俞可欣 梅紅芳 陳輝耀 張堅濤 胡黎園 程國強 盧宇藍 王慧君 吳冰冰周文浩,4 楊 琳

原發(fā)性小頭畸形(MCPH)又稱常染色體隱性小頭畸形，是一種以頭圍小、面部畸形和智力障礙為特征的罕見遺傳性疾病。主要臨床診斷標準是出生時枕額圍小于同性別和胎齡新生兒2個或以上標準差，6月齡時相差達3個標準差[1]。全世界MCPH的發(fā)病率為1/250 000～1/30 000[2]。MCPH患兒通常預期壽命縮短，同時對患兒的照顧和管理也造成一定的家庭和社會負擔。目前已知的MCPH相關基因中，MCPH5即異常紡錘體同源小頭畸形相關(ASPM)基因報道最多。僅在巴基斯坦人群中，ASPM小頭畸形(ASPM-MCPH)就占MCPH的68.8%[3]。截至目前，人類基因突變數據庫(HGMD)共收錄了ASPM基因255種變異，主要致病變異譜包括無義變異、移碼變異、剪切位點變異。

本文回顧性分析復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)分子醫(yī)學中心通過基因檢測確診的ASPM-MCPH患兒的臨床資料和基因變異情況，并行文獻復習，由此拓展該疾病變異譜，深入對ASPM-MCPH的認知與探究。

1 方法

1.1 小頭畸形臨床診斷標準 ①可提供生后7 d內頭圍測量值，②枕額圍小于出生時同性別、胎齡平均值2個標準差及以上[4]。

1.2 病例納入標準 同時滿足以下3項：①新生兒基因組計劃(CNGP)數據庫中的新生兒病例[5]；②ASPM基因致病/可疑致病(P/LP)的復合雜合或純合變異；③符合新生兒MCPH臨床診斷標準。

1.3 高通量測序分析 取得患兒父母知情同意后，采集患兒外周靜脈血，采用mini blood全血試劑盒(QIAGEN公司，德國)進行基因組DNA提取，NanoDrop 2000(Thermofisher公司，美國)紫外分光光度儀測定其濃度。使用Cleaseq捕獲試劑盒進行基因捕獲，并基于Illumina Hiseq 2000/2500平臺進行序列檢測。測序覆蓋度>98%，平均測序深度>100×。通過高通量測序數據分析流程對變異進行信息注釋和致病性分析[6]。

1.4ASPM基因P/LP變異的評級標準和攜帶頻率評估 根據ACMG指南[7]進行致病性分析，并參考前期P/LP變異評級研究[6, 8]。P變異評級標準： 滿足以下2項，①檢測到該基因純合或復合雜合變異，且可以解釋先證者表型；②已經報道的明確致病變異。LP變異評級標準：同時滿足以下3項中任意2項，其中必須滿足第①項，①檢測到該基因純合或復合雜合變異，且可以解釋先證者表型；②與已知致病變異位點相同但堿基及氨基酸改變不同；③失功能變異(無義變異、移碼變異、剪接位點+/-1或2、起始密碼子變異、單個或多個外顯子缺失)。

鑒于在CNGP數據庫中采集的ASPM基因的P/LP變異的人數局限性，故同時選擇HGMD數據庫(http://www. hgmd.cf.ac.uk)和ClinVar數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)中的收錄ASPM基因的P/LP變異，經由2位遺傳學專家獨自依照ACMG指南進行致病性判定，采用R軟件計算(3.5.1,http://cran.r-project.org)，CNGP數據庫新生兒人群ASPM基因P/LP變異的攜帶頻率=ASPM基因P/LP變異數(單雜合+復合雜合×2+純雜合×2)/CNGP新生兒總例數×2。

1.5 臨床資料提取 CNGP包括了我院和外院新生兒病例，我院新生兒病例從病歷系統(tǒng)中截取如下信息：性別、胎齡、出生體重、分娩方式、產前B超檢查結果、家族史、現病史、體格檢查、MR結果；外院新生兒病例在報送CNGP時需要填寫如上信息。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件探討失功能變異和錯義變異對發(fā)育遲緩的影響。計數資料采用卡方檢驗和Fisher確切概率法進行比較。P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CNGP數據庫中ASPM基因P/LP變異攜帶頻率 圖1顯示，在HGMD和ClinVar數據庫收錄的ASPM基因致病變異分別為224個位點和203個位點。2個數據庫共同收錄155個位點；表1顯示，在CNGP數據庫中攜帶的ASPM基因復合雜合P/LP變異12個位點。12個P/LP變異均為失功能變異，其中無義變異4個、移碼變異7個、剪切位點變異1個。6個變異位于18號外顯子，3個變異位于3號外顯子，2個變異位于23號外顯子，1個變異位于15號外顯子。CNGP數據庫分別與HGMD和ClinVar數據庫各重復1個ASPM基因P/LP變異位點，CNGP數據庫與HGMD和ClinVar數據庫重復4個ASPM基因P/LP變異位點，CNGP數據庫新發(fā)現6個ASPM基因P/LP變異位點。最終納入計算攜帶頻率的致病變異點共163個(圖1中紅色字)。CNGP數據庫中15 754例新生兒，無純合P/LP變異，單雜合P/LP變異26例，復合雜合P/LP變異6例。ASPM致病基因等位基因攜帶頻率是12.060 43/萬。

圖1 ASPM基因致病變異數據庫構成分布圖

表1 6例新生兒ASPM基因變異位點

2.2ASPM基因復合雜合P/LP變異病例一般情況 6例復合雜合P/LP變異新生兒均表現為MCPH，符合本文納入標準；男、女各3例，胎齡在35～39周，出生體重2.15～2.95 kg；產前B超提示：5例雙頂徑偏小，1例胎兒整體偏??；2例有特殊面容，1例前額突出、耳輪廓小，1例小下頜，通貫手和濕疹樣皮損各1例；3例頭顱MR異常表現，1例腦發(fā)育不良(腦回數量略減少、腦溝淺平、腦室擴大、腦外間隙增寬、大腦白質少)；1例小頭畸形伴少腦回畸形；1例顱腦發(fā)育異常伴枕部囊腫，3例頭顱MR未見異常。

3 文獻復習

3.1 臨床表型和基因型關聯(lián)性分析 選取HGMD數據庫(截止到2021年4月)收錄的ASPM基因的P/LP變異224個位點，來源于55篇文獻報告(717例)，雙人獨立篩選和提取臨床表型和基因型，意見不一致時討論決定。排除ASPM基因單雜合P/LP變異4篇(4例)，排除未報告臨床表型11篇(16例)，最終對40篇文獻ASPM基因的P/LP變異168個位點(697例)與臨床表型行關聯(lián)性分析。需要說明的是，臨床表型中發(fā)育遲緩的分級判斷標準參考文獻[9](將智力障礙歸為發(fā)育遲緩)，嚴重發(fā)育遲緩：全智商(FSIQ)<34分或發(fā)育商(DQ)<39分，輕中度發(fā)育遲緩：FSIQ ～90分或DQ ～79分。

168個ASPM基因的P/LP變異位點中，失功能變異162個 (96.4%)，包括無義變異68個，移碼變異80個，剪切位點變異14個；錯義變異6個。

ASPM基因的P/LP變異的697例患兒的臨床表型，①頭面部特征：小頭畸形99.4%(624/628)，前額傾斜82.4%(70/85)；②發(fā)育評估：輕中度發(fā)育遲緩67.3%(233/346)，嚴重發(fā)育遲緩20.5%(71/346)，語言發(fā)育落后47.9%(90/188)，運動發(fā)育落后33.7%(34/101)，行為異常34.2%(77/225)；③MR表現：腦回異常77.9%(81/104)，胼胝體發(fā)育不良47.2%(34/72)，腦室擴大50.0%(36/72)，小腦和/或腦橋發(fā)育不全28.6%(20/70)，腦囊腫3.4%(2/58)，多小腦回10.9%(6/55)；④其他罕見表型：身材矮小33.8%(45/133)，色素減退和/或色素沉著12.8%(6/47)，脊柱側彎12.0%(6/50)，張力減退7.6%(5/66)，手腳畸形1.5%(2/133)，張力亢進4.1%(2/49)，斜視16.3%(8/49)。

346例發(fā)育遲緩患兒中，301例提供了嚴重程度的分級，其中，錯義變異引起輕中度發(fā)育遲緩9例，嚴重發(fā)育遲緩4例；失功能變異導致輕中度發(fā)育遲緩224例，嚴重發(fā)育遲緩64例。在233例輕中度發(fā)育遲緩的患兒中，失功能變異的等位基因型頻率為448/466，錯義變異等位基因型頻率為18/466；在68例嚴重發(fā)育遲緩的患兒中，失功能變異的基因型頻率為128/136。統(tǒng)計分析認為失功能變異和錯義變異導致的發(fā)育遲緩程度差異無統(tǒng)計學意義。錯義變異的基因型頻率為8/136。需要說明的是，由于錯義變異的報道非常少，且無臨床信息或未提供發(fā)育遲緩分度的病例無法列入計算，因此其結果對表型和基因型關聯(lián)性的意義有限，可能存在偏倚。

4 討論

MCPH是一種罕見遺傳性疾病，由神經源性有絲分裂障礙引起。目前發(fā)現與MCPH有關的基因主要在細胞分裂中表達，其變異將導致神經發(fā)生、細胞周期檢查點、中心體和紡錘體定位的中斷，最終造成正常大腦體積的整體縮小，特別是在大腦皮層區(qū)域[3]。有研究新發(fā)現RRP7A[10]、TTI2[11]、LMNB1及LMNB2[12]基因的變異亦可引起小頭畸形，于是MCPH相關基因在熟知的25個基因座的基礎上更進一步[13]，截至目前，OMIM收錄的MCPH相關基因共28個。目前報道的MCPH在遺傳模式上大多數呈常染色體隱性遺傳，僅ALFY、LMNB1和LMNB1基因導致的小頭畸形被認為呈常染色體顯性遺傳[14]。在小頭畸形相關基因中，ASPM基因是報道最多的一個。

ASPM基因位于染色體1q31.3，包含28個外顯子，其編碼的蛋白質包含3 477個氨基酸[15]。ASPM是一種微管負端相關蛋白，在有絲分裂過程中以微管依賴的方式招募到紡錘體的中心周基質(PCM)。ASPM參與了所有分裂細胞的紡錘體組織、紡錘體定位和胞質分裂，該蛋白的C端末端是ASPM定位和功能所必需的[16]。在體內敲除小鼠大腦中的Aspm，導致神經發(fā)生、神經元遷移和皮質層形成的缺陷[17]。 有研究提出，因ASPM基因區(qū)域差異性表達和在增殖祖細胞亞群中受到特異性調控的特性，ASPM-MCPH患者的腦容量在皮質和底層白質皮質下灰質和小腦減少更多[18]。

ASPM-MCPH多見于近親婚配的后代中；但近年來，不少散發(fā)的病例被報道，得益于基因檢測的普及。2019年的文獻分析發(fā)現，ASPM-MCPH患者大多來自巴基斯坦、沙特阿拉伯、埃及和伊朗，其中一些國家有近親結婚的習俗，還有一些ASPM-MCPH家族來自歐洲和美洲[19]。日本[20]、越南[21]也有少量報道。我國于2011年和2020年分別報道了一例復合雜合ASPM小頭畸形的病例[2,21]。既往研究發(fā)現在MCPH患者中，ASPM基因缺陷的檢出率在7%～59.5%[22-24]。也有提及ASPM基因單個變異的人群攜帶率，如在土耳其人群中為0.001 423 6～0.003 847 2[25]。在15 754名參與CNGP的NICU新生兒人群中，ASPM基因P/LP變異攜帶頻率是0.001 206 043，這是首次基于較大規(guī)模的人群基因組數據計算的ASPM基因的攜帶情況。ASPM-MCPH在我國為非常罕見的遺傳疾病，本攜帶率計算基于NICU新生兒人群，因此致病變異的檢出率可能被高估[26]。

本文通過系統(tǒng)整理HGMD收錄的記錄，有較為完整的臨床信息的病例共697例。發(fā)現ASPM-MCPH患兒中，占比>50%的表型特征為：小頭畸形占99.4%，特殊面容占82.35%，輕中度發(fā)育遲緩占67.3%，腦回異常占77.9%，腦室擴大占50.0%。本文報道的6例患兒，均為新生兒期診斷，尚不能評價后期發(fā)育情況。但值得注意的是，5例均在產前已提示胎兒雙頂徑偏小，提示對于此類宮內已明確提示頭圍偏小的患兒，應高度重視。2例患兒存在特殊面容，其中1例為前額突出、耳輪廓小，另1例為小下頜。3例患兒頭顱MR提示異常，其中1例表現為腦回數量略減少，腦溝淺平、腦室擴大、腦外間隙增寬，大腦白質少；小頭畸形伴少腦回畸形1例，顱腦發(fā)育異常伴枕部囊腫1例。2例患兒有皮損表現，其中例3腰背部、雙側臀部大片色素痣，頸部、前胸、下肢小片色素痣。既往報道中有色素減退/色素沉著斑疹表現，但較罕見[18]。病例1頭部和軀干四肢較多濕疹樣皮損，既往未見相關報道，是否為ASPM-MCPH罕見表現，尚無定論。既往報道中的罕見表型與MCPH的關系仍待進一步證明，目前其可能是患兒基因送檢的起因，但不能作為診斷的依據之一。

失功能變異是ASPM-MCPH的主要致病變異譜。本文列入分析的168個變異，發(fā)現ASPM基因的P/LP變異中，絕大多數為失功能變異(96.43%)，移碼變異最多，其次為無義變異，錯義變異僅6個。根據既往報道提供的病例表型，對錯義變異和失功能變異引起發(fā)育遲緩嚴重程度進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計分析認為失功能變異和錯義變異導致的發(fā)育遲緩程度差異無統(tǒng)計學意義。不排除錯義變異的病例少、既往病例信息不足導致統(tǒng)計分析可能存在偏倚的影響。在本文病例篩選過程中，發(fā)現雙等位基因錯義變異或失功能變異/錯義變異的病例，患兒無典型小頭畸形，但有發(fā)育遲緩或孤獨癥的表現，這些基因變異的評級為VUS。ASPM基因的某些錯義變異對神經發(fā)育可能產生負面影響，有一定的致病性，但目前錯義變異病例少，其中的機制有待進一步闡明。

ASPM基因缺陷使MCPH患兒的神經發(fā)育受到不同程度的影響，盡早明確病因有利于精確診斷、治療開展和預后評估。本文6例患兒在產前B超中均發(fā)現頭圍偏小，出生后經基因檢測確診，顯現出分子診斷的精準性和臨床應用價值。本文病例及近年報道的散發(fā)病例有力地證明，基因診斷技術的提高和普及，有利于罕見遺傳病散發(fā)病例被及時發(fā)現，及早治療。ASPM-MCPH患兒需要個體化的對癥治療，在兒?？齐S訪進行發(fā)育評估和行為治療[27]。應為患兒家庭提供遺傳咨詢。

本研究的局限性：①ASPM基因 P/LP變異攜帶頻率的評估在NICU人群中展開，具有人群偏倚，不能代表健康人群P/LP變異等位基因的攜帶水平；②既往報道中錯義變異少，且既往文獻對表型和基因型的描述詳略不一，本文的分析結果僅有一定的參考意義。③在本文的統(tǒng)計分析中，未對輕、中度發(fā)育遲緩進行分類。