳杉屬杉科Taxodiaceae柳杉屬Cryptomeria常綠大喬木，分為柳杉Cryptomeria japonicavar.sinensis和日本柳杉Cryptomeria japonicavar.japonica兩個(gè)種。柳杉雌雄同株，雄球花單生葉腋，成短穗狀花序?；ㄆ?月，果10月成熟。柳杉是我國(guó)特有樹(shù)種[1]，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)，近年來(lái)，云南、廣西、廣東、安徽、江蘇、河南、山東等地均有引進(jìn)栽培。柳杉具有材質(zhì)優(yōu)良、樹(shù)形優(yōu)美、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)良的園林綠化與用材樹(shù)種。

柳杉具有較高的生態(tài)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，適應(yīng)性強(qiáng)且分布廣泛。但在現(xiàn)階段，柳杉存在品種數(shù)量少、品種單一等問(wèn)題，在一定程度上限制了柳杉的推廣應(yīng)用。在植物的生長(zhǎng)演化過(guò)程中，花粉不易受到外部環(huán)境的影響，其形狀大小、表面紋飾等形態(tài)特征較為穩(wěn)定，花粉遺傳具有保守性[2]。而花粉的形態(tài)特征等生物學(xué)特性，既是植物雜交育種的生物學(xué)基礎(chǔ)，也是物種種質(zhì)鑒定的重要依據(jù)[3]，并且花粉的形態(tài)特征研究能夠?yàn)槲锓N的親緣關(guān)系以及起源和演化提供可靠依據(jù)[4-5]。因此培育柳杉新品種，選育出多粉多花、花粉質(zhì)量高的優(yōu)良授粉品種是柳杉育種工作中的重要目標(biāo)之一。我國(guó)對(duì)柳杉的研究目前主要集中于種質(zhì)遺傳資源、種群遺傳、人工林[6-9]以及病蟲(chóng)害[10-12]等方面，而關(guān)于柳杉雄球花和花粉以及育種方面的研究比較少見(jiàn)。柳杉是風(fēng)媒花，花粉必須經(jīng)過(guò)從雄球花到胚珠孔的過(guò)程才能完成受精，而花粉的質(zhì)量越輕、體積越小，花粉量越大，可使得傳播距離更長(zhǎng)，提高授粉效率[13-15]。因此研究柳杉的花粉及其形態(tài)特征非常必要。本研究通過(guò)對(duì)6個(gè)柳杉品種雄球花及其花粉形態(tài)結(jié)構(gòu)的對(duì)比研究，探究不同品種柳杉雄球花及花粉結(jié)構(gòu)上的異同以及相互之間對(duì)應(yīng)的關(guān)系，篩選出適合作為柳杉授粉良種的品種，為柳杉新品種的育種工作打好基礎(chǔ)并提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料取自福建霞浦楊梅嶺國(guó)有林場(chǎng)的6個(gè)不同柳杉品種：‘黃龍11號(hào)’‘日本011’‘本場(chǎng)68號(hào)’‘81種源Q18’‘87種源R6’以及‘林場(chǎng)007’，均選取樹(shù)齡為20 a、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的植株采集樣本。

1.2 研究方法

1.2.1 雄球花形態(tài)觀察

于2021年3月，采集散粉期或散粉前期帶有雄球花的枝條。于Leica S6D型體視顯微鏡下觀察單小枝雄球花及單雄球花形態(tài)，拍照，并分別測(cè)量各品種單雄球花數(shù)量、質(zhì)量、縱徑、橫徑等形態(tài)特征。

1.2.2 單球花粉量的測(cè)定

取出完整未裂開(kāi)的雄球花5枚，放入離心管中，25℃恒溫烘箱中烘干，使雄球花完全裂開(kāi)，倒出花粉，加入1 mL蒸餾水，充分震蕩，使花粉粒均勻分布于溶液中，然后取5 μL溶液滴于載玻片上，顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)花粉粒數(shù)。

花粉量（每粒）=每張載玻片上的花粉?？倲?shù)×200。

1.2.3 花粉形態(tài)亞顯微觀察

采集散粉期或散粉前期的雄球花，經(jīng)2.5%戊二醛固定48 h后，分別用PBS緩沖液、蒸餾水各清洗2次，依次經(jīng)不同梯度濃度的酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫 水，過(guò)渡到叔丁醇中后，冷凍干燥；干燥后的樣品在JFC1600型離子濺射儀中鍍金20 min后，于JSM-6380LV型掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)。選擇具有代表性的視野觀察花粉的形態(tài)并拍照記錄。利用電鏡測(cè)量工具，隨機(jī)選取10個(gè)花粉測(cè)量花粉形態(tài)指標(biāo)，重復(fù)3次?；ǚ坌螒B(tài)指標(biāo)包括極軸長(zhǎng)（P）、赤道軸長(zhǎng)（E）及極赤比（P/E）。小孢子葉的處理與花粉一致。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及平均值的計(jì)算。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種雄球花的形態(tài)特征

對(duì)不同品種柳杉的雄球花外觀進(jìn)行顯微觀察，并對(duì)其縱徑、橫徑、單球質(zhì)量、雄球花粒數(shù)以及花粉量進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)圖1～3及表1。

表1 雄球花外觀特征?Table 1 The appearance characteristics of the male cones of C.japonica var.sinensis

圖1 6個(gè)品種帶雄球花小枝及單個(gè)雄球花形態(tài)觀察Fig.1 Stereomicroscope observation on the branchlets with male cones and single male cones of the six varieties of C.japonica var.sinensis

由體式顯微鏡觀察結(jié)果（圖1）可知，6個(gè)品種柳杉雄球花均集生于小枝上半部分，外觀形狀均為長(zhǎng)橢圓形，由多個(gè)小孢子葉沿中軸呈螺旋狀排列。6個(gè)品種柳杉單枝雄球花的數(shù)量、外觀大小等存在一定差異。其中，‘黃龍11號(hào)’單枝雄球花數(shù)最少，體積最小，體型為細(xì)長(zhǎng)橢圓形，著生于小枝上部但不在頂端，生長(zhǎng)緊湊，葉片較大、較長(zhǎng)，顏色淺綠?！毡?11’雄球花體型橢圓，著生于小枝頂端，生長(zhǎng)較緊湊，葉片較小，顏色深綠?！緢?chǎng)68號(hào)’雄球花形體型為較矮胖的橢圓形，橫徑大，縱徑小，著生于小枝上部分，生長(zhǎng)較緊湊；葉片較大，顏色淺綠，雄球花上的小孢子葉下部分能清楚地看到花粉囊的位置及數(shù)量（圖1c）。‘81種源Q18’小枝和雄球花最為細(xì)長(zhǎng)，雄球花體型為細(xì)長(zhǎng)的橢圓形，著生于小枝上部分，生長(zhǎng)稀疏，穿插于葉片之間，葉片較大，為綠色?！?7種源R6’雄球花為橢圓形，小枝較其他品種短，雄球花體積較大，集生于小枝頂端，生長(zhǎng)緊湊，葉片小，顏色淺綠?！謭?chǎng)007’雄球花上部分尖，集生于小枝上部分，生長(zhǎng)較緊湊，葉片小，較寬，顏色深綠。

對(duì)6個(gè)不同品種柳杉雄球花大小及花粉量進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)圖2。6個(gè)品種柳杉雄球花的縱徑、橫徑、單球質(zhì)量、雄球花粒數(shù)以及花粉量存在顯著性差異?！S龍11號(hào)’除花粉量外，其余指標(biāo)均最小，花粉量?jī)H次于‘林場(chǎng)007’及‘本場(chǎng)68號(hào)’。‘81種源Q18’雄球花縱徑最大，但單球質(zhì)量較小?！緢?chǎng)68號(hào)’橫徑最大，單球質(zhì)量最重?！謭?chǎng)007’單球質(zhì)量最小，橫徑最小，縱徑處于中間值，但柳杉單枝上雄球花粒數(shù)以及花粉量最大。

圖2 6個(gè)品種柳杉雄球花及花粉形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of male cones and pollen of the six varieties of C.japonica var.sinensis

對(duì)各品種小孢子葉進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖3。小孢子葉分腹面及背面，腹面著生有多個(gè)花粉囊，花粉囊沿葉柄排列在小孢子葉下方，表面有網(wǎng)狀紋飾，散粉時(shí)花粉囊縱向開(kāi)裂。不同品種柳杉的小孢子葉上花粉囊數(shù)量不一致，‘黃龍11號(hào)’‘日本011’‘81種源Q18’花粉囊數(shù)量為3～4個(gè)；‘本場(chǎng)68號(hào)’花粉囊數(shù)量為3～5個(gè)；‘林場(chǎng)007'花粉囊數(shù)量有4～6個(gè)，‘林場(chǎng)007’花粉囊數(shù)量最多，‘本場(chǎng)68號(hào)’次之。圖2結(jié)果顯示：‘林場(chǎng)007’單雄球花的花粉量最大，其次為‘本場(chǎng)68號(hào)’。

圖3 6個(gè)品種柳杉小孢子葉及花粉囊Fig.3 Observation on microsporophyll morphology of the six varieties of C.japonica var.sinensis

2.2 不同品種花粉的形態(tài)特征

通過(guò)掃描電子顯微鏡對(duì)6個(gè)品種柳杉的花粉形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果（圖4）可知，6個(gè)品種的花粉都為單?；ǚ?，花粉粒形態(tài)相近，為球形或近球形，未見(jiàn)萌發(fā)孔，極面觀以及赤道面觀都為圓形或近圓形，在花粉遠(yuǎn)極面具有一個(gè)乳頭狀突起，乳頭狀突起直立或向一側(cè)彎曲，其長(zhǎng)度在5.4～6.4 μm之間，附近外壁較薄，遠(yuǎn)極面有時(shí)向內(nèi)凹。柳杉花粉壁的表面紋飾為兩種不同直徑的瘤狀顆粒，小直徑的顆粒排列緊密，覆蓋在花粉表面，大直徑刺瘤狀顆粒分布不均，散落或成堆重疊在小直徑顆粒之上。

進(jìn)一步對(duì)6個(gè)品種柳杉的花粉大小進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)表2?！S龍11號(hào)’花粉極軸長(zhǎng)25.53 μm，赤道軸長(zhǎng)22.99 μm，P/E值為1.110，花粉表面小直徑顆粒緊密覆蓋，大直徑刺瘤狀顆粒紋飾分布稀疏，遠(yuǎn)極面內(nèi)凹時(shí)乳頭狀突起周圍外壁多被小直徑顆粒覆蓋；‘日本011’花粉極軸長(zhǎng)27.84 μm，赤道軸長(zhǎng)25.09 μm，P/E值為1.110，花粉表面大直徑刺瘤狀顆粒紋飾分布稀疏，但比‘黃龍11號(hào)’分布多；‘本場(chǎng)68號(hào)’花粉極軸長(zhǎng)28.25 μm，赤道軸長(zhǎng)25.65 μm，P/E值為1.101，表面大直徑刺瘤狀顆粒紋飾分布與日本011相差不大；‘81種源Q18’花粉極軸長(zhǎng)28.23 μm，赤道軸長(zhǎng)25.82 μm，P/E值為1.094，花粉表面大直徑刺瘤狀顆粒紋飾分布稀疏；‘87種源R6’花粉極軸長(zhǎng)28.84 μm，赤道軸長(zhǎng)25.36 μm，P/E值為1.137，花粉表面大直徑刺瘤狀顆粒紋飾分布比前4個(gè)品種緊湊；‘林場(chǎng)007’花粉極軸長(zhǎng)26.68 μm，赤道軸長(zhǎng)25.01 μm，P/E值為1.066，花粉表面大直徑刺瘤狀顆粒分布在6個(gè)品種中最為緊密。

表2 6個(gè)品種柳杉花粉粒形態(tài)特征?Table 2 Pollen morphological characteristics of the six varieties of C.japonica var.sinensis

6個(gè)品種柳杉雄球花花粉的極軸長(zhǎng)為22.72～33.21 μm，花粉的赤道軸長(zhǎng)為19.56～29.18 μm。6個(gè)品種的P/E值范圍為1.066～1.137，花粉均為球形或近球形。花粉粒體積最大的為‘81種源Q18’，最小的為‘黃龍11號(hào)’。

對(duì)6個(gè)品種柳杉花粉的極軸、赤道軸及極赤比進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果（表3）可知，6個(gè)柳杉品種之間，花粉的極軸以及赤道軸都存在極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明各品種間的花粉大小存在顯著性差異；而各品種間花粉極赤比差異不顯著，這說(shuō)明各品種間花粉形狀無(wú)顯著性差異。

表3 6個(gè)品種柳杉花粉粒大小顯著性分析?Table 3 Variance analysis of pollen morphology of the six varieties of C.japonica var.sinensis

3 討 論

雄球花是裸子植物的雄花序，其著生位置及花粉性狀直接影響花粉傳播效率以及授粉成功率，當(dāng)雄球花著生于枝頂并居于樹(shù)冠外層時(shí)能夠有效地減小枝葉對(duì)傳粉的阻礙作用，有利于植物的散粉以及授粉[14]。本研究中，‘日本011’與‘87種源R6’雄球花著生于小枝頂端，其余品種均著生于小枝上部，著生位置都有利于散粉。6個(gè)品種柳杉枝葉均較小，枝葉對(duì)花粉傳播的阻礙作用較小。柳杉雄球花由小孢子葉沿中軸螺旋狀排列而成，小孢子葉背部盾形、蠟質(zhì)的特征可保護(hù)位于小孢子葉腹部的花粉囊。柳杉散粉期一般為雨季，小孢子葉背部特征可疏水，防止雨水進(jìn)入花粉囊影響散粉。‘林場(chǎng)007’一般具有5～6個(gè)花粉囊，‘本場(chǎng)68號(hào)’為3～5個(gè)，其余品種均在2～5個(gè)之間，而花粉量最大的是‘林場(chǎng)007’，其次是‘本場(chǎng)68號(hào)’。根據(jù)花粉囊數(shù)量以及花粉量可推測(cè)，‘林場(chǎng)007’由于花粉囊數(shù)量多，產(chǎn)生了更大的花粉量，從而呈現(xiàn)出多花多粉多果的性狀。因此，花粉囊數(shù)量可能是‘林場(chǎng)007’呈現(xiàn)多粉性狀的主要緣由之一，此推測(cè)有待進(jìn)一步論證。

植物花粉粒的大小、形狀、數(shù)量等形態(tài)特征穩(wěn)定、可靠，能夠作為鑒別植物科、種、屬的依據(jù)[16-17]。本研究中，柳杉屬不同品種之間的花粉在形狀、乳頭狀突起位置、外壁紋飾等方面的相似性表明各品種在屬的水平上表現(xiàn)出一致性：花粉均為球形單?；ǚ郏粯O面觀及赤道面觀均為圓形或近似圓形；遠(yuǎn)極面具一個(gè)乳頭狀突起，附近外壁較?。换ǚ哿Ｍ獗诒砻婕y飾均分為兩層不同直徑的瘤狀顆粒。這與席以珍[15]的研究結(jié)果一致。

6個(gè)品種間花粉的極軸、赤道軸存在極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明柳杉屬不同品種（種）間植物花粉大小存在一定差異。6個(gè)品種柳杉的花粉特征在一定程度上也表現(xiàn)出差異性。馮琪等[18]認(rèn)為同屬不同種的植物花粉的外壁紋飾類型、形狀極軸長(zhǎng)度、P/E值既能反映種間差異，也能反映近緣物種間一定的親緣和進(jìn)化關(guān)系。

韓子云等[19]、張敏等[20]對(duì)不同科屬裸子植物的花粉形態(tài)研究結(jié)果表明，同科不同屬植物之間花粉形態(tài)存在一定差異性，且可從花粉外壁表面顆粒紋飾直徑與小刺個(gè)數(shù)之間的關(guān)系、外壁微顆粒的分布位置、花粉表面顆粒上小刺的寬度與高度間關(guān)系等數(shù)據(jù)來(lái)區(qū)分鑒別。柳杉6個(gè)品種中，花粉粒表面紋飾的最大差異在于花粉粒表面大直徑刺瘤狀顆粒的數(shù)量及分布，‘林場(chǎng)007’花粉粒表面大直徑刺瘤狀顆粒最多，分布最為緊密，其次是‘87種源R6’；‘黃龍11號(hào)’花粉粒表面大直徑刺瘤狀顆粒最少，分布最為稀疏。關(guān)于花粉表面刺狀結(jié)構(gòu)，前人曾提出兩種假說(shuō)：第一種認(rèn)為花粉表面的刺狀紋飾結(jié)構(gòu)能夠有效地防止蜂類動(dòng)物采集花粉；第二種則認(rèn)為刺狀結(jié)構(gòu)有利于幫助花粉附著在傳粉者身體表面，從而提高授粉效率。柳杉作為風(fēng)媒植物無(wú)需附著于傳粉者身體表面進(jìn)行傳粉，但蜂類以及蛾類動(dòng)物的“偷粉”行為會(huì)對(duì)裸子植物的傳粉和有性生殖適合度造成傷害[21]，在一定程度上影響了花粉的授粉效率。6個(gè)品種中，‘林場(chǎng)007’花粉粒表面刺瘤狀顆粒最多，分布最為緊密，在第一種假說(shuō)成立的基礎(chǔ)上，可以認(rèn)為‘林場(chǎng)007’花粉粒表面多刺瘤狀顆粒的性狀能提高花粉授粉率。針對(duì)第一種假說(shuō)，后續(xù)可以進(jìn)行進(jìn)一步的研究，探究柳杉花粉表面紋飾結(jié)構(gòu)對(duì)于提高花粉授粉率的作用。

植物花粉的傳播距離受自身質(zhì)量、體積、氣溫、風(fēng)力、氣壓等多重因素影響[18]，但在不考慮外部氣候因素的條件下，花粉的質(zhì)量、體積等自身因素是影響傳播距離的重要因素。本研究6個(gè)柳杉品種中，‘林場(chǎng)007’雄球花的單球質(zhì)量最小，但花粉量最大，單位花粉粒的質(zhì)量輕，且‘林場(chǎng)007’花粉體積小，結(jié)合其花粉量大、著生的花粉囊多等優(yōu)點(diǎn)，認(rèn)為就其花粉質(zhì)量及其形態(tài)特征而言，‘林場(chǎng)007’品種可作為柳杉授粉良種，可以考慮將其用于柳杉品種的培育工作。在本研究中，對(duì)柳杉花粉的研究只局限于花粉的形態(tài)特征，而未對(duì)花粉活力及其萌發(fā)效率進(jìn)行進(jìn)一步的研究，下一步應(yīng)對(duì)其進(jìn)行更深層次的研究工作，并且可將‘林場(chǎng)007’品種應(yīng)用于新品種選育工作以印證本文觀點(diǎn)。

4 結(jié) 論

6個(gè)柳杉品種雄球花均著生于枝頂或小枝上部，枝葉較短小，枝葉對(duì)花粉傳播的阻礙作用較小，有利于花粉的散發(fā)與傳播，其中以“林場(chǎng)007”的小枝最短，為3.4±0.3 cm。6個(gè)品種柳杉雄球花均為長(zhǎng)橢圓形，各品種之間雄球花的形態(tài)特征存在顯著性差異。不同品種小孢子葉內(nèi)觀察到的花粉囊數(shù)量不一致，其中以‘林場(chǎng)007’花粉囊數(shù)量最多，其次是‘本場(chǎng)68號(hào)’?；ǚ哿颗c花粉囊數(shù)量的觀測(cè)結(jié)果具有相似的趨勢(shì)，‘林場(chǎng)007’花粉量最大，‘本場(chǎng)68號(hào)’次之。各品種柳杉雄球花均為長(zhǎng)橢圓形，花粉均為球形或近球形，小型花粉，花粉囊縱裂，各品種花粉粒大小存在顯著性差異，但花粉形狀無(wú)顯著性差異，表明各品種在屬的水平上具有一致性。就花粉質(zhì)量、數(shù)量以及形態(tài)特征而言，‘林場(chǎng)007’相對(duì)于其他5個(gè)品種更具有授粉優(yōu)勢(shì)，可考慮將其作為柳杉授粉良種，應(yīng)用于柳杉育種工作。