曹小路 趙巧竹 幸 華 栗孟飛

（干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070）

桃兒七（）為小檗科（Berberidaceae）桃兒七屬（）多年生草本自花授粉植物，由種子萌發(fā)至開花結(jié)果需要4～6 年，主要分布于喜馬拉雅鄰近高海拔（2 000～4 500 m）的陰冷陰濕地區(qū)，包括中國、印度和尼泊爾等。成熟果實，又名小葉蓮，為我國傳統(tǒng)藏藥，具有調(diào)經(jīng)活血功效，主治血瘀經(jīng)閉、難產(chǎn)、死胎和胎盤不下。根莖富含鬼臼毒素（podophyllotoxin），其衍生物依托泊苷、替尼泊甙和依托泊苷磷酸酯等對于化療宮頸癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等多種癌癥具有顯著療效，已廣泛應(yīng)用于臨床。獨特的藥理學(xué)活性促使其市場需求量劇增，使得其資源枯竭，已面臨瀕危。

為了保護和利用桃兒七資源，很多學(xué)者就植物繁殖生物學(xué)（reproductive biology）方面做了大量研究，比如，組培快繁、分根繁殖和種子繁殖。盡管通過愈傷組織誘導(dǎo)和胚離體培養(yǎng)獲取完整植株以及調(diào)控外界環(huán)境促進植株生長等體系已經(jīng)建立。通過根莖進行營養(yǎng)繁殖，可以縮短栽培周期、避免種子萌發(fā)率低和幼苗存活困難，但是根莖繁殖消耗了自身成藥根產(chǎn)量，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。盡管自然條件下，桃兒七種子存在萌發(fā)率低和不穩(wěn)定（7%～45%），但其種子數(shù)量眾多（每果60～180粒種子），使得通過種子繁殖仍為桃兒七規(guī)模化繁殖的主要途徑。

已有研究表明，種皮和胚乳限制、胚休眠、萌發(fā)抑制物和生理后熟等因素限制桃兒七種子萌發(fā)，通過低溫層積、熱水浸泡、GA 浸泡、次氯酸鈉浸泡等處理可有效提高種子萌發(fā)率。為了進一步揭示桃兒七種子萌發(fā)或休眠機理，Dogra等對萌發(fā)/未萌發(fā)桃兒七種子進行蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)52 個差異表達蛋白質(zhì)（酶）參與碳水化合物和氨基酸代謝、ABA/GA 信號傳導(dǎo)以及逆境響應(yīng)，對其中2個水解酶［-1，3-葡聚糖酶（-1，3-glucanase，GLC）和木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（xyloglucan endo-transglycosylase/hydrolase，XET/H）］進行基因功能驗證，發(fā)現(xiàn)二者均參與細胞壁疏松和胚乳軟化。本課題組通過對不同萌發(fā)時期桃兒七種子進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)67 個差異表達的基因直接參與種子萌發(fā)過程中的細胞壁疏松和胚乳軟化、初級代謝、激素代謝、信號傳導(dǎo)、胚根生長等。以上研究結(jié)果預(yù)示了多層胚乳和厚種皮是限制桃兒七種子萌發(fā)的主要因素。但是在種子解剖結(jié)構(gòu)及其不同萌發(fā)期形態(tài)變化方面的研究報道較少。因此，本研究利用組織切片和顯微技術(shù)，對不同萌發(fā)期（1、7、14、21、28 d）種子組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及其變化特征進行觀察，旨在探明桃兒七種子萌發(fā)過程中的胚乳和種皮細胞學(xué)變化，為深入研究種子休眠抑制的分子機制奠定基礎(chǔ)，從而為促進種子萌發(fā)、高效繁殖和規(guī)模化種植栽培提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桃兒七成熟果實于2018年7月20日采自甘肅省甘南藏族自治州卓尼縣納浪鄉(xiāng)（海拔3 250～3 350 m；34°42′53″～34°43′40″N，102°53′12″～102°55′46″E），種子從果實中剝離后流水沖洗干凈，室溫自然晾干后4 ℃保存。

1.2 試驗方法

取干燥飽滿的種子1 000 粒，首先置于流水中沖洗表面黏液，然后在室溫下浸泡萌發(fā)，每隔8 h流水沖洗1 次，分別于第1、7、14、21、28 天觀察種子萌發(fā)進程、形態(tài)特征和解剖結(jié)構(gòu)。

選取浸泡萌發(fā)14 d 的種子，利用體視顯微鏡（型號：奧林巴斯SZX16+EP50）觀察種子組織形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照。

第一，每個時期選取種子50粒，用蒸餾水沖洗干凈、濾紙吸干種子表面水分，置于裝有FAA 固定液（福爾馬林、冰醋酸和70%乙醇體積比為1∶1∶18）的50 mL 離心管中，4 ℃下固定72 h。第二，取固定好的種子，避開胚用手術(shù)刀將其橫切和縱切成小塊，用70%乙醇沖洗3次，每次10 min。第三，用30%、50%、70%、85%和95%乙醇梯度脫水，各梯度間隔時間為3 h，最后用無水乙醇泡洗2 次間隔1.5 h 徹底脫水。第四，脫水后依次放入體積比為1∶2、1∶1 和2∶1 的二甲苯和無水乙醇混合溶液中浸泡，間隔2 h，然后更換至純二甲苯溶液浸泡2次間隔1 h。第五，透明后轉(zhuǎn)移至青霉素瓶中，向瓶中少量多次添加熔點54～56 ℃蠟屑，間隔8 h，用包埋劑石蠟逐步取代透明劑，直至石蠟不再熔化為止，之后更換熔融熔點54～56 ℃的純石蠟浸泡3次，間隔6 h 換1 次蠟液，最后用熔融純石蠟包埋。第六，根據(jù)材料的位置和方向，將蠟塊修成梯形，用手動輪轉(zhuǎn)切片機切片（型號：KEDEE-2258），厚度7 μm。第七，將載玻片清洗干凈浸泡在無水乙醇中，12 h 后擦拭晾干，經(jīng)攤片機展片，37 ℃烘片72 h。第八，將烘干的切片進行脫蠟、復(fù)水、番紅固綠雙重染色和透明。第九，將切片從二甲苯中取出，在組織中央滴1 滴中性樹膠，蓋玻片放在滴有樹膠的組織切片上，慢慢下壓將空氣完全排除，封好的切片放入37 ℃恒溫干燥箱過夜，制成永久切片。最后，利用正倒置一體熒光顯微鏡（型號：Echo Revolve）觀察切片并拍照。

將萌發(fā)后的種子播種于含營養(yǎng)基質(zhì)的土壤中［椰糠+草炭+發(fā)酵牛糞+珍珠巖（3∶3∶2∶2）］，一定時期后觀察植株形態(tài)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子解剖結(jié)構(gòu)

圖1結(jié)果顯示，桃兒七種子呈卵狀三角形或橢圓形，隆起面為背側(cè)，較平坦面為腹側(cè)（見圖1A），分別由種皮、胚乳和胚3 個主要部分構(gòu)成（見圖1B）。外種皮上的一條棱狀突出為種脊，是種臍到胚珠的合點端之間隆起的脊棱線（見圖1：A，C 和F）。胚由胚根、胚軸和子葉3 部分組成，胚根呈光滑圓錐形，胚軸連接胚芽與胚根（見圖1：B 和D）。胚位于胚乳中央的種孔端，被珠孔胚乳、外胚乳和厚壁種皮包圍（見圖1：B和E）。從胚、胚乳及其各部分的連接情況看，胚軸和胚根在空間上與胚乳分離（見圖1E）。種子內(nèi)含有豐富的胚乳呈白色，占種子體積的絕大部分（見圖1B）；珠孔胚乳呈半圓形覆蓋在胚根頂端呈帽狀結(jié)構(gòu)，由多層小型薄壁細胞和小型厚壁細胞組成（見圖1E）；胚乳組織含有大量的晶體和磷酸鹽球形體的糊粉粒（見圖1：C和F）。

圖1 桃兒七種子的解剖結(jié)構(gòu)A.種子腹面；B.種子縱切面；C.種子橫切面；D.胚；E.染色后的種子縱切面；F.染色后的種子橫切面；RH.種脊；TE.種皮；EM.胚；En.胚乳；RA.胚根；HY.胚軸；CO.子葉；M En.珠孔胚乳；L En.外胚乳；下同F(xiàn)ig.1 Anatomical structure of S.hexandrum seedsA.Ventral surface of seed；B.Longitudinal section of seed；C.Cross section of seed；D.Embryo；E.Longitudinal section of dyed seed；F.Cross section of dyed seed；RH.Raphe；TE.Testa；EM.Embryo；En.Endosperm；RA.Radicle；HY.Hypocotyle；CO.Cotyledon；M En.Micropylar endosperm；L En.Lateral endosperm；The same as below

2.2 種皮解剖結(jié)構(gòu)

種子種皮包括外種皮（見圖2A）和內(nèi)種皮（見圖2D）；外種皮表面呈棕紅色，有致密規(guī)整的皺紋（見圖2A），各部分的組織結(jié)構(gòu)基本相同（見圖2B），由外至內(nèi)分別為柵狀石細胞和表皮層細胞組織層（見圖2C）；內(nèi)種皮表面呈黃褐色，由5～6 層細胞組成，是海綿組織層結(jié)構(gòu)（見圖2E）。

圖2 桃兒七種皮的解剖結(jié)構(gòu)A.外種皮；B.4倍下外種皮；C.外種皮橫切面；D.內(nèi)種皮；E.內(nèi)種皮橫切面Fig.2 Anatomical structure of seed testa of S.hexandrumA.Episperm；B.4×magnification of episperm；C.Cross section of episperm；D.Endopleura；E.Cross section of endopleura

2.3 不同萌發(fā)期種子外部形態(tài)特征

圖3結(jié)果顯示，1～7 d為種子迅速吸水階段，7～14 d 為種子吸脹階段，14～21 d 為種子萌動階段（胚根突破種皮的過程即為萌動、露白或破胸），21～28 d 為種子發(fā)芽階段（當(dāng)胚根的長度等于種子的長度或胚芽突破種皮并達到種子長度一半時即為發(fā)芽）。

圖3 不同萌發(fā)期桃兒七種子外部形態(tài)特征Fig.3 External morphological characteristics of S.hexandrum seeds at different germination stages

2.4 不同萌發(fā)期種子解剖結(jié)構(gòu)變化

圖4 為種子萌發(fā)過程中縱切面的解剖結(jié)構(gòu)。隨著1～7 d 種子迅速吸水膨脹（見圖3），胚根和胚軸部位的分生細胞開始伸長；7～14 d 胚根和胚軸擴張伸長，并出現(xiàn)2 片子葉在胚軸面相互分離；14～21 d 為種子萌動階段（見圖3），種胚的長度增長迅速，胚軸長度的增長較其他時期明顯，胚根擴張伸長突破珠孔胚乳和厚壁種皮，子葉也擴張伸長；21～28 d為種子發(fā)芽階段（見圖3），胚根和子葉繼續(xù)擴張伸長。

圖4 不同萌發(fā)期桃兒七種子縱切面解剖結(jié)構(gòu)Fig.4 Longitudinal anatomical structure of S.hexandrum seeds at different germination stages

2.5 種子萌發(fā)生長一定時期后形態(tài)特征

圖5為萌發(fā)28 d的種子（見圖3）播種后7～210 d的幼苗形態(tài)特征。由圖5 可以看出，播種7 d 主根明顯形成；49 d 子葉完全張開；84 d 在根莖過渡區(qū)地上部分長出第1 片真葉，地下部分長出不定根；161 d 早期子葉衰老脫落，在根莖過渡區(qū)形成新的真葉和幼芽，幼芽周圍被鱗片，不定根繼續(xù)增加，側(cè)根形成；210 d地上部分形成2～4片功能真葉，地下部分形成4～6條不定根，側(cè)根多數(shù)。

圖5 桃兒七植株生長210 d內(nèi)的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of S.hexandrum plants after 210 d growth

3 討論

種子休眠是植物適應(yīng)環(huán)境變化的生物學(xué)特性，桃兒七種子休眠在面對高海拔極端環(huán)境（如低溫）下起到保護作用。研究表明，種子休眠可分為兩類：一類是內(nèi)源性休眠（胚發(fā)育不全或種皮效應(yīng)），另一類是外源性休眠。外源性休眠又分為物理體眠、化學(xué)休眠和機械體眠；物理休眠是因種子的包覆組織過于緊密或含有蠟質(zhì)和膠質(zhì)等，使水分和氧氣不易進入；化學(xué)休眠是因種皮或胚乳中含有種子萌發(fā)的抑制劑；機械休眠是因種子胚外組織雖然透水、透氣性較好，但包裹組織太堅硬，使胚芽或胚根的生長力難以穿透種殼；而許多植物種子休眠是由多種因素引起。

本研究通過對桃兒七種子及其不同萌發(fā)期解剖結(jié)構(gòu)進行觀察，根據(jù)致密種皮（見圖2）使得干燥種子吸水周期較長（見圖3）、多層胚乳包裹胚使其難以穿透胚乳（見圖1 和圖4）的直觀結(jié)果，可以確定桃兒七種子休眠包括外源性休眠中的物理休眠和機械休眠，致密種皮和多層胚乳限制著桃兒七種子萌發(fā)。該觀察結(jié)果進一步證實了Sreenivasulu等認為的多層胚乳和厚種皮是限制桃兒七種子萌發(fā)的觀點。Dogra等通過對桃兒七種子萌發(fā)過程中克隆獲得的參與細胞壁疏松和胚乳軟化的基因和進行功能驗證，發(fā)現(xiàn)它們的過表達可促進種子的萌發(fā)，且GA 處理顯著促進其表達水平，ABA 則相反。我們通過對桃兒七種子萌發(fā)期轉(zhuǎn)錄組測序獲得的67個差異表達基因進行功能分析，發(fā)現(xiàn)有25 個基因（如編碼GLCs、XET/Hs和擴張蛋白等）參與細胞壁疏松和胚乳軟化、16個基因（如編碼淀粉酶、蔗糖合成酶和種子貯藏蛋白酶等）參與初級代謝和能量代謝、15 個基因（如編碼GA、IAA 和ABA 生物合成的酶等）參與激素合成和信號傳導(dǎo)、5個基因（如編碼調(diào)節(jié)細胞分裂、細胞伸長和促進胚根生長的蛋白質(zhì)等）參與胚根伸長和生長、6個轉(zhuǎn)錄因子（如編碼參與種子萌發(fā)、下胚軸伸長和幼苗早期發(fā)育的蛋白質(zhì)等）參與種子萌發(fā)；激素測定發(fā)現(xiàn)GA和IAA含量隨萌發(fā)進程顯著升高，而ABA 含量則顯著下降。以上這些基因的差異表達和激素的動態(tài)變化規(guī)律，為如何快速解除桃兒七種子休眠、促進其萌發(fā)效率指明了方向。

很多報道稱，自然狀態(tài)下，桃兒七種子萌發(fā)需要10個月至3年的時間，由種子萌發(fā)至開花結(jié)果需要4～6年，采用“循環(huán)種植采挖模式”獲取成藥根和果實最快也需要5 年周期。因此，如何加快種苗繁育進程、縮短采挖周期成為桃兒七種植獲取較高經(jīng)濟收益的關(guān)鍵。根據(jù)致密種皮和多層胚乳是限制桃兒七種子萌發(fā)的主要因素的研究結(jié)果，本研究進一步通過采用種子浸泡結(jié)合反復(fù)沖洗的方法（詳細見1.2.1 種子浸泡萌發(fā)），促使了種子細胞壁疏松和胚乳軟化、加速了種子代謝水平，實現(xiàn)了28 d 種子萌發(fā)，在營養(yǎng)基質(zhì)中84 d 可形成真葉，210 d 可平均形成3 片功能真葉和5 條不定根（見圖5）。這相比自然條件下2 年才能達到的生長狀況，提高了3倍以上的萌發(fā)和生長效率。

目前，很多學(xué)者針對影響桃兒七種子休眠的其他因素（如胚休眠、萌發(fā)抑制物和生理后熟等）持有不同的觀點，比如，有報道稱胚存在休眠，而胚與胚乳進行分離培養(yǎng)可獲得快速萌發(fā)。因此，針對桃兒七種子休眠的其他因素解析，還需要進一步深入研究與驗證。