頁巖油壓裂采出液低溫生物破乳劑的制備與性能評價*

宮兆波，胡楚霄，嚴 忠，武禹含，郭進周，李琴琴，夏文杰，李國強，馬 挺

（1.中國石油新疆油田分公司實驗檢測研究院，新疆克拉瑪依 834000；2.南開大學生命科學學院，天津 300071；3.新疆科力新技術發(fā)展股份有限公司，新疆克拉瑪依 834000）

0 前言

我國已發(fā)現(xiàn)的低滲透油氣田占新發(fā)現(xiàn)油氣藏的一半以上，低滲透油氣田產(chǎn)能建設規(guī)模已占油氣田產(chǎn)能建設規(guī)?？偭康?0%以上，成為我國油氣開發(fā)建設的主戰(zhàn)場。壓裂改造技術是低滲透油田試油配套技術的核心組成部分，也是提高單井產(chǎn)量和增加可采儲量的關鍵技術［1］。壓裂助劑伴隨在采出液中，致使采出乳狀液乳化類型復雜、穩(wěn)定性高，常規(guī)破乳技術和破乳劑難以發(fā)揮破乳效果，且隨壓裂液濃度的增大，脫水時間延長，破乳效果變差。

工業(yè)上最常用的方法是使用化學破乳劑進行破乳。但隨著采出液破乳難度的提高，化學破乳劑的用量大幅增加，對生態(tài)環(huán)境造成巨大負擔。經(jīng)過油田工作者幾十年的奮斗，新疆油田已成為年產(chǎn)原油千萬噸級的大油田，環(huán)保壓力巨大，因此微生物采油技術等高新技術的應用已成為必然趨勢［2-3］。針對壓裂采出液的環(huán)保型高效破乳劑研發(fā)，對提高油田生產(chǎn)運行技術水平、降低運行成本、減少環(huán)境污染和逐步實現(xiàn)油田開發(fā)的清潔生產(chǎn)有重要意義。

微生物破乳技術是利用微生物細胞本身或其代謝過程以及代謝產(chǎn)物實現(xiàn)破乳［4］。國際上在這一領域的研究十分活躍。自20世紀80年代起，Cooper等發(fā)現(xiàn)諾卡氏菌Nocardia amarae具有生物破乳活力［5］，包括紅球菌、微球菌、球擬酵母等在內(nèi)的破乳菌種陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)［6-8］。國內(nèi)的微生物破乳劑研究約在20 世紀90 年代末起步，馬挺［9］、黃翔峰［10-12］等陸續(xù)篩選出多株具有生物破乳活性的菌種。生物表面活性劑是微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物中最有應用前景的一類物質(zhì)，具有化學方法難以合成的化學基團，其性能良好、生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小、油水破乳功能顯著。研究表明，生物表面活性劑與化學破乳劑復配以后之所以能顯著地提高乳狀液的破乳脫水速率和脫水效率，就在于生物表面活性劑的引入能較顯著地改變油水界面的性質(zhì)，較大程度地降低油水界面張力［13-14］。

本文以新疆瑪東區(qū)塊壓裂采出液為對象，從生物表面活性劑發(fā)酵制備及其破乳性能展開研究，通過菌種篩選、培養(yǎng)、純化、以及復配得到以微生物發(fā)酵制品為核心的微生物破乳體系。研究了生物破乳劑和常規(guī)化學破乳劑的復配破乳效果，并對破乳工藝進行了優(yōu)化。對瑪東區(qū)塊含頁巖油壓裂采出液的高效分離、保證油田的正常運行和經(jīng)濟效益具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

硝酸鈉（NaNO3）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、無水硫酸鎂（MgSO4）、無水氯化鈣（CaCl2）、鉬酸鈉（Na2MoO4）、硫酸銨（（NH4）2SO4）、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉（NaCl）、瓊脂粉、三氯甲烷（CHCl3）、無水乙醇（C2H5OH），分析純，上海麥克林生化科技有限公司；甘油，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；豆油，中糧佳悅（天津）有限公司；乳化劑（Span80）、氯仿、甲醇、硫酸、高氯酸、鹽酸、正丁醇、乙酸，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；茚三酮、蒽酮、鉬酸銨，分析純，天津市匯杭化工科技有限公司；現(xiàn)場使用的聚醚化學破乳劑，K-1、K-2 和K-3 為分子量為7025、5843、6497 Da的三羥甲基丙烷聚醚，K-4為環(huán)氧聚醚，K-1—K-3由安徽鴻煦生物科技有限公司提供，K-4 由新疆科力新技術發(fā)展股份有限公司提供。LB（固體）培養(yǎng)基組成（單位g/L，后同）：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10（瓊脂粉15），pH 值為7.0；甘油培養(yǎng)基組成：甘油30.0、NaNO38.0、K2HPO41.0、NaH2PO41.0、MgSO40.2、CaCl20.1、Na2MoO40.1，pH 值為7.0；蔗糖培養(yǎng)基組成：蔗糖30.0、Na2HPO41.5、KH2PO43.4、（NH4）2SO44.0、MgSO40.07、酵母粉0.05，pH值為7.0。

臺式離心機，美國Eppendorf 公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；恒溫水浴鍋，北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；移液器，美國Gilson 公司；高壓滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海錦屏儀器儀表有限公司；LHZ-180恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠；J2-MC高速冷凍離心機，美國Beckman 公司；發(fā)酵罐，上海百倫生物科技有限公司；GJ-3S數(shù)顯高速攪拌機，青島恒泰達機電設備有限公司；JK99型全自動表面張力儀，上海中晨數(shù)字技術設備有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型乳液的制備

（1）原油模型乳狀液的配制。將瑪東區(qū)塊現(xiàn)場采出液采集后立即密封并常溫運送至實驗室。利用高速攪拌機在10 000 r/min下攪拌20 min，形成黑褐色乳狀液。經(jīng)蒸餾法測得該乳狀液含水率為19.84%，稀釋法鑒定乳狀液類型為W/O型乳狀液。

（2）煤油模型乳狀液的配制。以前述所測原油含水量為基礎配制煤油模型乳狀液，即在60 mL 煤油與40 mL 蒸餾水的混合液中加入1.67 g Span 80，在10 000 r/min 下攪拌1 min，可形成乳白色液體。經(jīng)染色法（沙黃）鑒定為W/O型乳狀液［9］。

1.2.2 生物破乳菌的篩選

選取的生物破乳劑生產(chǎn)菌為嗜油極小單胞菌、紅球菌、銅綠假單胞菌、乙酸不動桿菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌、布氏乳桿菌、腸桿菌、鏈霉菌、迪茨氏菌。其中，紅球菌、銅綠假單胞菌、乙酸不動桿菌、芽孢桿菌、腸桿菌分離自大港、陸梁油田廢水樣，由南開大學保藏；嗜油極小單胞菌、布氏乳桿菌、鏈霉菌、迪茨氏菌購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection）。按照如下步驟進行生物破乳劑的初步篩選評價。

（1）在裝有5 mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中接入100 mL待篩選的菌種，于37 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h 后轉接至LB 固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)48 h。（2）在裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基（甘油或蔗糖培養(yǎng)基）的搖瓶中接入劃線培養(yǎng)所得單菌落，于37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)5 d 后得到全培養(yǎng)液，作為生物破乳劑初步優(yōu)化樣品。（3）根據(jù)李旭［4］、黃翔峰［10］等提出的方法，采用煤油模型乳狀液進行生物破乳劑的初選。若120 min的脫水率≥70%，則說明該全培養(yǎng)液對W/O型乳狀液具有較好的破乳能力，進入下一步篩選。（4）對破乳能力較好的全培養(yǎng)液采用原油模型乳狀液進行篩選，若全培養(yǎng)液120 min 的脫水率≥70%，則說明該全培養(yǎng)液對原油模型乳狀液具有較好的破乳能力，用于下一步生物破乳劑的制備與復配優(yōu)化。

1.2.3 生物破乳劑的制備

通過生物破乳劑的初步篩選得到能合成最優(yōu)生物破乳劑的菌種。為了提高破乳效果，將生物破乳劑進行發(fā)酵合成、提純。（1）在裝有5 mL LB 培養(yǎng)基的試管中加入100 mL 篩選所得菌種，于37 ℃、200 r/min 的搖床中培養(yǎng)24 h 制得種子液。（2）在裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基（蔗糖培養(yǎng)基或甘油培養(yǎng)基）的搖瓶中接入2 mL種子液，于37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h。（3）在裝有5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接入100 mL 擴大培養(yǎng)所得種子液，于37 ℃、150 r/min 的條件下培養(yǎng)7 d。（4）將發(fā)酵液在8000 r/min下離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，再加入等體積的氯仿、甲醇（甲醇、氯仿體積比為2∶1）的混合溶液萃取，充分震蕩萃取，5000 r/min離心20 min，將下層萃取液置于40 ℃旋轉蒸發(fā)儀中除去混合溶液，獲得微生物破乳劑。不同菌種生產(chǎn)的破乳劑分別編號為XJ-1—XJ-10。

1.2.4 表面張力的測定和蛋白、脂質(zhì)與糖類的定性

（1）參照國家標準GB/T 22237—2008《表面活性劑表面張力的測定》，利用拉環(huán)法測定表面張力。（2）蛋白定性。用茚三酮法定性檢測產(chǎn)物中可能存在的氨基酸成分。將10 mg純化樣品溶解于少量超純水中，在硅膠板上點樣，晾干后用0.1%茚三酮溶液潤濕，110 ℃加熱10 min，顯色即代表產(chǎn)物中有蛋白質(zhì)成分。（3）脂定性。用鉬酸銨-高氯酸顯色法檢測可能存在的脂類成分。將10 mg純化樣品溶解于少量超純水中，在硅膠板上點樣，晾干后，在鉬酸銨-高氯酸溶液（溶液A∶2 g鉬酸銨溶解于25 mL超純水中；溶液B∶1 mol/L HCl；溶液C∶6%HClO；顯色劑：25 mL 溶液A、30 mL 溶液B 和15 mL 溶液C混合均勻）中快速濕潤，于105 ℃中加熱20 min，若顯色則表明產(chǎn)物中含有脂質(zhì)成分。（4）糖定性。利用硫酸-蒽酮法檢測產(chǎn)物中可能存在的糖組分。將5 mg 純化樣品加入2 mL 2 mol/L 硫酸溶液中，115 ℃酸解24 h；將酸解后的產(chǎn)物烘干配制為100 mg/mL的樣品溶液，在硅膠板上點樣、烘干后進行層析檢測。展層劑由正丁醇、乙酸、水按體積比75∶15∶10配制而成。層析結束后噴灑硫酸-蒽酮顯色劑（1 g蒽酮試劑溶于50 mL 60%硫酸溶液中），晾干，80 ℃顯色10 min。若顯色則表明產(chǎn)物中含有糖組分。

1.2.5 破乳劑評價

參照石油天然氣行業(yè)標準SY/T 5280—2018《原油破乳劑使用性能檢測方法（瓶試法）》進行脫水評價實驗，破乳實驗以脫水率作為評價指標。在100 mL 帶刻度的具塞量筒中加入50 mL 原油模型乳狀液，按照200 mg/L 的加量，加入不同比例微生物破乳劑與化學破乳劑的復配體系，加塞后用力振蕩200次，使破乳劑與原油模型乳狀液充分混合，置于60 ℃恒溫水浴中，120 min后讀取脫出水的體積，以脫水率作為評價指標確定優(yōu)化配方成分［14-16］。對優(yōu)化配方的破乳工藝進行優(yōu)化，比較0～200 mg/L的加藥量下分別在40～60 ℃恒溫水浴中破乳120 min 后的脫出水體積，以脫水率作為評價指標確定優(yōu)化工藝，并以現(xiàn)場使用的化學破乳劑作參比。

2 結果與討論

2.1 生物破乳菌種的篩選

生物破乳劑生產(chǎn)菌的初步篩選結果如圖1 所示。以蔗糖為碳源的XJ-3、以甘油為碳源的XJ-4和XJ-5具有較好的破乳能力。其中，對煤油模型乳狀液120 min 的脫水率分別為58.5%、88.5%和93.0%；對原油模型乳狀液120 min的脫水率分別為53.0%、86.5%和82.5%。綜合比較3 株菌在煤油模型乳狀液與原油模型乳狀液的破乳速度和脫水率，同時考慮到發(fā)酵原料成本，確定XJ-4菌為最優(yōu)生物破乳劑產(chǎn)生菌。

圖1 原油模型乳狀液對不同碳源培養(yǎng)的生物破乳菌種的篩選結果

從XJ-4以甘油為碳源發(fā)酵得到的全培養(yǎng)液中，離心分離出菌體和上清液，將上清液過濾徹底除菌，用發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌體。測得菌體重懸液、除菌上清液、全培養(yǎng)液的原油模型乳狀液120 min 的脫水率分別為15.5%、78.0%和81.3%。黃翔峰等［10］認為生物破乳劑的破乳能力主要來源于菌體本身和其代謝產(chǎn)物，而代謝產(chǎn)物多已分泌到培養(yǎng)基中。由此可知，對生物破乳菌種XJ-4 而言，上清液中的代謝產(chǎn)物是影響其破乳能力的主要因素。

按照試管、搖瓶和發(fā)酵罐的順序?qū)J-4進行逐級放大培養(yǎng)，分別以LB 培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照。當發(fā)酵液的OD600（在600 nm 波長下的吸光度值）在0.4～0.6之間時，認為XJ-4處于生長旺盛期，即進行轉接。進入發(fā)酵罐發(fā)酵后，每24 h 取樣20 mL，測定OD600和表面張力?？捎^察到0～3 d的OD600由0 逐漸增至1，4～7 d 的OD600基本未發(fā)生明顯改變；0～3 d的表面張力維持在65 mN/m左右，4～7 d的表面張力逐漸降至30 mN/m左右。通過分離和純化得到生物破乳劑提取物XJ-4-2，其破乳效果如表1 所示。在60 ℃和加藥量400 mg/L 的條件下，XJ-4-2的脫水率優(yōu)于XJ-4的全培養(yǎng)液和XJ-4除菌上清液。XJ-4-2在超純水中稀釋不同倍數(shù)的脫水率差異較大。當稀釋后的質(zhì)量分數(shù)為0.2%時，采出液中總含水率增加，破乳難度增加，使得在脫水量增加的情況下脫水率下降。表明微生物的發(fā)酵產(chǎn)物需要經(jīng)過提純以降低含水率后再用于原油脫水領域。XJ-4 的全培養(yǎng)液的脫水率高于其除菌上清液。這是由于與除菌上清液相比，全培養(yǎng)液中仍含有具有一定破乳效果的細菌菌體。0.2%XJ-4-2 的脫水率介于XJ-4的全培養(yǎng)液和除菌上清液之間，表明額外添加的有機酸、醇等破乳輔助劑可以有效提高脫水率。

表1 瑪東區(qū)塊的含壓裂液采出液生物破乳實驗結果

劉暢等［17］發(fā)現(xiàn)表面張力法可定量評價生物破乳菌的破乳能力，并且生物破乳現(xiàn)象與生物表面活性之間存在內(nèi)在聯(lián)系。一般認為能將培養(yǎng)基的表面張力降至40 mN/m 以下的菌株具有高生物表面活性［10］。常溫（25 ℃）常壓下，XJ-4 的全培養(yǎng)液、除菌上清液、0.2%XJ-4-2 與1%XJ-4-2 稀釋液的表面張力分別為31、30、28、23.2 mN/m。XJ-4 全培養(yǎng)液的表面張力與其除菌上清液相近，表明XJ-4的破乳活性物質(zhì)主要存在于其除菌上清液中。1%XJ-4-2的表面張力低于未添加有機酸、醇等破乳輔助劑的全培養(yǎng)液與除菌上清液。這與有機酸、醇的表面張力較低，作為破乳輔助劑可以有效輔助破乳有關。0.2%XJ-4-2 的表面張力與其全培養(yǎng)液與除菌上清液接近。

在對XJ-4-2進行蛋白、糖類和脂質(zhì)的定性實驗中，XJ-4-2 與0.1%茚三酮溶液未發(fā)生顯色反應，與鉬酸銨-高氯酸溶液和硫酸-蒽酮溶液發(fā)生顯色反應；而水與3 種溶液均未發(fā)生顯色反應。由此可以推斷生物破乳劑提取物XJ-4-2 是一種糖脂類化合物。

通過破乳實驗和表面張力的測定，可以發(fā)現(xiàn)XJ-4-2對瑪東區(qū)塊的含壓裂液采出液具有較好的破乳效果，是一種環(huán)境友好的糖脂類微生物破乳劑，具有良好的應用價值。

2.2 生物破乳劑與化學破乳劑的復配破乳效果

為降低原油脫水成本和提高破乳效果，考察微生物破乳劑XJ-4-2與化學破乳劑的復配破乳效果，結果如圖2 所示。取樣時間為2020 年5 月，原油初始含水率為19.84%。K-1 單獨使用時的脫水率較高。K-1 與其他破乳劑復配得到8、9、10 組別，其脫水率相較K-1單獨使用均有所降低。K-3單獨使用時的脫水率較低。與其它破乳劑復配后，如8、10組別的破乳率低于沒有K-3 的9 組別，而復配配方中包含K-3 的7 組別破乳率與無K-3 的9 組別的差距較小。故在復配配方中排除K-1和K-3，選擇K-2和K-4與XJ-4-2復配。

圖2 瑪東區(qū)塊含壓裂液采出液復合破乳初篩實驗結果

XJ-4-2 與K-2、K-4 復配實驗結果如圖3 所示。當K-4 在配方中占比較大時，原油脫水率較低；XJ-4-2 與K-4 在配方中占比較大時，原油脫水率均高于80%。由于XJ-4-2 的主要成分在環(huán)境中可降解，且成本較低，故選其作為主要成分。綜上，XJ-4-2、K-2、K-4最佳體積比為3∶1∶1，此時復配破乳劑120 min的脫水率為95.6%，油水界面清晰整齊。

圖3 瑪東區(qū)塊的含壓裂液采出液復配破乳實驗結果

2.3 復配破乳劑的工藝優(yōu)化

對最佳配方復配破乳劑的破乳工藝進行優(yōu)化。為確定復配破乳劑的最佳加藥量和最佳破乳溫度，分別在40～60 ℃按照瓶試法進行實驗。由圖4 可見，在50 ℃與60 ℃、復配破乳劑加藥量為200 mg/L 條件下的破乳率以及60 ℃、復配破乳劑加藥量為100 mg/L 條件下的破乳率分別為93.74%、94.56%和92.41%，均高于原始工藝，即60 ℃、化學破乳劑加藥量為200 mg/L、破乳120 min 的脫水率（91.45%）。綜合考慮各條件下的破乳率以及優(yōu)先考慮降低破乳溫度從而顯著降本增效，選擇50 ℃、加藥量200 mg/L作為優(yōu)化后的破乳工藝。

圖4 瑪東區(qū)塊的含壓裂液采出液復配破乳工藝優(yōu)化實驗結果

用蒸餾法測定油中含水率、分光光度法測定水中含油率，將優(yōu)化工藝破乳除油效果與使用化學破乳劑的原始工藝進行對比，結果如表2所示。由表2可見，優(yōu)化工藝破乳劑的各項參數(shù)均優(yōu)于原始工藝。與原始工藝相比，使用優(yōu)化工藝的復配破乳劑處理后，水樣含油量降低31.6%，脫水率提高3.40%，油去除率提高18.8%，油中含水率降低78.2%，在保證破乳效果的前提下破乳溫度降低10 ℃。

表2 破乳劑配方優(yōu)化前后的破乳除油效果對比

3 結論

XJ-4-2、K-2、K-4體積比為3∶1∶1的微生物破乳劑在破乳溫度50 ℃、加藥量200 mg/L 的條件下具有較高的環(huán)保性、較低的成本、較好的破乳效果和較好的應用價值。破乳工藝改進后，原油熱化學沉降2 h 后的脫水率增加，剩余原油含水率和污水含油量降低。