劉福東，桑躍，洪維鍊，趙雯，張紅星

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州市 730070；3.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，呼和浩特 010110；4.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，呼和浩特 010110）

益生菌（Probiotics）是指通過攝入一定的數(shù)量，對宿主的身體健康有益的活的微生物。益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、抗氧化、降血糖、降血脂、改善骨骼健康等多種益生作用[1～4]。

目前，益生菌已廣泛應(yīng)用于食品等各個(gè)領(lǐng)域，對其穩(wěn)定性的研究也越來越受到關(guān)注，焦點(diǎn)主要集中在以下幾個(gè)方面：①益生菌添加到產(chǎn)品中其存活的穩(wěn)定性；②益生菌的生理學(xué)特征及穩(wěn)定性；③益生菌遺傳和表達(dá)的穩(wěn)定性。高穩(wěn)定性益生菌能夠更好地發(fā)揮其功效，為益生菌的加工生產(chǎn)以及菌株安全性提供保障[5]。

副干酪乳桿菌ET-22分離自健康人體腸道，具有免疫調(diào)節(jié)[6]、緩解腸道炎癥和便秘[7,8]、促進(jìn)骨骼健康[9]等多種益生功能，目前已在發(fā)酵乳制品、益生菌制劑及保健品等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了應(yīng)用。為研究ET-22菌株的傳代穩(wěn)定性，本文從細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、活菌數(shù)、濁度、菌株發(fā)酵活力及全基因組變異情況6個(gè)方面進(jìn)行了考察，對ET-22在連續(xù)傳代過程中的表型特征和遺傳信息穩(wěn)定性進(jìn)行了研究分析，以期為ET-22的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供一定的理論參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

副干酪乳桿菌ET-22由內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.15077。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；脫脂乳粉，恒天然合作社集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、瓊脂粉等常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

儀器：潔凈工作臺(tái)（DJ-CJ-2ND1），北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱（SPX-300），寧波樂電儀器制造有限公司產(chǎn)品；智能高速冷凍離心機(jī)（3H16RI），湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品；pH計(jì)（FE28），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；超純水系統(tǒng)（SMART-N），上?？道追治鰞x器有限公司產(chǎn)品；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-2808），尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)高壓滅菌器（LDZX-75L），上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡（CX31），日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；場發(fā)射掃描電鏡（SU8020），日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的連續(xù)傳代培養(yǎng)及培養(yǎng)代數(shù)計(jì)算[10]

將0代副干酪乳桿菌ET-22進(jìn)行長期連續(xù)傳代培養(yǎng)至1 000代。以12h為1個(gè)傳代周期，按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量連續(xù)傳代培養(yǎng)。副干酪乳桿菌ET-22的一個(gè)單細(xì)胞經(jīng) n次分裂增殖后細(xì)菌數(shù)為2n個(gè)。在每個(gè)傳代周期（12h）內(nèi)，菌體近似幾何級(jí)數(shù)（2n）增殖。通過測定菌株生長曲線可知，當(dāng)接種量為2%時(shí)，菌數(shù)約增長50倍，則每個(gè)周期內(nèi)的生長代數(shù)（即細(xì)菌進(jìn)行分裂的次數(shù)）為log250≈5.64 代。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

菌株ET-22連續(xù)傳代過程中，每培養(yǎng)200代，對菌株進(jìn)行一次光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察。

光學(xué)顯微鏡觀察：培養(yǎng)周期末將培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后革蘭氏染色，100倍油鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照并記錄。

掃描電鏡觀察：培養(yǎng)周期末將菌液離心收集菌體，使用PBS緩沖液重懸離心2～3次，2.5%戊二醛固定菌體，臨界點(diǎn)干燥脫水，掃描電鏡觀察細(xì)胞完整度和細(xì)胞表面褶皺程度，拍照并記錄。

1.2.3 菌落形態(tài)觀察

菌株ET-22連續(xù)傳代過程中，每培養(yǎng)200代，即將培養(yǎng)液按10倍稀釋法稀釋到合適梯度，涂布于MRS固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等特征，拍照并記錄。

1.2.4 活菌數(shù)檢測

菌株ET-22連續(xù)傳代過程中，每培養(yǎng)200代，測定發(fā)酵活菌數(shù)一次，檢測3個(gè)平行。將培養(yǎng)液用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇適當(dāng)?shù)?～3個(gè)梯度進(jìn)行傾注平板，37℃倒置培養(yǎng)48h，選取菌落總數(shù)在30～300范圍內(nèi)平板作為活菌計(jì)數(shù)的指標(biāo)。

1.2.5 濁度檢測

菌株ET-22連續(xù)傳代過程中，每培養(yǎng)200代，測定一次培養(yǎng)液濁度，檢測3個(gè)平行。以未接菌的MRS培養(yǎng)基作為空白對照，使用紫外分光光度計(jì)檢測培養(yǎng)液在600nm處的吸光度。

1.2.6 菌株發(fā)酵活力的測定[11]

菌株ET-22連續(xù)傳代過程中，每培養(yǎng)200代，測定一次菌體發(fā)酵活力，檢測3個(gè)平行。菌體發(fā)酵活力可以通過菌株發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生酸的量來測定，將菌體以1×107CFU/mL濃度接種于10mL滅菌脫脂乳中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，取出后立即放入冰浴，每樣加20mL蒸餾水稀釋，用0.1 mol/L NaOH滴定pH至8.50～8.55，維持30s穩(wěn)定，記錄消耗NaOH體積，計(jì)算樣品中的乳酸濃度，換算為活力單位。

滅菌脫脂乳制作：10%脫脂乳粉，2%葡萄糖，121℃滅菌15min，急冷，4℃冰箱中存放備用。

發(fā)酵活力：以每1000萬（107）個(gè)菌體細(xì)胞在以上條件下發(fā)酵1mL脫脂乳產(chǎn)生1μmol乳酸計(jì)為1個(gè)活力單位（U）。

1.2.7 遺傳穩(wěn)定性測定

菌株ET-22連續(xù)傳代過程中，每培養(yǎng)200代，提取菌體基因組DNA一次，進(jìn)行基因組重測序分析。0代菌體采用二代+三代的測序方式獲得基因組完成圖，200～1 000代菌體采用二代測序獲得基因組掃描圖，分別將200～1 000代基因組掃描圖與0代基因組完成圖進(jìn)行比對，分析菌株ET-22在連續(xù)傳代過程中遺傳信息的變化。副干酪乳桿菌ET-22基因組測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳代過程中菌株細(xì)胞形態(tài)觀察

副干酪乳桿菌ET-22屬于乳桿菌屬中的干酪乳桿菌組群，是革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀，長度0.9～3.1μm，單個(gè)、成對或成短鏈排列[12]。圖1為副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代期間的顯微鏡照片，照片中顯示ET-22在傳代過程中菌體細(xì)胞均為成對或成鏈桿狀排列，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化。圖2為副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代期間的掃描電鏡照片，可以看出，細(xì)胞表面光滑、結(jié)構(gòu)完整，不同代數(shù)細(xì)胞之間無明顯差異。

圖1 副干酪乳桿菌ET-22傳代過程光學(xué)顯微鏡照片

圖2 副干酪乳桿菌ET-22傳代過程掃描電鏡照片

2.2 菌株傳代過程中菌落形態(tài)觀察

圖3為副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代期間的涂布平皿菌落形態(tài)照片。照片顯示，不同代數(shù)副干酪乳桿菌ET-22的菌落形態(tài)一致，呈圓形，直徑1～3mm，顏色為白色，表面光滑、隆起，邊緣整齊，符合副干酪乳桿菌菌落特征[12]。說明副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代過程中，菌落形態(tài)無明顯變化，穩(wěn)定性較好。

圖3 副干酪乳桿菌ET-22傳代過程菌落形態(tài)照片

2.3 生長周期末活菌數(shù)變化情況

副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)培養(yǎng)1 000代期間，不同代數(shù)各菌株活菌數(shù)變化情況見表1。根據(jù)顯著性分析結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)代數(shù)菌株活菌數(shù)無顯著性差異（P〉0.05），表明隨著傳代次數(shù)的增加，沒有改變菌株的生長特性。

表1 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間的活菌數(shù)變化情況

圖4顯示副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代培養(yǎng)1 000代期間活菌數(shù)的變化趨勢。圖中顯示，不同代數(shù)各菌株的活菌數(shù)隨培養(yǎng)代數(shù)的增加呈小幅度波動(dòng)性變化，總數(shù)基本維持不變。

圖4 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間活菌數(shù)變化趨勢

2.4 生長周期末濁度變化情況

菌株發(fā)酵液的濁度變化反映總生物量的變化情況。在連續(xù)培養(yǎng)1 000代過程中，副干酪乳桿菌ET-22的OD600值變化情況見表2。表中顯示，副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代過程中OD600值無顯著性變化（P〉0.05）。

表2 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間OD600值變化情況

副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代期間的OD600值變化趨勢如圖5所示。圖中顯示，連續(xù)傳代過程中，OD600值隨培養(yǎng)代數(shù)的增加呈波動(dòng)性變化，幅度較小，說明在本試驗(yàn)條件下，連續(xù)傳代培養(yǎng)的菌體發(fā)酵液的總生物量沒有隨培養(yǎng)代數(shù)的增加而發(fā)生改變。

圖5 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間OD600值變化

2.5 菌株發(fā)酵活力

菌株的發(fā)酵活力是評價(jià)其發(fā)酵性能的重要指標(biāo)，其穩(wěn)定性是開發(fā)和研制直投式發(fā)酵劑的必備條件[13]。菌株發(fā)酵活力很容易受到外界不利條件的影響，導(dǎo)致其生物活性降低，從而影響發(fā)酵劑的穩(wěn)定性和保質(zhì)期[14]。定期檢測菌株在傳代過程中的產(chǎn)酸活力變化，是菌種穩(wěn)定性研究的一項(xiàng)重要工作，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[11]。

副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)培養(yǎng)1 000代期間，不同代數(shù)各菌株發(fā)酵活力變化情況見表3。從表中可知，副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代過程中發(fā)酵活力無顯著性變化（P〉0.05）。副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間發(fā)酵活力變化趨勢如圖6所示，可以看出連續(xù)傳代過程中，菌株發(fā)酵活力隨培養(yǎng)代數(shù)的增加呈波動(dòng)性變化，但幅度較小，說明連續(xù)傳代培養(yǎng)的菌株發(fā)酵活力沒有隨培養(yǎng)代數(shù)的增加而發(fā)生改變。

表3 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間發(fā)酵活力變化情況

圖6 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間發(fā)酵活力變化趨勢

2.6 遺傳信息的穩(wěn)定性

細(xì)菌基因組重測序，即從頭測序，是在不依賴任何參考序列的情況下對基因組進(jìn)行測序，并利用生物信息學(xué)手段從頭組裝得到基因組序列。根據(jù)最終基因組組裝的完整程度不同，分為完成圖測序和掃描圖測序。

本研究對0代副干酪乳桿菌ET-22進(jìn)行了基因組完成圖測序，結(jié)果可知ET-22全基因組總長度3 078 179bp，編碼基因總數(shù)量為3 141個(gè)，其中包含60個(gè)tRNA和15個(gè)rRNA編碼基因，在整個(gè)基因組水平上的平均GC含量為46.33%。

經(jīng)對200～1 000代ET-22進(jìn)行掃描圖測序分析，并與0代完成圖進(jìn)行比較基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析（表4），發(fā)現(xiàn)ET-22在0～600代內(nèi)SNP、MNP、IMS、DEL、INV以及DUP位點(diǎn)均為0，800～1 000代內(nèi)僅出現(xiàn)最多4個(gè)SNP位點(diǎn)。

表4 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間基因組突變信息統(tǒng)計(jì)

SNP分析是評價(jià)菌株遺傳信息差異的重要手段[15-16]，相比較傳統(tǒng)的16SrRNA 基因[17]、pheS/atpD 功能基因[18]、平均核苷酸一致性（ANI）[19]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）[20]等分析技術(shù)，分析信息更全面，應(yīng)用范圍更廣。PIGHTLING等人認(rèn)為SNP差異小于21是判斷為同一菌株的標(biāo)準(zhǔn)[21]，副干酪乳桿菌ET-22在傳代過程中SNP差異較小（SNP＜5），符合同一菌株標(biāo)準(zhǔn)，表明菌株在連續(xù)傳代1 000代期間遺傳信息維持穩(wěn)定。

3 結(jié)論

菌株生理和遺傳穩(wěn)定是其商業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)，近年來國內(nèi)外學(xué)者對多種益生菌及發(fā)酵劑菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了大量研究。烏云等[11]考察了1株益生乳酸菌P-8在連續(xù)傳代1 000～2 000代期間的表型特征變化，表明P-8經(jīng)過長時(shí)間不間斷連續(xù)傳代其表型特征穩(wěn)定。劉天偉等[20]研究了乳酸菌發(fā)酵劑的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明發(fā)酵劑在長時(shí)間儲(chǔ)藏和傳代培養(yǎng)過程中基因組信息以及蛋白表達(dá)無明顯變化，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

本文對副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代1 000代期間的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、活菌數(shù)、濁度、菌株發(fā)酵活力和全基因組變異系數(shù)的變化情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明ET-22表型特征和遺傳學(xué)信息在長期傳代過程中具有良好的穩(wěn)定性。本文結(jié)論可以為副干酪乳桿菌ET-22的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)，也可為其他益生菌株和發(fā)酵菌株的開發(fā)提供實(shí)踐參考。