叢瑜，林洪，王靜雪

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266000)

沙門氏菌和大腸桿菌均屬于革蘭氏陰性菌，是導(dǎo)致細菌性食物中毒的主要食源性病原菌，嚴重威脅著食品安全和全球公眾健康，給全球經(jīng)濟尤其是食品工業(yè)造成巨大損失[1-3]。因此，必須采取相應(yīng)措施控制食品工業(yè)中的沙門氏菌和大腸桿菌污染。

噬菌體被認為是控制微生物污染的有效抗菌劑，噬菌體制劑用于生物防治的研究也已被廣泛關(guān)注[4-5]。噬菌體裂解細菌一般分為5個步驟，即吸附、侵入、復(fù)制、裝配、釋放，因此，吸附受體的特異性會決定噬菌體的裂解譜，導(dǎo)致當(dāng)前多價噬菌體的數(shù)量及活性研究相對較少。而與噬菌體相比，內(nèi)溶素是一種肽聚糖水解酶，能夠特異性裂解細菌細胞壁的肽聚糖，肽聚糖具有高度的保守性，基于此，內(nèi)溶素具有比噬菌體更廣的裂解譜以及不易產(chǎn)生抗性的優(yōu)勢[6-8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟，重組內(nèi)溶素用于防治食品工業(yè)中微生物污染的研究持續(xù)受到關(guān)注[9]，而當(dāng)前大部分研究集中于革蘭氏陽性菌噬菌體內(nèi)溶素[10-11]。這是由于革蘭氏陰性菌細胞壁外膜結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性會將內(nèi)溶素阻隔在胞外，使其無法與目標底物肽聚糖結(jié)合[12-13]。從而導(dǎo)致革蘭氏陰性菌噬菌體內(nèi)溶素通常需要借助膜通透劑的協(xié)同作用才能與肽聚糖底物接觸從而發(fā)揮抑制作用，使得該類內(nèi)溶素的應(yīng)用嚴重受阻[9, 14]。有研究指出，在內(nèi)溶素末端添加陽離子膜穿透肽有助于內(nèi)溶素穿過外膜結(jié)構(gòu)與肽聚糖接觸，從而使革蘭氏陰性菌噬菌體內(nèi)溶素具有外部裂解能力[15-17]。因此，借助基因工程技術(shù)對革蘭氏陰性菌噬菌體內(nèi)溶素進行修飾，可能有助于解決內(nèi)溶素難以用于革蘭氏陰性菌體外防控的短板。

多價噬菌體vB_SEqdws-315(Genbank Accession No.OK663600.1)是本實驗室分離得到的一株以沙門氏菌和大腸桿菌為宿主的具有高效裂解活性的噬菌體，具有較為罕見的跨種屬裂解能力，對其全基因組進行測序分析后發(fā)現(xiàn)其含有編碼內(nèi)溶素的開放式閱讀框，內(nèi)溶素基因(Genbank Accession No.UEW68667.1)全長456 bp，共編碼151個氨基酸，該內(nèi)溶素屬于球形內(nèi)溶素，包含Amidase_2結(jié)構(gòu)域，為N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶，主要水解肽聚糖糖基和多肽之間的化學(xué)鍵。本研究嘗試對該內(nèi)溶素基因進行克隆表達，同時對其進行陽離子肽修飾，為革蘭氏陰性菌噬菌體內(nèi)溶素的獨立應(yīng)用提供解決策略。以沙門氏菌CMCC 50115為測試菌株，測定修飾內(nèi)溶素對牛奶中沙門氏菌的殺菌效果，初步為利用內(nèi)溶素食品工業(yè)中的防控革蘭氏陰性菌污染提供參考基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

烈性噬菌體vB_SEqdws-315由本實驗室從污水中分離純化得到；宿主菌為本實驗室購買保存的沙門氏菌CMCC 50115(以下簡稱50115)與大腸桿菌K12,其他用于測定抗菌活性的菌株為沙門氏菌ATCC 14028、CMCC 50001、CMCC 50041、CMCC 50071、CMCC 50094、CMCC 50015以及大腸桿菌K80、O157·G2583、DH5α、BL21(DE3)。

LB肉湯、LB瓊脂,青島海博生物技術(shù)有限公司，液體、固體培養(yǎng)基按照所購培養(yǎng)基的說明配制；咪唑、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)、EDTA,索萊寶生物技術(shù)有限公司；所有其他試劑和化學(xué)品均為分析級試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma 3K15型高速臺式冷凍離心機,德國Sigma公司；L535R大容量低溫臺式離心機,湘儀儀器有限公司；step-oneplus PCR儀器,美國Life Technologies公司；DYCZ-24D電泳儀,北京六一儀器廠；MLS-3781-PC高壓蒸汽滅菌鍋,松下健康醫(yī)療器械株式會社；EHWY2102振蕩培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器公司；HH-B11-S電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械廠；UH-12高壓破碎機,上海永聯(lián)生物科技有限公司；蛋白質(zhì)電泳儀、SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)噬菌體vB_SEqdws-315內(nèi)溶素基因序列設(shè)計引物(表1)，在正反向引物端分別設(shè)計限制性內(nèi)切酶EcoR V與XhoI的酶切位點，下劃線部分分別為EcoR V與XhoI酶切位點，引物由上海生物工程公司合成。

表1 內(nèi)溶素Lysin315引物設(shè)計Table 1 Primer sequences of Lysin315

1.3.2 PCR反應(yīng)

以噬菌體vB_SEqdws-315基因組為模板，進行內(nèi)溶素目的片段的PCR擴增。PCR條件如下：98 ℃ 預(yù)變性4 min后進入循環(huán)，98 ℃變性10 s，55 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)，終延伸5 min。擴增后的產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段。

1.3.3 表達載體的構(gòu)建

將目的片段與pET-30a空載體(含有卡那霉素抗性基因)進行限制性內(nèi)切酶EcoR V與XhoI雙酶切，酶切后經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。酶切后的目的片段與克隆表達載體pET-30a連接構(gòu)成重組表達載體。重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)含有卡那霉素的抗性平板篩選，提取陽性重組質(zhì)粒DNA，送上海生物工程公司測序。

1.3.4 內(nèi)溶素誘導(dǎo)表達與純化

將驗證無誤的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)后，獲得了含有內(nèi)溶素基因的重組大腸桿菌BL21-Lysin315，將其接種于50 mL的LB液體培養(yǎng)基(含有50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃ 150 r/min過夜培養(yǎng)。次日，按照1∶100的體積比將過夜培養(yǎng)的菌液加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)至OD600nm值大約為0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為3 mmol/L，25 ℃ 150 r/min誘導(dǎo)4 h后18 ℃ 150 r/min誘導(dǎo)過夜。誘導(dǎo)后將菌液離心，菌體沉淀充分復(fù)溶于結(jié)合緩沖液(50 mmol/L Na2HPO4·12H2O，400 mmol/L NaCl，5%甘油，pH 8.0)，用高壓細胞破碎機將菌體破碎，離心去除不溶性細胞碎片。上清液過含有5 mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料的重力柱進行親和層析。先用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液以1 mL/min的速率平衡重力柱后裝載樣品，隨后分別用20、40 mmol/L咪唑濃度的結(jié)合緩沖液沖洗重力柱以去除其他雜蛋白，最后用300 mmol/L咪唑濃度的結(jié)合緩沖液洗脫目的蛋白。收集每一步純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE檢測。將目的蛋白使用透析袋充分透析24 h除去咪唑后離心取上清液進行脫鹽處理，使用BCA試劑盒進行蛋白濃度定量，制備的重組內(nèi)溶素命名為Lysin315，置于-80 ℃保存。

1.3.5 內(nèi)溶素裂解譜測定

按照林洪等[18]報道的方法，作出部分修改后進行內(nèi)溶素裂解譜的測定：分別挑取實驗室保存的12株沙門氏菌與大腸桿菌單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期(約107CFU/mL)，菌體離心，用50 mmol/L EDTA復(fù)溶5 min，4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，然后用無菌純水洗滌兩次后獲得細菌沉淀，-80 ℃保存。測定裂解譜之前，將細菌沉淀用50 mmol/L Tris(pH 8.2，含0.1%Triton X-100)復(fù)溶。取100 μL細菌復(fù)溶液均勻涂布到LB瓊脂培養(yǎng)基的表面。將無菌牛津杯(5 mm)放在平板的表面，取100 μL 500 μg/mL的內(nèi)溶素Lysin315加入到每個牛津杯中。以加入Tris緩沖液的牛津杯為對照。將平板置于37 ℃環(huán)境中過夜。通過觀察是否有抑菌圈形成來測定內(nèi)溶素Lysin315的裂解譜。

1.3.6 內(nèi)溶素裂解活性測定

將1.3.5制備的沙門氏菌50115細菌沉淀用50 mmol/L Tris(含0.1%Triton X-100, pH 8.2)充分復(fù)溶。各取100 μL復(fù)溶菌液于內(nèi)溶素Lysin315中，內(nèi)溶素Lysin315終質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、125、60、30、15、0 μg/mL。在37 ℃環(huán)境下作用2 h后，梯度稀釋樣品對沙門氏菌50115的可培養(yǎng)細胞數(shù)進行統(tǒng)計并計算宿主菌存活率，如公式(1)所示：

(1)

1.3.7 陽離子肽修飾內(nèi)溶素的克隆、表達與純化

參照MA等[16]、NING等[19]的方法，作出部分修改后進行如下操作：在原始內(nèi)溶素Lysin315序列末端添加5～15個陽離子氨基酸組成的短肽，對3種修飾后的內(nèi)溶素進行誘導(dǎo)表達和純化。噬菌體vB_SEqdws-315的基因組DNA被用作設(shè)計修飾內(nèi)溶素(Lysin315-5aa，Lysin315-10aa和Lysin315-15aa)的克隆模板，設(shè)計引物并交由上海生物工程公司合成(表2)，下劃線部分分別為EcoR V與XhoI酶切位點。修飾內(nèi)溶素同樣在大腸桿菌BL21(DE3)中使用pET-30a載體和IPTG誘導(dǎo)表達。后續(xù)誘導(dǎo)表達和純化操作同1.3.2～1.3.4，制備的修飾內(nèi)溶素命名為Lysin315-5aa、Lysin315-10aa、Lysin315-15aa。

表2 修飾內(nèi)溶素引物設(shè)計Table 2 Primer sequences of chimeric lysins

1.3.8 陽離子肽修飾內(nèi)溶素裂解活性測定

參照NING等[19]的方法，作出部分修改后進行如下操作：挑取實驗室保存的沙門氏菌50115與大腸桿菌K12單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期(約107CFU/mL)。分別取100 μL對數(shù)期培養(yǎng)物(約107CFU/mL)，與Tris緩沖液和500 μg/mL的不同內(nèi)溶素(Lysin315，Lysin315-5aa，Lysin315-10aa，Lysin315-15aa)在37 ℃環(huán)境中作用2 h。使用無菌PBS連續(xù)稀釋處理過的細菌培養(yǎng)物，通過測定4種內(nèi)溶素處理后的宿主可培養(yǎng)細胞數(shù)量以比較抗菌活性。

1.3.9 陽離子肽修飾內(nèi)溶素裂解譜測定

按照LI等[20]報道的方法，作出部分修改后進行修飾內(nèi)溶素的裂解譜測定：分別挑取實驗室保存的沙門氏菌與大腸桿菌單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期(約107CFU/mL)。取100 μL對數(shù)期細菌培養(yǎng)物均勻涂布到LB瓊脂培養(yǎng)基的表面，將無菌牛津杯(5 mm)放在平板的表面。取100 μL 500 μg/mL的抗菌活性最強的修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa加入到每個牛津杯中，以加入Tris緩沖液的牛津杯為對照。將平板置于37 ℃環(huán)境中過夜。通過觀察是否有抑菌圈形成來測定修飾內(nèi)溶素的裂解譜。

1.3.10 陽離子肽修飾內(nèi)溶素在牛奶中的抗菌效果

將100 μL的106CFU/mL的沙門氏菌50115和100 μL 500 μg/mL修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa混合于4.8 mL的牛奶中。用等體積的Tris緩沖液代替修飾內(nèi)溶素添加到對照組中。樣品分別在4 ℃和25 ℃環(huán)境中孵育，于0、1、2 h取樣并連續(xù)梯度稀釋。采用平板計數(shù)法對樣品中的沙門氏菌可培養(yǎng)細菌數(shù)進行定量并計算宿主菌存活率。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和圖表繪制分別使用Excel 2003和GraphPad Prism 7.0，利用標準方差分析數(shù)據(jù)，P<0.05為顯著性差異，所有實驗設(shè)置3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)溶素Lysin315誘導(dǎo)表達結(jié)果

重組內(nèi)溶素表達條件為IPTG 3 mmol/L、25 ℃ 150 r/min誘導(dǎo)4 h后18 ℃ 150 r/min誘導(dǎo)過夜。純化后的SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，該條件下內(nèi)溶素Lysin315呈現(xiàn)上清表達，表達純度高。Lysin315分子質(zhì)量接近25 kDa，分子質(zhì)量大小與當(dāng)前常見的球形內(nèi)溶素一致(15～25 kDa)[21]。經(jīng)透析、超濾等后處理后的蛋白質(zhì)量濃度為6.02 mg/mL。

M-Marker；1-破碎后上清液；2-過柱流出液；3～5-20、 40、300 mmol/L咪唑洗脫液圖1 內(nèi)溶素Lysin315的表達與純化Fig.1 Expression and purification of Lysin315

2.2 內(nèi)溶素裂解活性的確定

本研究所使用的EDTA為常見的螯合劑，能夠螯合吸附二價離子，破壞細菌外膜穩(wěn)定性[18]，從而幫助內(nèi)溶素透過外膜結(jié)構(gòu)與肽聚糖底物結(jié)合。內(nèi)溶素Lysin315的裂解活性如圖2所示，在膜通透劑EDTA的協(xié)助下，Lysin315在1 000 μg/mL質(zhì)量濃度下可有效裂解濃度高達106CFU/mL的沙門氏菌50115，裂解效率達到95%以上，而使用125 μg/mL就可清除50%以上的高濃度沙門氏菌50115。然而，內(nèi)溶素Lysin315在無膜通透劑EDTA的協(xié)助下不能單獨發(fā)揮裂解活性，該現(xiàn)象與大多數(shù)革蘭氏陰性菌噬菌體內(nèi)溶素一致[18, 22]。

圖2 不同濃度內(nèi)溶素Lysin315裂解活性Fig.2 Antibacterial activity of Lysin315 at different concentrations注：***代表P<0.001;**代表P<0.01(下同)

2.3 陽離子肽修飾內(nèi)溶素的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達結(jié)果

將具有5，10和15個氨基酸的陽離子肽加入到內(nèi)溶素Lysin315的C端以構(gòu)建3種陽離子肽修飾內(nèi)溶素：Lysin315-5aa、Lysin315-10aa和Lysin315-15aa，修飾示意圖如圖3所示。陽離子氨基酸有賴氨酸、精氨酸和組氨酸3種，而賴氨酸(9.74)和精氨酸(10.76)的等電點(isoelectric point,pI)顯著高于組氨酸(7.59)。在pH1.0 mg/mL)且同樣呈現(xiàn)上清表達，經(jīng)親和純化、透析、超濾等后處理后得到了高純度的修飾內(nèi)溶素Lysin315-5aa、Lysin315-10aa和Lysin315-15aa。

Amidase_2：內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域；K-賴氨酸；R-精氨酸； N-內(nèi)溶素N端；C-內(nèi)溶素C端圖3 修飾內(nèi)溶素設(shè)計示意圖Fig.3 Design of chimeric lysins

M-Marker；1-Lysin315-5aa破碎后上清液；2-Lysin315-5aa 過柱流出液；3～5-Lysin315-5aa 20、40、300 mmol/L咪唑洗脫液； 6-Lysin315-10aa破碎后上清液；7-Lysin315-10aa過柱流出液； 8～10-Lysin315-10aa 20、40、300 mmol/L咪唑洗脫液； 11-Lysin315-15aa破碎后上清液；12-Lysin315-15aa過柱流出液； 13～15-Lysin315-15aa 20、40、300 mmol/L咪唑洗脫液圖4 修飾內(nèi)溶素的表達與純化Fig.4 Expression and purification of chimeric lysins

2.4 陽離子肽修飾內(nèi)溶素抗菌活性測定

比較4種相同濃度內(nèi)溶素的抗菌活性，結(jié)果如圖5所示。用3種陽離子肽修飾內(nèi)溶素Lysin315-5aa、Lysin315-10aa、Lysin315-15aa處理的沙門氏菌50115和大腸桿菌K12的可培養(yǎng)細胞數(shù)量明顯低于對照組和未添加膜通透劑EDTA的Lysin315實驗組。此外，由于未添加膜通透劑EDTA，原始內(nèi)溶素Lysin315可培養(yǎng)細胞數(shù)量與對照組相比基本不變。3種陽離子肽修飾內(nèi)溶素均可以使高濃度宿主菌可培養(yǎng)細胞數(shù)顯著下降，獨立實現(xiàn)體外抗菌。同時據(jù)此實驗結(jié)果可知，4種內(nèi)溶素的抗菌活性為Lysin315-10aa>Lysin315-15aa>Lysin315-5aa>Lysin315。有研究表明，陽離子氨基酸的添加會影響宿主菌的膜動力學(xué)和跨膜電位，從而導(dǎo)致內(nèi)外膜通透性的變化，使得修飾后的內(nèi)溶素可以順利跨過膜結(jié)構(gòu)發(fā)揮裂解作用，而且通常情況下，透過率會隨著陽離子氨基酸的數(shù)量增加而增加[19]。但本實驗中10個陽離子氨基酸修飾的重組內(nèi)溶素Lysin315-10aa的活性最好，可能是過多陽離子氨基酸的添加影響了內(nèi)溶素蛋白的折疊與空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了內(nèi)溶素酶活的下降。

圖5 內(nèi)溶素的裂解活性比較Fig.5 Comparison of the lysin lytic activity

2.5 內(nèi)溶素裂解譜測定

內(nèi)溶素Lysin315與修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa的裂解譜測定結(jié)果如表3所示，同時與前期研究測定的噬菌體vB_SEqdws-315的裂解譜進行比較。實驗結(jié)果表明，Lysin315與Lysin315-10aa的裂解譜明顯寬于vB_SEqdws-315，多價噬菌體vB_SEqdws-315雖具備跨譜裂解能力，但只能裂解2株沙門氏菌與3株大腸桿菌，而內(nèi)溶素Lysin315與Lysin315-10aa可以裂解噬菌體vB_SEqdws-315無法裂解的其余2株大腸桿菌和5株沙門氏菌，該現(xiàn)象與副溶血弧菌噬菌體內(nèi)溶素Lysqdvp001[23]等大多數(shù)內(nèi)溶素裂解譜寬于噬菌體的實驗結(jié)果一致。同時該結(jié)果證明，陽離子氨基酸的添加可以使修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa突破不同宿主菌的外膜屏障。

表3 噬菌體vB_SEqdws-315、內(nèi)溶素Lysin315 與修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa的裂解譜Table 3 Lytic spectrum of vB_SEqdws-315, Lysin315， and Lysin315-10aa

2.6 陽離子肽修飾內(nèi)溶素在牛奶中的抗菌效果

以沙門氏菌50115為指示菌株測定修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa在牛奶中的抗菌效果，結(jié)果見圖6，Lysin315-10aa在4 ℃和25 ℃條件下對牛奶中的高濃度沙門氏菌(106CFU/mL)表現(xiàn)出顯著的殺菌效果，2 h后可殺滅40%以上的沙門氏菌。但修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa在牛奶中的抗菌效果稍弱于緩沖液環(huán)境，可能是由于牛奶食物基質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分復(fù)雜，會對內(nèi)溶素起到阻隔作用，導(dǎo)致其傳播和裂解能力的減弱[24]。

a-4 ℃牛奶中修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa的抗菌效果; b-25 ℃牛奶中修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa的抗菌效果圖6 牛奶中修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa的抗菌效果Fig.6 Antibacterial effects of lysin 315-10aa in milk

3 結(jié)論

綜上所述，本實驗所獲得4種重組內(nèi)溶素均能實現(xiàn)上清表達，分子質(zhì)量接近25 kDa，且分子質(zhì)量大小隨著陽離子氨基酸數(shù)量的增加而有所增加，搖瓶表達量均高于1.0 mg/mL且表達純度較高?；诟锾m氏陰性菌多價噬菌體內(nèi)溶素Lysin315基因設(shè)計的陽離子肽修飾內(nèi)溶素Lysin315-5aa、Lysin315-10aa、Lysin315-15aa，能在不添加膜通透劑EDTA的情況下能夠從胞外裂解高濃度的沙門氏菌與大腸桿菌，裂解譜寬于原多價噬菌體vB_SEqdws-315。修飾內(nèi)溶素Lysin315-10aa在4 ℃和25 ℃條件下能有效殺滅牛奶中的高濃度(106CFU/mL)沙門氏菌，表明基于Lysin315設(shè)計的陽離子肽修飾內(nèi)溶素可能被用作有效的生物控制劑來對抗沙門氏菌和大腸桿菌在食品中的污染。這項研究擴展了革蘭氏陰性菌噬菌體內(nèi)溶素應(yīng)用范圍，初步為利用多價噬菌體內(nèi)溶素防控食源性致病菌提供了參考基礎(chǔ)。