慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者發(fā)生低病毒血癥的影響因素及其與肝臟炎癥、肝纖維化進(jìn)展的關(guān)系

宣碧碧， 徐永紅， 杜忠彩， 劉 玉， 楊玉玲， 邊 城

1 青島大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，山東 青島 266021； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院 a.消化內(nèi)科， b.感染性疾病科，c.重癥醫(yī)學(xué)科， 山東 青島 266003

慢性HBV感染屬于全球公共衛(wèi)生問題。截至2016年，全球HBsAg平均陽性率約為4.9%，約有3.64億人感染HBV，每年發(fā)生慢性HBV感染相關(guān)疾病的患者約有88.7萬[1-2]。核苷(酸)類藥物(NUC)抗病毒治療可減輕肝臟炎癥，延緩纖維化進(jìn)程，降低肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。近年研究[4]發(fā)現(xiàn)，盡管慢性HBV感染者進(jìn)行規(guī)律抗病毒治療，但部分患者血清中仍然存在低水平的HBV DNA復(fù)制。2018年美國肝病學(xué)會提出低病毒血癥(low-level viremia, LLV)，即HBV DNA持續(xù)或者間歇大于檢測下限，但<2000 IU/mL[5]。LLV可能會造成肝臟炎癥、纖維化進(jìn)展，甚至HCC的發(fā)生。本研究旨在評估接受NUC抗病毒治療且HBV DNA<2000 IU/mL的慢性乙型肝炎(CHB)和乙型肝炎肝硬化患者中LLV占比，探究影響LLV發(fā)生的因素及其與肝臟炎癥、纖維化進(jìn)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2020年7月1日—2021年11月30日就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝病門診口服NUC[恩替卡韋(ETV)、替諾福韋(TDF)或富馬酸丙酚替諾福韋(TAF)]抗病毒治療療程≥1年，且HBV DNA<2000 IU/mL(檢測下限<10 IU/mL)的CHB(HBeAg陽性與HBeAg陰性)和乙型肝炎肝硬化患者，均為NUC初治患者。根據(jù)血清中HBV DNA水平(連續(xù)測定2次，間隔1個月)分為LLV組(10 IU/ml≤HBV DNA<2000 IU/mL)和完全病毒學(xué)應(yīng)答(CVR)組(HBV DNA<10 IU/mL)。所有研究對象均進(jìn)行超聲評估是否存在肝硬化，CHB診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[2]，肝硬化超聲診斷符合《肝病超聲診斷指南》[6]。排除標(biāo)椎：(1)合并HAV、HCV、HDV、HEV、HIV感染；(2)合并惡性腫瘤；(3)既往使用干擾素抗病毒治療；(4)合并藥物性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及自身免疫性肝?。?5)近3個月服用保肝降酶藥物；(6)依從性差及存在HBV P區(qū)耐藥變異患者。

1.2 觀察指標(biāo) 收集患者一般資料(包括年齡、性別、肝硬化或HCC家族史、抗病毒治療療程等)和血清免疫學(xué)、生化學(xué)、HBV病毒學(xué)等指標(biāo)，計(jì)算肝纖維化指數(shù)。AST/PLT指數(shù)(APRI)=[AST(ULN)/PLT(×109/L)]×100；纖維化指數(shù)(FIB-4)=[年齡(歲)×AST(U/L)]/[PLT(×109/L)×ALT(U/L)1/2]；GPR=(GGT/ULN)/PLT(×109/L)×100。

1.3 檢測方法 清晨抽取空腹血送檢血常規(guī)、乙型肝炎五項(xiàng)定量、HBV DNA、肝功能、AFP、肝纖維化五項(xiàng)及CD4+絕對計(jì)數(shù)。乙型肝炎五項(xiàng)定量采用電化學(xué)發(fā)光法測定，血清HBV DNA定量采用雅培試劑，Real-time PCR(檢測值下限<10 IU/mL)方法測定，肝功能采用酶偶聯(lián)法測定，CD4+絕對計(jì)數(shù)采用流式細(xì)胞術(shù)測定。

2 結(jié)果

2.1 LLV構(gòu)成比 本研究共選取417例研究對象，其中男304例(72.9%)，女113例(27.1%)，平均年齡(43.2±10.5)歲；124例(29.7%)患者臨床診斷為肝硬化，293例(70.3%)患者診斷為CHB；78例(18.7%)患者有肝硬化或HCC家族史?？诜﨨UC抗病毒治療1～2年者80例(19.2%)，2～3年者108例(25.9%)，3年及以上者229例(54.9%)。

所有患者均進(jìn)行高靈敏HBV DNA檢測，其中血清未檢測出HBV DNA者194例，血清HBV DNA<10 IU/mL者50例，即CVR組共244例，CVR率為58.5%。LLV組(10 IU/mL≤HBV DNA<2000 IU/mL)患者173例(41.5%)，其中10～99 IU/mL者131例(75.7%)，100～999 IU/mL者33例(19.1%)，1000～2000 IU/mL者9例(5.2%)，以10 IU/mL≤HBV DNA<1000 IU/mL為主，占比達(dá)94.8%。

2.2 抗病毒治療前LLV組和CVR組患者臨床資料分析

2.2.1 一般資料比較 排除一般資料不完整者123例，共納入294例研究對象，平均年齡(39.1±10.4)歲，男196例(66.7%)，女98例(33.3%)；CHB患者187例(63.6%)，肝硬化患者107例(36.4%)；有肝硬化或HCC家族史者55例(18.7%)。LLV組115例，CVR組179例，其中LLV組肝硬化或HCC家族史的陽性占比及肝硬化患者占比均明顯高于CVR組(P值均<0.05)(表1)。

2.2.2 病毒學(xué)指標(biāo)比較 排除病毒學(xué)資料不完整者54例，對240例患者抗病毒治療前HBV DNA及HBV血清標(biāo)志物進(jìn)行分析，其中LLV組90例，CVR組150例。結(jié)果顯示，LLV組抗病毒治療前HBV DNA>1.0×108IU/mL患者占比及HBeAg陽性率均明顯高于CVR組(P值均<0.05)(表2)。由于既往試驗(yàn)方法有限，無確定的HBsAg定量滴度，故未進(jìn)行研究分析。

2.2.3 生化學(xué)、PLT及纖維化指數(shù)比較 排除生化學(xué)資料不完整者66例，對余下228例患者進(jìn)行分析，其中LLV組78例，CVR組150例。結(jié)果顯示，CVR組患者AST、AFP水平以及APRI、FIB-4指數(shù)均高于LLV組，PLT水平低于LLV組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表3)。

2.2.4 抗病毒治療前LLV發(fā)生的影響因素分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示，抗病毒治療前患者HBeAg陽性(OR=3.009，95%CI：1.346～6.729，P=0.007)、有肝硬化或HCC家族史(OR=2.929，95%CI：1.344～6.383，P=0.007)及HBV DNA水平>1.0×108IU/mL(OR=10.790，95%CI：1.265～92.007，P=0.030)是LLV發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而AST>40 U/L(OR=0.355，95%CI：0.171～0.737，P=0.005)是LLV發(fā)生的保護(hù)因素。

2.3 抗病毒治療后LLV組和CVR組患者臨床資料分析

2.3.1 一般資料比較 對417例患者抗病毒治療后一般資料進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，LLV組患者肝硬化或HCC家族史陽性率明顯高于CVR組(P<0.05)；此外，兩組患者抗病毒治療療程差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表4)。

表1 抗病毒治療前LLV組和CVR組患者一般資料比較

表2 抗病毒治療前LLV組和CVR組患者HBV DNA、HBV血清標(biāo)志物比較

抗病毒治療療程不同，患者發(fā)生LLV的風(fēng)險(xiǎn)不同?？共《局委?年≤療程<2年的80例患者中49例(61.3%)發(fā)生了LLV，2年≤療程<3年的108例患者中46例(42.6%)發(fā)生LLV，療程≥3年的229例患者中78例(34.1%)發(fā)生LLV。不同抗病毒療程LLV發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中，抗病毒治療1年≤療程<2年者與2年≤療程<3年、療程≥3年者比較，發(fā)生LLV的風(fēng)險(xiǎn)較高(P<0.05)(表4)。

2.3.2 病毒學(xué)指標(biāo)比較 排除160例病毒學(xué)資料不完整者，對其余257例患者抗病毒治療后HBV血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行分析，其中LLV組100例，CVR組157例。結(jié)果顯示，LLV組患者HBsAg、抗-HBc水平及HBeAg陽性率均明顯高于CVR組(P值均<0.05)(表5)。

2.3.3 生化學(xué)指標(biāo)比較 排除17例生化學(xué)指標(biāo)資料不完整者，對余下400例患者抗病毒治療后生化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析，其中LLV組166例，CVR組234例。結(jié)果顯示，LLV組ALT和AFP水平高于CVR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)(表6)。

2.3.4 PLT及肝纖維化指數(shù)比較 排除PLT資料不完整者121例，對余下296例患者抗病毒治療后PLT資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算APRI、FIB-4及GPR指數(shù)，結(jié)果顯示兩組PLT、APRI、FIB-4、GPR差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表7)。

2.3.5 肝纖維化五項(xiàng)及CD4+絕對計(jì)數(shù) 排除肝纖維化五項(xiàng)及CD4+絕對計(jì)數(shù)資料不完整者274例，對余下143例患者進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩組肝纖維化五項(xiàng)及CD4+絕對計(jì)數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表8)。

表3 抗病毒治療前LLV組和CVR組患者生化學(xué)、PLT及纖維化指數(shù)比較

表4 抗病毒治療后LLV組和CVR組患者一般資料比較

表5 抗病毒治療后LLV組和CVR組患者HBV血清學(xué)標(biāo)志物比較

2.3.6 抗病毒治療后LLV發(fā)生的影響因素分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示，抗病毒治療后HBeAg陽性(OR=4.394，95%CI：1.962～9.841，P<0.001)是LLV發(fā)生的危險(xiǎn)因素；2年≤抗病毒治療療程<3年(OR=0.175，95%CI：0.046～0.674，P=0.010)和抗病毒治療療程≥3年(OR=0.170，95%CI：0.048～0.600，P=0.006)是LLV發(fā)生的保護(hù)因素，即抗病毒治療療程越長，患者出現(xiàn)LLV的風(fēng)險(xiǎn)越小。

2.4 LLV與肝臟炎癥、纖維化進(jìn)展相關(guān)性分析

2.4.1 LLV與肝臟炎癥進(jìn)展的相關(guān)性分析 排除抗病毒前后ALT、AST、AFP資料缺失的患者，對余下289例研究對象抗病毒治療前后ΔALT、ΔAST及ΔAFP(抗病毒治療前-抗病毒治療后差值)進(jìn)行比較，以其變化程度評價(jià)肝臟炎癥進(jìn)展情況。結(jié)果顯示，兩組ΔAST、ΔAFP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表9)。進(jìn)一步分析LLV與肝臟炎癥的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ΔAST(τ=-0.114，P=0.018)、ΔAFP(τ=-0.192，P<0.001)與LLV呈負(fù)相關(guān)。

2.4.2 LLV與肝纖維化進(jìn)展的相關(guān)性分析 鑒于抗病毒治療前LLV組和CVR組患者PLT、APRI及FIB-4比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為進(jìn)一步研究LLV對這些指標(biāo)的影響，排除抗病毒前后PLT、ALT、AST、GGT資料缺失的患者，比較了余下149例患者抗病毒治療前后ΔPLT、ΔAPRI及ΔFIB-4(抗病毒治療前-抗病毒治療后差值)，以其變化程度評價(jià)肝纖維化進(jìn)展情況。結(jié)果顯示，CVR組患者ΔAPRI及ΔFIB-4明顯高于LLV組(P值均<0.05)(表10)。進(jìn)一步分析LLV與肝纖維化的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ΔAPRI(τ=-0.210，P=0.002)、ΔFIB-4(τ=-0.202，P=0.003)與LLV呈負(fù)相關(guān)。

表6 抗病毒治療后LLV組和CVR組患者生化學(xué)指標(biāo)比較

表7 抗病毒治療后LLV組和CVR組患者PLT、APRI、FIB-4、GPR指數(shù)比較

表8 抗病毒治療后LLV組和CVR組患者肝纖維化五項(xiàng)及CD4+絕對計(jì)數(shù)比較

表9 LLV組和CVR組患者抗病毒治療前后ΔALT、ΔAST及ΔAFP比較

表10 LLV組和CVR組患者抗病毒治療前后肝纖維化指數(shù)比較

3 討論

目前，CHB治療的目標(biāo)是最大限度地長期抑制HBV復(fù)制，減輕肝細(xì)胞炎癥壞死及肝臟纖維組織增生，延緩和減少肝功能衰竭、肝硬化失代償、HCC和其他并發(fā)癥的發(fā)生，改善患者生活質(zhì)量，延長生存時(shí)間[2]。研究發(fā)現(xiàn)，即使接受NUC抗病毒治療，仍有部分患者的肝纖維化有所進(jìn)展。Cho等[7]發(fā)現(xiàn)HBV DNA<2000 IU/mL的肝硬化患者接受NUC治療后，發(fā)生肝硬化相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)降低，生存時(shí)間延長。Sun等[8]對比CHB患者抗病毒前后肝臟病理學(xué)變化，證實(shí)LLV可以導(dǎo)致肝臟炎癥、纖維化進(jìn)展。因此，對LLV進(jìn)行深入研究具有重要的臨床意義。Lee等[9]發(fā)現(xiàn)口服ETV抗病毒治療的894例CHB患者中，LLV發(fā)生率為26.8%。Kim等[10]調(diào)查的875例ETV治療的CHB患者中，LLV發(fā)生率為43.1%。對于LLV的診斷，要求HBV DNA檢測下限值<10 IU/mL。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，高靈敏PCR方法對于HBV DNA的檢出率明顯高于普通PCR檢測。世界衛(wèi)生組織、美國肝病學(xué)會、歐洲肝病學(xué)會、亞太肝病學(xué)會均推薦采用高靈敏的HBV DNA檢測方法，即檢測下限<10 IU/mL[4, 13-15]。本研究采用高靈敏PCR方法(HBV DNA檢測值<10 IU/mL)，以10 IU/mL≤HBV DNA<2000 IU/mL為LLV診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示LLV構(gòu)成比為41.5%，其中10 IU/mL≤HBV DNA≤99 IU/mL占比高達(dá)75.7%。而現(xiàn)階段，我國大部分醫(yī)院的HBV DNA檢測下限為≤200～500 IU/mL。因此，若采用HBV DNA≤200～500 IU/mL的普通PCR方法檢測，可能導(dǎo)致75.7%的 LLV患者漏診。故對于CHB和肝硬化患者應(yīng)該采用高靈敏(檢測下限<10 IU/mL)的檢測方法監(jiān)測HBV DNA水平，提高LLV早期診斷率。

研究[16]發(fā)現(xiàn)，抗病毒治療前有肝硬化或HCC家族史是LLV發(fā)生明顯肝損傷(G≥2和/或S≥2)的主要危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果亦顯示，抗病毒前有肝硬化或HCC家族史可以增加LLV的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，抗病毒治療前病毒學(xué)因素也影響LLV的發(fā)生?？共《局委熐癏BV DNA及HBsAg水平是LLV的重要預(yù)測因素[17-18]。本研究中抗病毒前HBV DNA高水平，特別是HBV DNA>1.0×108IU/mL是LLV發(fā)生的危險(xiǎn)因素。而抗病毒前HBeAg狀態(tài)對LLV的發(fā)生同樣至關(guān)重要。HBeAg陽性CHB患者在接受ETV或TDF治療48～52周后，HBV DNA(檢測下限<60～80 IU/mL)檢出率為33%或24%，而HBeAg陰性為10%或7%[19]；TAF臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，HBeAg陽性CHB患者接受48周TAF治療，HBV DNA(檢測下限<10 IU/mL)檢出率為31%，HBeAg陰性者為9%[20-21]。本研究也證實(shí)HBeAg陽性者發(fā)生LLV風(fēng)險(xiǎn)高于HBeAg陰性者。而且，本研究發(fā)現(xiàn)抗病毒治療前AST≤40 U/L會增加LLV的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。對于有肝硬化或HCC家族史、HBeAg陽性、HBV DNA>1.0×108IU/mL或AST≤40 U/L的患者，應(yīng)盡量選擇強(qiáng)效抗病毒藥物治療，定期復(fù)查高靈敏HBV DNA，以避免發(fā)生或及時(shí)發(fā)現(xiàn)LLV。

長期抗病毒治療可最大程度抑制病毒復(fù)制，一定程度逆轉(zhuǎn)肝損傷[22-23]。韓國90例接受TDF治療的CHB患者，治療12、24個月CVR累積發(fā)生率分別為75.6%、89.9%[24]。另一項(xiàng)研究[25]顯示，92例接受TDF治療的CHB患者，治療12、24及36個月CVR累積發(fā)生率分別為71%、80%、89%，表明延長抗病毒治療療程可以影響CVR發(fā)生率，降低LLV發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。這與本研究結(jié)果相一致，抗病毒治療療程超過2年的患者發(fā)生LLV的風(fēng)險(xiǎn)明顯低于不足2年的患者。提示，適當(dāng)延長抗病毒療程可以降低LLV發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。然而，即使進(jìn)行規(guī)律抗病毒治療，仍有部分患者HBeAg未出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換。相關(guān)研究[10]也證實(shí)，抗病毒治療過程中HBeAg狀態(tài)是影響LLV發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究中，抗病毒治療后LLV組HBeAg陽性率高于CVR組，HBeAg陽性仍是LLV發(fā)生的危險(xiǎn)因素?？梢?，雖然接受規(guī)律抗病毒治療，但對于HBeAg超過1年持續(xù)未陰轉(zhuǎn)的患者，發(fā)生LLV的風(fēng)險(xiǎn)較高。因此，抗病毒治療過程中，應(yīng)定期檢測HBeAg狀態(tài)。

持續(xù)低水平的HBV DNA可能促進(jìn)肝臟炎癥、纖維化進(jìn)展。研究[16]發(fā)現(xiàn)，未進(jìn)行抗病毒治療的LLV患者，肝損傷由50%上升至90%。本研究通過比較LLV組和CVR組患者抗病毒治療前后ΔAST、ΔAFP及ΔAPRI、ΔFIB-4發(fā)現(xiàn)，ΔAST、ΔAFP及ΔAPRI、ΔFIB-4與LLV均呈負(fù)相關(guān)。AST、AFP可以反映肝炎癥情況，因此，ΔAST、ΔAFP越大，表明經(jīng)抗病毒治療后AST、AFP水平較抗病毒治療前降低，肝臟炎癥程度得到緩解；APRI、FIB-4是反映肝纖維化程度的指標(biāo)，ΔAPRI、ΔFIB-4越大，表明經(jīng)抗病毒治療后肝纖維化程度較前緩解。由此提示LLV發(fā)生的可能性越小，肝臟炎癥和肝纖維化進(jìn)展的程度越慢，但關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較弱。而且，血清學(xué)指標(biāo)評價(jià)肝臟炎癥、纖維化進(jìn)展的診斷價(jià)值較低，肝穿刺活檢目前仍是診斷肝臟炎癥、纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)。

本研究存在以下不足之處：(1)缺乏組織病理學(xué)或無創(chuàng)彈性FibroScan檢測手段對肝臟炎癥及纖維化程度進(jìn)行分級。采用血清學(xué)指標(biāo)建立的無創(chuàng)模型衡量肝臟炎癥、纖維化程度具有一定局限性；(2)本研究屬于回顧性分析，部分患者資料缺失，可能在一定程度上降低了結(jié)果的可靠性；(3)抗病毒治療時(shí)間節(jié)點(diǎn)缺乏連續(xù)性，且樣本量相對較少，研究結(jié)論不夠全面、完善。因此，LLV與肝臟炎癥、纖維化的關(guān)系仍需要大樣本、前瞻性、多中心的研究，進(jìn)一步深入探討與分析。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年3月10日經(jīng)由青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號：QYFY WZLL26423。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：宣碧碧負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；杜忠彩、劉玉、楊玉玲參與數(shù)據(jù)收集，修改論文；邊城、徐永紅負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。