吳雙虎，侯金星，江 悅，朱俊儒，韋 唯，劉淑娟，夏樹立，韓 靜，安小鵬

(1.三原縣動物疫病預防控制中心，陜西 三原 713800；2.楊凌職業(yè)技術學院 動物工程分院，陜西 楊凌 712100；3.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；4.渭南市動物疫病預防控制中心，陜西 臨渭區(qū) 714000；5.天津市農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112)

泌乳性狀是奶山羊產業(yè)的重要經濟性狀。中國是世界上奶山羊存欄數(shù)最多的國家，但奶中乳蛋白較低，影響了奶制品的質量。因此，為了滿足消費者對高質量乳制品的需求，急需解析奶山羊乳蛋白合成的分子機理，以期快速提高羊乳制品的質量。

乳腺由乳腺上皮細胞和間充質細胞組成。乳腺上皮細胞具有合成、分泌乳汁的功能。泌乳是一個十分復雜的過程，與乳腺導管的正常發(fā)育、體內激素水平等多種因素密切相關。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與多種細胞的免疫應答、增殖、凋亡、異化、侵襲等多種生物進程有著密不可分的聯(lián)系。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，miR-8516可以通過調控斯鈣素2(Stannio calcin 2,2)的表達促進乳腺上皮細胞β-酪蛋白及甘油三酯的分泌。

依賴鈉的碳酸氫鹽轉運體(The sodium-dependent bicarbonate transporter，SLC4A8)可調節(jié)鈉和碳酸氫鹽的運輸以交換氫化物，同介導細胞內多種信號通路并參與多種生理過程。溶質載體4(The solute carrier 4，SLC4)轉運體家族由陰離子交換體(SLC4A1-3和SLC4A9)、Na偶聯(lián)碳酸氫鹽轉運體(SLC4A4和SLC4A5)、電中性Na/碳酸氫鹽共轉運體(SLC4A7和SLC4A10)和電中性Na驅動的碳酸氫鹽轉運體(SLC4A8)組成。這些SLC4蛋白作為第二信使、脂質、結合蛋白、自動調節(jié)域等調節(jié)因子在運輸CO、多種上皮細胞運輸以及細胞內的調節(jié)具有廣泛而重要的生理作用。碳酸氫鹽是維持人體的內環(huán)境穩(wěn)態(tài)主要緩沖物質之一，因此在生長發(fā)育過程中SLC4蛋白會得到廣泛表達，基因發(fā)生突變時則會影響骨骼、胰腺、大腦、腎臟、心臟、甲狀腺和肺等器官的生長發(fā)育和功能。

研究表明SLC4A8主要分布于大腦、心臟和睪丸。目前SLC4A8在乳腺上皮細胞中的功能作用尚不清楚。實驗室前期通過對低泌乳期(產后2 d)、泌乳高峰期(產后90 d)和干奶期(產前7 d)的3只薩能奶山羊的乳腺組織進行高通量測序，根據(jù)生物信息學分析結果篩選出泌乳高峰期差異高表達的Chi-miR-8516并且已驗證48為其靶基因。本試驗首先在體外合成si-SLC4A8，并將其轉染至奶山羊乳腺上皮細胞中，通過CCK-8，EdU試驗，RT-qPCR，Western blot，ELISA檢測等方法，探究si-SLC4A8對奶山羊乳腺上皮細胞增殖及泌乳功能的作用，為闡明乳腺上皮細胞功能的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗所用的乳腺組織采自陜西省扶風縣某奶山羊養(yǎng)殖場，用PBS將乳腺組織沖洗3次后放入已經滅菌并加有青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的PBS溶液中，用組織塊培養(yǎng)法貼壁培養(yǎng)乳腺上皮細胞以備后續(xù)試驗。

試劑和試劑盒：RNAiso Plus試劑(TAKARA)、ELISA試劑盒(TG試劑盒和β-casein試劑盒購于mlbio)、CCK-8試劑盒(ZETA)、EdU試劑盒(Beyotime)、高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)、反轉錄試劑盒(Fermentas)、熒光定量試劑盒(寶生物工程大連有限公司)、LipofectamineTM2000轉染試劑盒(Invitrogen)、β-actin Antibody(Beyotime)、SLC4A8 Antibody(BBI)、青霉素和鏈霉素(Gibco)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)、Opti-MEMⅠ(Gibco)、胎牛血清(Gibco)。

1.2 細胞轉染

將奶山羊乳腺上皮細胞分別培養(yǎng)至6孔板、12孔板、96孔板中，待細胞密度達到70%～80%時，換用F12培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后，將si-SLC4A8、陰性對照組NC(negative control)和si-SLC4A8+miR-8516 inhibitor分別轉染進乳腺上皮細胞中。用細胞轉染專用培養(yǎng)液OPTI-MEMI分別孵育Lipofectamine 2000及si-SLC4A8 5 min后，混合后常溫孵育20 min，再將其加入細胞培養(yǎng)板中放置于37 ℃、5% CO恒溫培養(yǎng)箱中。4 h后將F12培養(yǎng)液更換為含有10%血清細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。

si-SLC4A8序列：sense：5'-GCCCUCAGCUUACAGUGUUTT-3'，antisense：5'-AACACUGUAAGCUGAGGGCTT-3'。

miR-8516 inhibitor序列：5'-GGCCUCCGUUGCCCUCAGCC-3'。引物均合成于上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.3 RT-qPCR

將1.2中所述處理的12孔板中的細胞培養(yǎng)24 h后，用RNAiso Plus試劑按照試劑盒說明書提取各處理組和對照組細胞中的RNA。用20 μL反應體系(10 μL eaction solution，4 μL 5×Prime Script Buffer，1 μL rime Script RT Enzyme Mix I和1 μL RT Prime Mix，加滅菌水至20 μL)反轉錄得到cDNA，反轉錄程序為：37 ℃ 15min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

之后進行RT-qPCR，其反應體系為：12.5 μL latinum RTS SYBR Super Mix，48基因和內參基因β-actin的實時定量引物的上游引物F、下游引物R各1 μL，1 μL cDNA模板，加滅菌水至20 μL；反應程序為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性15 s，退火溫度為60 ℃，退火時間20 s，72 ℃延伸20 s，共進行35個循環(huán)，4 ℃保存。

48基因的實時定量引物如下：

F：5'-CCAGCAGATCACAGCCGTCATC-3'；R：5'-ATCAGCAGGTCCAGGTGGTAGC-3'；內參基因-的實時定量引物如下：

F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'。

試驗結果以-作為內參進行處理，用2分析48 mRNA的相對表達量。

1.4 Western blot

根據(jù)1.2中所述處理6孔板中的細胞，培養(yǎng)48 h后提取細胞中的總蛋白。具體操作：收集細胞，棄去原培養(yǎng)液后用PBS清洗3遍，胰酶充分消化后1 000 r/min離心5 min，棄上清液，留細胞沉淀，向每管沉淀中加300 μL蛋白裂解液和3.0 μL的蛋白酶抑制劑，在4 ℃放置30 min，后12 000 r/min、4 ℃離心10 min，將上清液轉移到1.5 mL的離心管中，加入蛋白上樣液，沸水煮6～8 min獲取細胞總蛋白。

進行SDS-PAGE電泳，先80 V電泳30 min，再換成120 V繼續(xù)電泳至樣品中溴酚藍遷移到分離膠最下端。將蛋白轉到PVDF膜，冰浴，300 mA、80 V電泳1.5 h。轉膜完成后用脫脂奶粉進行封閉2 h，1×TBST緩沖液洗3次，每次10 min。接著按照1∶1 000的稀釋比例進行一抗孵育，4 ℃過夜孵育或室溫搖床上孵育4 h，接著用1×TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min，按照一抗稀釋的方法稀釋二抗，室溫搖床上孵育2 h，用1×TBST緩沖液漂洗3次后即可進行分析顯影和灰度分析。

1.5 細胞活力檢測(CCK-8)

根據(jù)1.2中所述處理96孔板中的細胞，24 h后依照CCK-8試劑盒中的使用說明書，在每孔中加入15 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在520 nm波長下用酶標儀讀取到各孔的吸光值(A)，用以計算細胞的增殖率。

1.6 細胞增殖情況檢測(EdU)

根據(jù)1.2中所述處理96孔板中的細胞24 h后，根據(jù)EdU試劑盒說明書，每孔加入50 μmol/L EdU培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)2 h后用PBS清洗2～3次，加入50 μL細胞固定液，室溫孵育15 min后去除固定液，每孔加入1×Apollo染色反應液100 μL，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后棄染色反應液，加入100 μL滲透劑，脫色搖床孵育10 min后用100 μL甲醇清洗2～3次，再用PBS清洗2～3次；每孔加入100 μL 1×Hoechst 33342反應液，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后棄染色反應液，PBS清洗3次；加入100 μL DAPI溶液(1 μg/μL)，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 ELISA

根據(jù)1.2中所述處理6孔板中的細胞，24 h后收集細胞，按照ELISA試劑盒的使用說明書檢測β-酪蛋白和甘油三酯在奶山羊乳腺上皮細胞中的合成量。具體實驗步驟詳見說明書。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗處理得到的統(tǒng)計數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進行分析，并通過獨立樣本T檢驗的方法分析數(shù)據(jù)的顯著性。三次重復的數(shù)據(jù)結果均用平均數(shù)±標準差(Mean ± SD)表示。差異水平用P值來顯示，<0.05*表示數(shù)據(jù)差異顯著，<0.01**表示數(shù)據(jù)差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 SLC4A8干擾效率檢測

將si-SLC4A8和NC轉染進奶山羊乳腺上皮細胞，通過RT-qPCR和Western blot法分別檢測48在mRNA和蛋白水平的表達量，結果如圖1A所示,si-SLC4A8轉染組中48的mRNA含量較NC組極顯著降低(<0.01)，圖1B顯示,si-SLC4A8組的蛋白表達量較NC組極顯著降低(<0.01)，表明合成的si-SLC4A8干擾效果良好能夠滿足試驗要求。

圖1 SLC4A8干擾效率檢測

2.2 si-SLC4A8對乳腺上皮細胞增殖的影響

為了研究si-SLC4A8對乳腺上皮細胞增殖的影響，將NC、si-SLC4A8、si-SLCA8+inhibitor分別轉染進奶山羊乳腺上皮細胞中，按照CCK-8試劑盒說明書檢測乳腺上皮細胞增殖能力。結果如圖2A所示，轉染si-SLC4A8組乳腺上皮細胞增殖率較NC組極顯著降低(<0.01)，轉染si-SLC4A8+inhibitor組乳腺上皮細胞增殖率較si-SLC4A8組極顯著上升(<0.01)。隨后用EdU方法檢測了乳腺上皮細胞增殖能力，計算EdU-陽性細胞數(shù)目在總細胞數(shù)目中的比例。結果如圖2B、2C所示，與NC組相比，轉染si-SLC4A8后EdU-陽性細胞比例極顯著下降(<0.01)，EdU結果與CCK-8結果均表明si-SLC4A8抑制乳腺上皮細胞的增殖。

圖2 si-SLC4A8對乳腺上皮細胞增殖的影響

2.3 si-SLC4A8對乳腺上皮細胞甘油三酯和β-酪蛋白合成的影響

為了研究si-SLC4A8對乳腺上皮細胞中甘油三酯和β-酪蛋白合成的影響，將NC、si-SLC4A8和si-SLCA8+inhibitor轉染進奶山羊乳腺上皮細胞中，用ELISA試劑盒檢測甘油三酯和β-酪蛋白的含量。結果如圖3A所示，si-SLC4A8轉染組乳腺上皮細胞中的甘油三酯濃度較NC組極顯著下降(<0.01)。如圖3B所示，si-SLC4A8轉染組乳腺上皮細胞中的β-酪蛋白濃度較NC組極顯著下降(<0.01)，si-SLCA8+inhibitor轉染組的β-酪蛋白濃度較si-SLC4A8組極顯著升高(<0.01)。

圖3 si-SLC4A8對乳腺上皮細胞甘油三酯(A)和β-酪蛋白(B)合成的影響

3 討 論

miRNAs不僅可以調節(jié)乳腺干細胞和祖細胞的增殖和分化，對乳腺導管和腺泡的正常發(fā)育也發(fā)揮著重要的調控作用，與此同時乳腺周期性分化和去分化過程中還常常伴隨著乳腺上皮細胞周期性的增殖和凋亡。試驗前期通過高通量測序以及生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)，泌乳高峰期的薩能奶山羊乳腺組織中差異高表達的Chi-miR-8516可以通過PI3K/AKT/mTOR通路促進甘油三酯和β-酪蛋白的合成，通過Ras/MEK/ERK通路促進山羊乳腺上皮細胞(GMECs)的增殖。因此我們設計si-SLC4A8試說明48對奶山羊乳腺上皮細胞增殖及泌乳功能的作用，為闡明乳腺上皮細胞功能的分子機制提供一定的理論基礎。

山羊奶以乳蛋白、乳脂、乳糖、非脂固型物為主要成分。酪蛋白是山羊奶乳蛋白的主要成分，包括κ-酪蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白，占所有蛋白質的70%～80%。β-酪蛋白是一種兩親性磷酸蛋白，約占酪蛋白總量的30%，形成的酪蛋白膠束可以攜帶鈣、磷等礦物質，且與人的酪蛋白相似，更易被人體消化吸收。而甘油三酯是乳脂的最大組成部分(近98%)，包括大量酯化脂肪酸。而且山羊奶中短鏈和中鏈脂肪酸含量較多，這也有利于更高的消化率和更健康的脂質代謝，同時也是羊奶獨特風味的來源。為研究48對于乳成分的影響，通過ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)干擾48后乳腺上皮細胞分泌的甘油三酯和β-酪蛋白顯著下降，表明在乳腺上皮細胞中48可以促進乳腺上皮細胞的甘油三酯和β-酪蛋白的合成。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)與NC組相比，干擾48后乳腺上皮細胞的活力顯著下降，EdU試驗結果表明轉染si-SLC4A8后抑制細胞的增殖，表明在乳腺上皮細胞中48促進乳腺上皮細胞的增殖。目前，關于4家族基因在乳腺方面的功能研究較少，盡管在本研究中證明干擾48后能抑制奶山羊乳腺上皮細胞的增殖、乳蛋白和甘油三酯的合成，但是48對泌乳功能的調控機理仍不完善，有待進一步研究。

4 小 結

綜上所述，本試驗通過RNA干擾抑制48基因的表達，采用CCK-8、EdU試驗分析了si-SLC4A8對乳腺上皮細胞增殖的影響，結果表明，干擾48后顯著抑制乳腺上皮細胞的增殖。ELISA試驗表明，干擾48基因后顯著抑制乳腺上皮細胞中β-酪蛋白和甘油三酯的合成。