李樹戰(zhàn)，王藝儒，孫 鵬，李華威，傅建敏

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究所，河南 鄭州 450003；3.經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450003）

柿Diospyros kakiThunb.為柿科Ebenaceae柿屬Diospyros多年生植物，是我國重要的木本糧食樹種，綜合利用價(jià)值高[1]。柿樹起源我國，歷史悠久，分布廣泛，主要產(chǎn)區(qū)為陜西、河南和廣西等地[2]。柿花性復(fù)雜，絕大多數(shù)柿品種為完全雌株，少數(shù)品種為雌雄同株和三全同株，僅有野生資源中含有少量的完全雄株[3]。自然界的缺乏，加上生產(chǎn)上對(duì)雄株不斷改接，使得優(yōu)良授粉父本嚴(yán)重缺乏，限制了雜交育種的開展，目前在日本甜柿中已出現(xiàn)近交衰退現(xiàn)象[4-5]。通常性別類型的進(jìn)化過程是由兩性花株開始，經(jīng)雌全同株或雌雄同株階段分化為雌雄異株，進(jìn)而分化出三全同株或雄全同株[6]。

目前報(bào)道的柿雄全同株性別類型的資源僅有中國林科院經(jīng)濟(jì)林所柿屬植物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)從實(shí)生后代中選育出的‘龍巖野柿1號(hào)’，經(jīng)連年觀測(cè)，‘龍巖野柿1號(hào)’花序?yàn)槿浜仙蹅阈危行幕閮尚曰ǖ母怕蚀笥?0%，側(cè)花為兩朵雄花[7]。Li等[8]對(duì)‘龍巖野柿1號(hào)’進(jìn)行組織及形態(tài)學(xué)觀察，確定了雄全同株樣品雄花花芽和兩性花花芽的發(fā)育關(guān)鍵階段，并通過激素含量的測(cè)定和基因表達(dá)量的檢測(cè)，確定了花芽分化過程中的關(guān)鍵基因。雄全同株材料的發(fā)現(xiàn)對(duì)闡明柿性別分化機(jī)理和人工培育產(chǎn)生可育花粉的優(yōu)良種質(zhì)具有重要意義，因此，有必要開發(fā)可早期鑒定雄全同株類型的分子標(biāo)記，加快柿分子標(biāo)記輔助育種及良種選育進(jìn)程。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）一般由1～6個(gè)堿基作為基元重復(fù)串聯(lián)而成的DNA序列，在基因組中具有分布廣泛、多態(tài)性高和結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。柿屬植物早期通過NCBI上的EST序列等開發(fā)SSR引物，獲得的SSR引物數(shù)量少[11]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可快速、大量鑒定SSR位點(diǎn)的序列信息和分布情況，為尚無參考基因組的物種提供了極大的便利。

目前柿屬植物中利用轉(zhuǎn)錄組開發(fā)SSR引物的報(bào)道較少，僅有杜改改等[12]對(duì)雌雄同株的‘禪寺丸’柿雌雄花芽轉(zhuǎn)錄組和張曉娜等[12]對(duì)君遷子Diospyros lotus葉片轉(zhuǎn)錄組的SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析。本研究基于‘龍巖野柿1號(hào)’兩個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的雄花花芽和兩性花花芽的轉(zhuǎn)錄組信息，對(duì)雄花或兩性花發(fā)育過程中的基因進(jìn)行SSR位點(diǎn)的序列特征及分布情況分析，不僅可以豐富柿屬植物SSR位點(diǎn)的信息，并且可用于開發(fā)柿性別類型相關(guān)的SSR分子標(biāo)記，以期為雜交后代性別類型早期鑒定的分子輔助育種、親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜構(gòu)建等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為6年生雄全同株的‘龍巖野柿1號(hào)’，種植于河南省原陽縣中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所原陽基地（34°55′18″～34°56′27″N，113°46′14″～113°47′35″E）。根據(jù)Li等[10]對(duì)‘龍巖野柿1號(hào)’雄花和完全花不同發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)觀察，選取三朵合生花序完全顯現(xiàn)和雄花雌蕊原基敗育2個(gè)階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及組裝

使用TRIzol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取花芽總RNA，質(zhì)量檢測(cè)合格后，用Illumina TruSeq RNA樣品制備的試劑盒（Illumina，San Diego，CA，USA）構(gòu)建mRNA測(cè)序文庫。cDNA文庫質(zhì)檢合格后，委托深圳華大基因生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為BGIseq500平臺(tái)。使用Trinity對(duì)過濾后的clean reads進(jìn)行de novo組裝，在此基礎(chǔ)上對(duì)組裝的轉(zhuǎn)錄本聚類和去冗余，得到unigenes作為參考序列，用于后續(xù)分析[14-15]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（PRJNA647029）。

1.3 SSR分析

采用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行MISA軟件（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）[16]，搜索的單堿基類型SSR重復(fù)數(shù)≥10、雙堿基類型重復(fù)數(shù)≥6和三、四、五、六堿基類型重復(fù)數(shù)≥5的SSR位點(diǎn)，并對(duì)SSR位點(diǎn)的數(shù)量和分布等相關(guān)特征進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘龍巖野柿1號(hào)’SSR位點(diǎn)的數(shù)量

‘龍巖野柿1號(hào)’的雄花和兩性花花芽經(jīng)高通量測(cè)序，共獲得了82 910條unigenes，序列總長度為114 119 802，平均長度為1 376 bp。運(yùn)用MISA軟件，在默認(rèn)參數(shù)條件下對(duì)全部unigenes進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共獲得38 751個(gè)SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為46.74%，SSR位點(diǎn)的平均分布密度為0.34個(gè)/kb，即平均每2.94 kb會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SSR。這些SSR位點(diǎn)分布在25 349條unigenes上，發(fā)生頻率為30.57%。其中含有1個(gè)以上SSR位點(diǎn)的unigenes序列有8 481條，占總unigenes序列數(shù)的10.23%；含有復(fù)合型SSR位點(diǎn)的unigenes序列有4 799條，占總unigenes序列數(shù)的5.79%。可以認(rèn)為‘龍巖野柿1號(hào)’雄花及兩性花花芽轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)比較豐富。

表1 ‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組信息及SSR分析結(jié)果Table 1 Analysis of SSR and information of the D.kaki ‘Longyanyeshi 1’ transcriptome data

2.2 ‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型分析

對(duì)‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組的SSR位點(diǎn)進(jìn)行各重復(fù)類型的數(shù)目、占比及出現(xiàn)頻率等進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。SSR重復(fù)類型豐富，單堿基重復(fù)類型至六堿基重復(fù)類型均存在，但重復(fù)類型間的SSR位點(diǎn)數(shù)目有較大差異，雙堿基重復(fù)類型SSR位點(diǎn)數(shù)目最多，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的50.59%，在unigenes上的出現(xiàn)頻率為50.59%，平均分布距離最近，每5.82 kb就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)雙堿基重復(fù)類型SSR位點(diǎn)。五堿基重復(fù)類型SSR位點(diǎn)數(shù)目最少，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的0.36%，出現(xiàn)頻率為0.17%，平均分布距離最遠(yuǎn)，為815.14 kb。

表2 ‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基元類型數(shù)量和分布Table 2 Number and distribution characteristics of SSR repeat types in the transcriptome of D.kaki ‘Longyanyeshi 1’

2.3 ‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基元特征分析

‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組的38 751條SSR位點(diǎn)共由148種重復(fù)基元構(gòu)成，單堿基重復(fù)至六堿基重復(fù)分別有2、4、10、28、34和70種基元。以AG/CT為重復(fù)基元的SSR數(shù)目最多（13 622個(gè)，占比35.15%）），其次為A/T（8 834，22.8%）、

AT/AT（4183，10.79%）、AAG/CTT（3 011，7.77%）和AC/GT（1 737，4.48%）。單堿基重復(fù)以A/T為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，出現(xiàn)頻率為10.65%；雙堿基重復(fù)的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元為AG/CT，出現(xiàn)頻率為16.43%；三堿基重復(fù)的優(yōu)勢(shì)基元為AAG/CTT，出現(xiàn)頻率為3.63%；四堿基重復(fù)的優(yōu)勢(shì)基元為AAAG/CTTT（174，0.45%），出現(xiàn)頻率為0.21%；五堿基重復(fù)和六堿基重復(fù)的重復(fù)基元類型豐富，但數(shù)量較少，優(yōu)勢(shì)基元分別為AAAAG/CTTTT（35，0.09%）和AGGGCG/CCCTCG（19，0.05%），出現(xiàn)頻率均不足0.1%。另外，在‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組中還發(fā)現(xiàn)了以CG/CG（63，0.16%）和CCG/CGG（696，1.80%）為重復(fù)基元的SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率分別為0.08%和0.84%。

表3 ‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基元序列特征Table 3 Characteristics of SSR motifs in the transcriptome of D.kaki ‘Longyanyeshi 1’

2.4 ‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組各基元重復(fù)次數(shù)分析

由表4可知，‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的基元重復(fù)次數(shù)以5～20為主，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的98.47%，且重復(fù)基元的數(shù)量隨重復(fù)次數(shù)的增加呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。單堿基重復(fù)的重復(fù)次數(shù)集中在10～16次，占單堿基重復(fù)類型SSR位點(diǎn)數(shù)的89.34%；雙堿基重復(fù)的重復(fù)次數(shù)集中于6～16次，占雙堿基重復(fù)類型SSR位點(diǎn)數(shù)的93.62%；三堿基重復(fù)至六堿基重復(fù)的重復(fù)次數(shù)均集中于5～8次。低重復(fù)（1～5次）的SSR位點(diǎn)數(shù)有4 779個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的12.33%；較低重復(fù)（6～15次）的SSR位點(diǎn)數(shù)有30 618個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的79.01%；中度重復(fù)（16～20次）和高度重復(fù)（20次以上）的SSR位點(diǎn)數(shù)分別有2 763和591個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的7.13%和1.53%。

表4 ‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組SSR不同重復(fù)類型的重復(fù)次數(shù)Table 4 Repeat times of different SSR repeat types in the transcriptome of D.kaki ‘Longyanyeshi 1’

2.5 ‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組SSR序列長度分析

對(duì)‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組SSR長度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)序列長度變化范圍較大，為10～94 bp（圖1），平均長度為17.78 bp，主要集中于10～30 bp。共有4 406個(gè)SSR序列長度＜12 bp，占SSR總數(shù)的11.37%；序列長度介于12～20 bp之間的SSR數(shù)目最多，為22 614個(gè)，占比58.36%；11 731個(gè)SSR序列長度≥20 bp，占比30.27%。單堿基重復(fù)類型SSR長度范圍最大，為12～94 bp，平均長度為12.78 bp；雙堿基重復(fù)SSR長度范圍為12～84 bp，平均長度為19.26 bp；三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)和五堿基重復(fù)的SSR序列長度為15～78、20～48和25～40 bp，平均長度分別為19.12、21.93和25.97 bp；六堿基重復(fù)類型SSR長度范圍最小，為30～48 bp，平均長度最長為31.47 bp。

圖1 ‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組中的SSR長度分布Fig.1 SSR length distribution in the transcriptome of D.kaki ‘Longyanyeshi 1’

3 討 論

隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的發(fā)展，可快速、高效地研究基因的表達(dá)水平、定位功能基因并開發(fā)分子標(biāo)記[17]。本研究對(duì)‘龍巖野柿1號(hào)’雄花花芽和兩性花花芽在兩個(gè)關(guān)鍵發(fā)育期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了SSR序列特征分析，共計(jì)獲得了38 751個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于25 349條unigenes上，SSR位點(diǎn)在unigenes上的發(fā)生頻率為30.57%，遠(yuǎn)大于同為柿屬植物的君遷子（10.71%）[13]?！垘r野柿1號(hào)’花芽轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)平均分布距離為2.94 kb，與‘禪寺丸’柿花芽轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)較為接近（2.3 kb）[12]，小于柿近緣種君遷子葉片的SSR位點(diǎn)（5.52 kb）[13]，平均分布距離的差異可能與柿屬植物間的親緣關(guān)系、采樣組織的測(cè)序深度和拼接質(zhì)量及MISA軟件設(shè)置的參數(shù)等原因相關(guān)[18]?！垘r野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組的SSR位點(diǎn)豐富，對(duì)性別分化研究、親緣關(guān)系分析及分子標(biāo)記開發(fā)等具有重要意義。

SSR堿基重復(fù)類型共有6種，且在不同物種中的出現(xiàn)頻率存在明顯差異[19]?！U寺丸’柿以單堿基重復(fù)類型SSR位點(diǎn)數(shù)量最多，占比47.63%[12]；君遷子以單堿基重復(fù)和雙堿基重復(fù)類型SSR位點(diǎn)為主，分別占比39.87%和37.22%[13]；而‘龍巖野柿1號(hào)’雙堿基重復(fù)類型SSR位點(diǎn)數(shù)目最多，占比23.65%，這與花椰菜[20]、黨參[21]、茶樹[22]和中國櫻桃[23]一致。單堿基重復(fù)和雙堿基重復(fù)類型是柿屬植物主導(dǎo)堿基重復(fù)類型，這與植物轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)常以單堿基、雙堿基和三堿基重復(fù)為優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型的規(guī)律相一致[24]。在搜索到的全部SSR位點(diǎn)中，單堿基、雙堿基和三堿基重復(fù)類型分別以A/T、AG/CT和AAG/CTT為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，與柿屬植物君遷子和柿‘禪寺丸’一致，與茶樹[25]和楠木[26]完全一致，但在雙堿基和三堿基重復(fù)上分別與苦楝[27]和草原1號(hào)雜花苜蓿[19]有所區(qū)別，可能與不同物種間編碼蛋白的使用差異有關(guān)[28]。另外，在‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中還檢索到了63個(gè)高等植物中不常見的以CG/CG為重復(fù)基元的SSR位點(diǎn)，遠(yuǎn)高于臘梅[29]（6個(gè)）、杜仲[30]（1個(gè)）和甘藍(lán)[31]（1個(gè)），還檢索到了696個(gè)雙子葉植物不常出現(xiàn)的以CCG/CGG為重復(fù)基元的SSR位點(diǎn)，這些SSR位點(diǎn)的出現(xiàn)可能與抗逆和代謝等特定的生理功能有關(guān)，也表明‘龍巖野柿1號(hào)’SSR位點(diǎn)較為豐富，可據(jù)此開發(fā)更多特異的SSR分子標(biāo)記。

SSR位點(diǎn)的多態(tài)性是對(duì)其應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，影響SSR序列多態(tài)性的主要因素包括基元長度和基元重復(fù)次數(shù)。對(duì)‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)次數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)重復(fù)次數(shù)范圍較大，但以5～20為主，且SSR位點(diǎn)的數(shù)目隨著重復(fù)次數(shù)的增加呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。高級(jí)重復(fù)類型SSR位點(diǎn)（四、五和六堿基重復(fù)）的多態(tài)性普遍低于低級(jí)重復(fù)類型（單、二和三堿基重復(fù)）[32]。‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組中雙堿基重復(fù)類型SSR的基元重復(fù)次數(shù)跨度較大并且重復(fù)次數(shù)相對(duì)較多，這一類型的SSR位點(diǎn)可能具有較高的多態(tài)性。另外，SSR序列長度＜12 bp多態(tài)性較低，序列長度12～20 bp多態(tài)性中等，序列長度≥20 bp多態(tài)性較高[32]。‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組中序列長度≥20 bp的SSR位點(diǎn)占比30.27%，遠(yuǎn)高于‘禪寺丸’柿[12]（13.15%）、美國紅楓[33]（11.27%）、大花序桉[34]（16.12%）和銀杏[35]（11.44%）?！垘r野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組中的這些多態(tài)性較高的SSR位點(diǎn)具有較高的應(yīng)用價(jià)值，在柿屬植物的分子標(biāo)記開發(fā)過程中具有較大的潛能。

綜上所述，雄全同株柿‘龍巖野柿1號(hào)’轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)堿基重復(fù)類型以單堿基重復(fù)、雙堿基重復(fù)和三堿基重復(fù)為主，較為豐富，且30.27%的SSR序列長度≥20 bp，多態(tài)性強(qiáng)，說明利用價(jià)值較高。但目前本項(xiàng)研究?jī)H對(duì)轉(zhuǎn)錄組獲得的序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索和特征分析，并未根據(jù)SSR位點(diǎn)信息進(jìn)行引物開發(fā)和驗(yàn)證，這也是后續(xù)擬開展的研究?jī)?nèi)容，即根據(jù)該研究獲得的SSR位點(diǎn)，針對(duì)不同性別類型，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的SSR分子標(biāo)記，用于雜交后代性別類型早期鑒定及遺傳多樣性分析。

4 結(jié) 論

本項(xiàng)研究基于‘龍巖野柿1號(hào)’2個(gè)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的雄花和兩性花花芽轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序數(shù)據(jù)，檢索轉(zhuǎn)錄水平上的SSR位點(diǎn)，并進(jìn)行序列特征和分布情況的分析，在25 349條unigenes上獲得了38 751條SSR序列，發(fā)生頻率高（30.57%），共有11 731個(gè)SSR位點(diǎn)的序列長度≥20 bp（30.27%）。重復(fù)基元類型豐富，單至六堿基重復(fù)基元類型均有分布，以單、雙和三堿基重復(fù)為主，序列長度≥20 bp的SSR位點(diǎn)占比30.27%，有較高多態(tài)性潛能的SSR位點(diǎn)。據(jù)此可以認(rèn)為‘龍巖野柿1號(hào)’雄花和兩性花花芽轉(zhuǎn)錄組獲得的SSR位點(diǎn)具有較大的應(yīng)用潛力，對(duì)后期種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、性別類型相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)、雜交后代早期鑒定及分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。