許海燕，王 珊，彭修娟，陳衍斌，劉艷紅，侯敏娜，王 青，劉 峰，*

（1.陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075）

地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosaLibosch.）的新鮮或干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品［1］，全國各地均有栽培，是我國常用的大宗中藥樹之一，應用非常廣泛，具有清熱涼血，養(yǎng)陰生津等功效。查閱文獻發(fā)現(xiàn)［2］地黃的主要活性成分為多糖、環(huán)烯醚萜、苯乙醇苷、核苷等，其中多糖和環(huán)烯醚萜類化合物梓醇含量較高?，F(xiàn)代藥理研究表明［3-6］，地黃多糖具有增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)血糖、血脂、抗疲勞焦慮等作用。梓醇具有治療心腦血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、骨質(zhì)疏松癥以及神經(jīng)保護等作用［7］。目前，對于地黃的提取工藝研究多以地黃多糖或梓醇為測定指標，很少以多指標聯(lián)合來考察。故本研究以地黃中多糖和梓醇的提取率為評價指標，采用響應面-滿意度函數(shù)優(yōu)化提取工藝，確定最佳工藝參數(shù)，建立共提取方法，并對地黃的抗氧化活性進行研究，以期為地黃的提取及進一步發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

生地黃購自河南省焦作市，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學楊新杰教授鑒定為玄參科地黃的干燥塊根［Rehmannia glutinosa（Gaertn.）Libosch］；梓醇對照品（110808-202011，純 度≥98%）及葡萄糖對照品（110833-202008，純度≥99.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其它均為分析純。

1.1.2 儀器

Waters-2695高效液相色譜儀（美國waters公司）；TU-1810紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA1004分析天平（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；XY-200粉碎機（永康市松青五金工具廠）。

1.2 地黃多糖含量測定

1.2.1 葡萄糖標準曲線繪制

精密稱取葡萄糖對照品5 mg，置于50 mL的容量瓶，用蒸餾水溶解并定容，配制成濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖標準溶液，吸取上述溶液2、4、6、8、10 mL置于10 mL容量瓶中，再分別加入蒸餾水定容至刻度，即得濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的標準品溶液。分別取1 mL不同濃度標準品溶液加入5%苯酚1 mL及5 mL濃硫酸振蕩均勻，80℃水浴加熱30 min后取出，放涼至室溫待測，蒸餾水為空白對照，在488.5 nm處測得吸光度值并記錄試驗數(shù)據(jù)，濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結果顯示，葡萄糖濃度在0.02～0.10 mg/mL時，線性關系良好，其回歸方程為Y=6.356 1X-0.025 5，相關系數(shù)R2=0.993 8。

1.2.2 供試品溶液的制備與測定

稱取適量地黃粉末，乙醇為提取溶劑，超聲提取后取濾液。濾液于4℃冰箱靜置過夜后離心，上清液減壓濃縮后的干燥物做多糖含量測定。加入適量蒸餾水將多糖溶解并定容，采用“1.2.1”項下方法測定多糖含量，計算多糖提取率。

1.3 梓醇含量測定

1.3.1 色譜條件

色譜條件［8］：色譜柱Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫30℃；檢測波長210 nm；流動相：乙腈/0.1%磷酸（1：99）；進樣體積10μL；流速1 mL/min，對照品和樣品色譜圖如下。

圖1 梓醇對照品、地黃樣品HPLC圖譜（a為梓醇色譜峰）Fig.1 HPLC chromatogram of catalpol standard solution and Rehmannia sample（a is catalpol chromatographic peak）

1.3.2 梓醇標準曲線繪制

精密稱取梓醇對照品1 mg，用流動相定容于100 mL的容量瓶中，配制成濃度為0.01 mg/mL的標準溶液，分別移取標準溶液2、3、4、5、6、7、8 mL置于10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，按照“1.3.1”項下色譜條件進樣，以濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示，梓醇在濃度為0.002～0.008 mg/mL時線性關系良好，回歸方程為Y=304 693X-71 265.7，相關系數(shù)R2=0.999 2。

1.3.3 供試品溶液的制備與測定

按“1.2.2”項下供試品溶液的提取方法，取上清液減壓濃縮后用流動相溶解并定容，按“1.3.1”項下的色譜條件，測定梓醇含量，計算梓醇提取率。

1.4 單因素試驗

本試驗使用控制變量法，在保證其他條件不變的情況下，分別考察乙醇濃度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）、提取時間（10、15、20、25、30、35、40、45 min）、料液比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g）對同時提取地黃中多糖和梓醇提取率的影響。分別稱取8份相同質(zhì)量的地黃粉末，試驗時固定兩個單因素，考察其中一個單因素的變化對地黃多糖和梓醇提取率的影響，最終得到最佳乙醇濃度、提取時間、液料比。

1.5 響應面-滿意度函數(shù)

1.5.1 滿意度函數(shù)

滿意度函數(shù)常常被用于多目標優(yōu)化，操作方便，運用比較廣泛，能智能反映出多因素影響下試驗設計方案的最佳結果，這種方法，是將不同響應值轉(zhuǎn)化為0到1之間的無量綱數(shù)值，可以將多響應值優(yōu)化轉(zhuǎn)變?yōu)閱雾憫祪?yōu)化，易于尋求整體最優(yōu)［9-10］。滿意度函數(shù)公式參考如下：

其中Di（Yi）為總體滿意度，Yi（x）表示對應某個響應值，Yi，min與Yi，max分別表示指標中最低與最高響應值，Wi表示權重，W1＋W2＋……Wn=1，設W1多糖權重，W2為梓醇權重，通過查閱相關文獻［11-12］，地黃活性成分梓醇較多糖重要，故設定W1為0.4，W2為0.6。

1.5.2 響應面分析法

以地黃多糖和梓醇的提取率為指標，以單因素試驗為基礎，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，選取乙醇濃度、提取時間、液料比三因素進行響應面分析，每次試驗平行三次，取平均值。每次試驗得到的多糖及梓醇提取率根據(jù)滿意度函數(shù)轉(zhuǎn)化為總體滿意度值，對試驗結果進行方差分析，確定地黃多糖和梓醇的最佳共提取條件并進行驗證，最終得到最佳提取工藝方案。

1.6 抗氧化活性研究

1.6.1 供試品溶液制備

將“1.2.2”項下得到的上清液濃縮干燥后用30%乙醇制成0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.8、2.1 mg/mL的溶液，進行抗氧化活性試驗。

1.6.2 對照品溶液制備

分別稱取適量的維生素C（VC）與二丁基羥基甲苯（Butylated hydroxytoluene，BHT）對照品按供試品溶液同濃度配制，作為抗氧化的對照品溶液備用。

1.6.3 DPPH自由基清除率測定

精密稱取適量DPPH用無水乙醇配制成濃度為0.04 mg/mL的DPPH自由基溶液。取不同濃度的供試品溶液2.0 mL與2.0 mL的DPPH自由基溶液，在室溫下充分混合均勻，避光反應30 min后在波長為517 nm處測定混合溶液的吸光度記為Ai，樣品溶液和無水乙醇溶液的吸光度值Aj，無水乙醇和DPPH溶液吸光度值Ao，無水乙醇為空白對照，Vc及BHT溶液做陽性對照，按下列公式計算DPPH自由基清除率。

1.6.4 ABTS自由基清除率測定

精密稱取適量的ABTS配制成10 mmol/L的溶液和濃度為4 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合搖勻，避光放置10小時制得ABTS自由基陽離子（ABTS+）原液。取不同濃度供試品溶液各0.1 mL，同ABTS工作液3.9 mL混合后在室溫下避光反應6 min，在734 nm處測定吸光度值（A1），供試品與無水乙醇混合溶液吸光度（A2），無水乙醇做空白對照，以VC及BHT溶液做陽性對照。按下列公式計算ABTS+清除率。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理，采用鄧肯氏法進行顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。所有試驗重復3次，結果以平均值±標準差（±S）表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對地黃多糖及梓醇共提取的影響

圖2（a）為乙醇濃度對地黃多糖和梓醇提取率的影響。從圖中可直觀看出，隨著乙醇濃度的增加，地黃多糖的提取率逐漸下降，10%～40%之間下降的比較明顯，40%以后下降比較緩慢，說明地黃多糖在40%后的乙醇中溶出較少。但地黃梓醇提取率隨著乙醇濃度的增加有所升高，當乙醇濃度達到40%時，梓醇提取率最高，乙醇濃度40%以后梓醇提取率又緩慢下降，綜合考慮同時提取地黃中多糖和梓醇兩種有效成分，故選取30%乙醇濃度為最優(yōu)。

2.1.2提取時間對地黃多糖及梓醇共提取的影響

圖2（b）為提取時間對多糖和梓醇提取率的影響。從圖中可看出，隨著提取時間的延長地黃多糖和梓醇的提取率也隨之增加，多糖和梓醇均在20 min時提取率最高，說明地黃多糖和梓醇在提取20 min時藥材內(nèi)外濃度達到平衡，故選擇提取時間20 min為最優(yōu)。

2.1.3 液料比對地黃多糖及梓醇共提取的影響

用相同的分析方法解析圖2（c）液料比對地黃多糖及梓醇共提取的影響，從圖中看出，地黃多糖和梓醇在液料比5∶1至10∶1時提取率逐漸上升，在10∶1后提取率不再有顯著提高，趨于平穩(wěn)，可能在液料比10：1時，地黃多糖和梓醇幾乎提取完全，故液料比確定10∶1為最佳。

圖2 不同條件對地黃多糖及梓醇共提取的影響Fig.2 Effects of different conditions on extraction of the co-extraction of polysaccharide and catalpol yield

2.2 響應面-滿意度函數(shù)優(yōu)化結果

用響應面軟件對地黃多糖、梓醇共提取工藝進行優(yōu)化。在多糖（Y1）、梓醇（Y2）得率的基礎上計算總體滿意度（D）值，以D為響應值，優(yōu)化地黃多糖和梓醇的共提取條件。設計試驗方案見表1，試驗結果見表2。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and level coding of test

表2 試驗設計方案及結果Tab.2 Experimental design of response surface methodology

依據(jù)Box-Behnken響應曲面法對地黃中多糖及梓醇提取率共提取工藝進行優(yōu)化，以滿意度為響應值，結果設計17組試驗。應用Design-Expert 10軟件分析數(shù)據(jù)，得到了多元二次回歸模型方程：D=0.42+0.026×A+2.838×10-3×B－0.28×C－6.625×10-3×AB－0.044×AC+0.046×BC－0.010×A2－0.011×B2+0.12×C2。方程式中D為滿意度，A為乙醇濃度，B為提取時間，C為液料比。

回歸方差分析見表3，從表中可以看出P模型＜0.000 1，說明模型極顯著。F失擬項=2.03＞0.05，由此可見，失擬項不顯著，模型可信［13-14］。調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.991 9，說明99.19%的響應值變化能夠用該模型解釋。此外，從表3可以明顯看出，各因素的一次項中只有B對響應值的影響無顯著性差異（P＞0.05），說明提取時間對多糖和梓醇提取率影響不顯著；交互項中AB對響應值影響不顯著（P＞0.05），說明乙醇濃度與提取時間之間無影響。以上分析可以看出各因素與響應值間并非單純的線性關系。由一次項P值的大小可以得出各因素對響應值滿意度的影響排序為：液料比（C）＞乙醇濃度（A）＞提取時間（B）。

表3 方差分析表Tab.3 Regression equation analysis of variance table

使用Design-Expert 10軟件繪制而成的響應曲面及等高線圖如圖3（a～c）所示，從這些圖中可以看到3因素的最佳參數(shù)和各因素之間的交互作用。從圖中可看出液料比最佳范圍為5∶1～15∶1，最佳乙醇濃度為25%～35%，最佳提取時間范圍為17～23 min。由圖3（b～c）可明顯看出，其曲面圖較陡峭，說明提取時間與液料比及乙醇濃度與液料比之間的交互作用較顯著，與表3方差分析結果相吻合。

圖3 各因素響應面與等高線分析圖Fig.3 Response surface and contour plot analysis diagram of each factor

根據(jù)Design-Expert 10軟件對模型方程計算整理，可以得出地黃多糖和梓醇的共提取最佳提取工藝為：乙醇濃度為30%，提取時間為15.57 min，液料比為10.05∶1，在此工藝條件下，多糖提取率為17.31%，梓醇提取率為0.94%，為考慮試驗的可操作性，現(xiàn)將工藝調(diào)整為乙醇濃度30%，提取16 min，液料比10∶1，多糖提取率最高為16.15%，梓醇提取率為0.92%，分別比預測值下降1.16%與0.02%，驗證試驗結果與預測值接近，說明本研究建立的回歸模型可較好反映地黃共提取條件，優(yōu)化的工藝結果準確可行。

2.3 抗氧化活性結果分析

2.3.1 DPPH自由基清除率測定結果

圖4（a）為不同濃度地黃對DPPH自由基清除率的關系圖，并與Vc及BHT對照品進行對比。從圖中可以看出，不同濃度供試品對DPPH自由基清除率具有顯著性差異，隨著供試品濃度的增加對DPPH清除率也逐漸增加（P＜0.05），當?shù)攸S濃度為0.3 mg/mL時，地黃對DPPH的清除率為52.16%，清除作用大于標準品抗氧化劑BHT的45.38%（P＜0.05）。從圖中也可看出地黃清除DPPH自由基能力一直小于VC對照品，但從0.3 mg/mL后大于BHT清除率，說明地黃對DPPH自由基有很好的清除能力。

圖4 地黃對不同自由基清除率的影響Fig.4 Effects of different free radical scavenging rates of R.glutinosa

2.3.2 ABTS自由基清除率測定結果

圖4（b）表示不同濃度地黃對ABTS自由基清除率的關系圖，并與Vc、BHT對照品進行對比。從圖中可以明顯看到，不同濃度地黃對ABTS自由基清除率之間具有顯著性差異，且清除率隨著樣品濃度的增加而逐漸增大（P＜0.05），雖然從圖中也可直觀的看出Vc對ABTS自由基清除效果優(yōu)于地黃，但地黃對ABTS自由基的清除率一直高于BHT（P＜0.05）。故地黃對ABTS陽離子自由基也具有一定的清除能力。

3 結論和討論

多糖和梓醇同為地黃中的功效物質(zhì)，實際操作中常對其中一種成分進行提取，同時提取地黃多糖和梓醇的文獻報道較少，故將二者同時提取具有一定的實際意義。雖然地黃多糖可溶于熱水，梓醇在水中也有一定的溶解性，但由于水提液不易保存且雜質(zhì)多，故本試驗采用含水乙醇為提取溶劑，并考察了不同濃度乙醇、提取時間、液料比三種影響因素下多糖和梓醇共提取的提取率，希望能為地黃中多糖和梓醇的共提取方法提供參考，也為地黃的進一步研究提供理論價值。

藥理學研究發(fā)現(xiàn)，地黃對免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等有一定調(diào)節(jié)作用，此外，還可抗衰老、降三高、抑菌、抗腫瘤，保護胃黏膜及抗胃潰瘍等作用［15］。但對于其抗氧化活性鮮少報道，本研究結果發(fā)現(xiàn)，地黃具有顯著的抗氧化活性，且隨著濃度的增加抗氧化活性也隨之增加，這為地黃活性及藥理作用的進一步研究提供一定的參考。

地黃多糖和梓醇的活性及藥理作用得到了越來越多的科學證實，使得地黃的市場需求不斷增大。目前，地黃多糖和梓醇已應用于各種藥理、臨床及保健品領域。另一方面，由于地黃中多糖及梓醇含量均相對較低，直接食用地黃的保健和藥用效果仍相對較差。本研究的顯著特點為地黃多糖和梓醇同時提取，即可獲得提取物中較高含量的多糖和梓醇，因此，本研究所得提取物將為地黃保健品及藥品生產(chǎn)提供生產(chǎn)原料，可有效提高地黃藥效。將為地黃的發(fā)展提供更好的研究思路。