楊 蕊,果佳霖,孫利東,白東浩,馬麗杰,靳尚武
(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000;2.鄂爾多斯市中心醫(yī)院,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000;3.鄂爾多斯市第四人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)
失眠,是由于多方面的因素造成心神失養(yǎng)或心神不安,從而導(dǎo)致經(jīng)常不能獲得正常睡眠的一種病癥[1]。如果不給予適當(dāng)?shù)闹委煷胧?,失眠?huì)給患者帶來(lái)長(zhǎng)期的痛苦,甚至引起患者對(duì)安眠藥物的依賴。為了降低西藥治療失眠的一系列副作用,有多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)藥理學(xué)作用特點(diǎn)的蒙藥成為重要選擇之一。蒙藥蘇格木勒-3湯為蒙醫(yī)臨床常用主治失眠的方劑,始載于《四部醫(yī)典》[2]。本研究使用的藥物是經(jīng)過(guò)蒙醫(yī)查干夫教授改良后的配方,名為蘇格木勒-4。在原方(白豆蔻15 g,白苣勝10 g,蓽菝5 g)的基礎(chǔ)上,添加了輔助藥物炒酸棗仁15 g[3]。炒酸棗仁味甘、性平,可幫助其他藥材相互中和,更加協(xié)調(diào)地發(fā)揮作用,使蘇格木勒-4可以作為治療失眠、安神的良藥[4-5]。本研究應(yīng)用GC-MS分離鑒定蘇格木勒-4精油主要化學(xué)成分,結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法建立成分-靶點(diǎn)-失眠交互作用網(wǎng)絡(luò),同時(shí)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蘇格木勒-4對(duì)失眠相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響,闡明蘇格木勒-4精油抗失眠有效成分和多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制,旨在為使用蒙藥治療失眠提供更為廣泛的思路。
1.1 藥物白豆蔻為姜科植物白豆蔻Amomum kravanh Pierre ex Gagnep和爪哇白豆蔻Amomum compactum Soland.ex Maton的果實(shí),批號(hào):20160801;白苣勝為菊科植物萵苣Lactuca sativa L.的種子,批號(hào):20160401;蓽茇為胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)植物蓽茇Piper longum L.的干燥近成熟或成熟果穗,批號(hào):20170101;以上3種藥材均購(gòu)自安徽和濟(jì)堂中藥飲片有限公司。酸棗仁是鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chow的干燥成熟種子(批號(hào):20110103,安國(guó)市廣濟(jì)堂藥業(yè)有限責(zé)任公司);安神補(bǔ)腦口服液(批號(hào):1611232,吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司);對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)(批號(hào):SHBH7873,美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。
1.2 儀器與試劑30目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(紹興市上虞華豐五金儀器有限公司);DT-200電子天平、DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋、FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)、DZTW型500ml調(diào)溫電熱套、DZF-2B真空干燥(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司);GCMSQP2010UItra型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津);R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);二氯甲烷(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無(wú)水硫酸鈉(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司)。
5-羥色胺對(duì)照品(5-HT)(批號(hào):SLBP9361V)、γ-氨基丁酸對(duì)照品(GABA)(批號(hào):BCBN3020V)、多巴胺對(duì)照品(DA)(批號(hào):BCBV2562)和內(nèi)標(biāo)3,4-二羥基苯甲酸(DHBA)(批號(hào):MKBS7646V)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。
1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件中藥藥理學(xué)平臺(tái)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php);Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org);GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org);Venny 2.1作圖平臺(tái);Cytoscape軟件;STRING平臺(tái)(https://string-db.org);R語(yǔ)言;PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org);PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov);PyMOL軟件、ChemBio3D及AutoDock vina軟件。
1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性ICR小鼠40只,體質(zhì)量18~22 g,由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0002。小鼠飼養(yǎng)在室內(nèi)溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(50±10)%的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi),自然光照,晝夜交替,自由攝食飲水,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后脫頸處死全部小鼠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),該實(shí)驗(yàn)所有動(dòng)物操作均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。
2.1 樣品的制備
2.1.1 蘇格木勒-4精油的提取 將4種藥物分別用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)30目篩,備用。稱取1劑蘇格木勒-4(白豆蔻15 g,白苣勝10 g,蓽茇5 g,炒酸棗仁15 g),加入360 mL去離子水,置于圓底燒瓶中,浸泡1 h。連接同時(shí)蒸餾萃取裝置,使用電熱套加熱使料液持續(xù)沸騰,另一個(gè)燒瓶中加入50 mL二氯甲烷保持在45℃,連續(xù)萃取1.5 h,收集揮發(fā)油部分,緩慢加入適量無(wú)水硫酸鈉,-20℃冷凍干燥過(guò)夜的溶液。
2.1.2 蘇格木勒-4灌胃液的配制 稱取10劑蘇格木勒-4共450 g,加水4 500 mL,浸泡1 h后煮沸30 min,用紗布濾過(guò),藥渣再加水2 250 mL煮沸20 min后濾過(guò),將兩次濾液合并,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、減壓干燥器濃縮至浸膏狀,得浸膏58 g。使用時(shí)用蒸餾水稀釋成相應(yīng)生藥濃度的溶液。
2.1.3 PCPA溶液的配制 稱取PCPA粉末6 g溶于生理鹽水100 mL,加入兩滴2%聚山梨酯-80助溶,配制成質(zhì)量濃度為0.06 g/mL的混懸液。
2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)
2.2.1 精油GC-MS分析條件HP-5毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm,0.25μm),載氣使用氦氣,樣品進(jìn)入毛細(xì)柱管口的溫度為300℃,氣體流量為1 mL/min;升溫程序設(shè)置為在60℃下停留3min,依次設(shè)置5℃/min升溫速度升溫至120℃,10℃/min的速度升溫至200℃,10℃/min升溫速度至280℃,停留3 min,按照10∶1的分流比、1 μL的進(jìn)樣數(shù)量、1 mL/min的進(jìn)樣流速使樣品分流進(jìn)入。
在EI的電離方式下,設(shè)置200℃的離子源進(jìn)行電離,以及1 482 V的倍增電壓和34.6 μA發(fā)射電流,出口溫度為300℃,在35~550 m/z的范圍下掃描,通過(guò)NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索。
2.2.2 構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖 通過(guò)GC-MS技術(shù)獲得蘇格木勒-4精油成分的名稱,在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)依次檢索,將精油中沒(méi)有靶點(diǎn)的成分去除,得到有靶點(diǎn)信息的有效成分及其全部靶點(diǎn)名稱。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù),矯正已知靶點(diǎn)名稱。借助GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜索“失眠”有關(guān)的基因和靶點(diǎn)蛋白。在Venny 2.1作圖平臺(tái)上分別輸入蘇格木勒-4和已知的失眠靶點(diǎn),繪制韋恩圖,獲得藥物有效成分和失眠靶點(diǎn)的交集。
借助Cytoscape 3.7.1軟件及Network Analyzer功能,構(gòu)建出有效成分、疾病、靶點(diǎn)之間的聯(lián)系,繪制網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,對(duì)蘇格木勒-4精油中已知的主要成分進(jìn)行系統(tǒng)分析。
2.2.3 構(gòu)建蛋白相關(guān)作用關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索藥物與失眠之間共同存在靶點(diǎn),以置信度分?jǐn)?shù)〉0.4作為限制條件進(jìn)行篩選,繪制蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò),并以蛋白間的關(guān)聯(lián)度排列順序。
2.2.4 通路富集分析 在R軟件中,安裝運(yùn)行Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”,將藥物和失眠的共同靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成entrezID形式,在R軟件中安裝clusterProfiler安裝包,將轉(zhuǎn)換后的entrezID形式輸入,以P〈0.05,Q〈0.05進(jìn)行基因本體論(GO)和基因百科全書(KEGG)功能的分析,將所得到的結(jié)果以條形統(tǒng)計(jì)圖的形式輸出。
2.2.5 分子對(duì)接 選取核心靶點(diǎn)GABRA2和度值較高的6種成分進(jìn)行分子對(duì)接檢驗(yàn),利用PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.pdb.org/)下載這6種蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu),在Autodock 4.2.6軟件中進(jìn)行驗(yàn)證分析,進(jìn)行活性化合物成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接。
2.3 動(dòng)物神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
2.3.1 分組、造模與給藥40只ICR雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、安神補(bǔ)腦口服液組及蘇格木勒-4組,每組10只。除正常組外,其余組小鼠每天08:00:00腹腔注射PCPA混懸液,1 mL/100 g,1次/d,連續(xù)2 d,正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。小鼠出現(xiàn)自發(fā)性活動(dòng)減少,唇部黏膜發(fā)白,被毛干枯毛躁,精神不振且處于高度緊張狀態(tài),易受到外界環(huán)境的驚嚇,飲水量增加伴隨食欲不振等癥狀即提示造模成功。于第3天開(kāi)始每天08∶00∶00灌胃給藥,安神補(bǔ)腦口服液組小鼠灌胃給予安神補(bǔ)腦口服液,1.3 mL/100 g,蘇格木勒-4組小鼠灌胃給予蘇格木勒-4溶液,0.26 g/100 g(以生藥含量算),正常組和模型組小鼠給予同體積的蒸餾水灌胃,1次/d,連續(xù)灌胃7 d。各組小鼠每天灌胃前均禁食不禁水12 h。
2.3.2 腦組織樣品采集處理 第7天給藥結(jié)束24 h后,小鼠脫頸處死,斷頭取腦,在冰盤上分離出大腦皮層,放入-80℃冰箱。將腦樣品稱重并使用組織勻漿器在冰冷的1.89%甲酸水溶液中以10 mL/g組織的濃度勻漿,4℃14 000 r/min離心40 min,取上清液稀釋100倍。取離心管數(shù)支,加入稀釋后的腦組織上清液45 μL并以9∶1的體積比加入內(nèi)標(biāo)DHBA,然后加入5 μL的標(biāo)準(zhǔn)系列液。將含有1%甲酸的乙腈(ACN)以4∶1的體積比加入到上清液中,并在4℃條件下14 000 r/min離心5 min。取上清液,過(guò)0.22 μm的濾膜后將樣品轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中,等待進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)量。
2.3.3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件0.2%甲酸(A)和乙腈(B)作為流動(dòng)相。梯度洗脫程序包括0~2.5 min,5%B,2.5~4 min,5%~20%B;4~7 min,20%~60%B;7~7.5 min,60%~5%B;7.5~10 min,5%B,流速:0.2 mL/min,柱溫:30℃,進(jìn)樣量:3 μL。
電離方式為ESI+,霧化氣為氮?dú)?,碰撞氣為氬氣,DL管溫度為250℃,加熱氣流量為10 L/min,霧化氣流量為3 L/min,加熱模塊溫度為400℃,離子源溫度為300℃,檢測(cè)方式為MRM。
2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量控制溶液的配制
2.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備 分別稱取5-HT、DA對(duì)照品1.0 mg,GABA對(duì)照品10 mg,各加入溶劑(1.89%甲酸-甲醇,休積比為7∶3)溶解,并分別定容至10 mL,制得0.1 mg/mL的5-HT、0.1 mg/mL的DA和1 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。
2.3.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 將精密量取的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液作為溶質(zhì),在容量瓶中混勻后,加溶劑(1.89%甲酸-甲醇,體積比為7∶3)定容至100 mL,制得分別為181.82、90.91、45.45、22.73、11.36、5.682、2.84 ng/mL的5-HT和DA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以 及18 181.82、9 090.91、4 545.46、2 272.73、1 136.36、568.18、284.09 ng/mL的GABA的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,保存于4℃冰箱中備用。
2.3.4.3 質(zhì)量控制(QC)液的制備 將適量精密量取的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液作為溶質(zhì),加溶劑(1.89%甲酸-甲醇,體積比為7∶3)定容至100 mL,可以得到低、中、高3種不同濃度的溶液,用于配制QC溶液。溶液濃度分別如下:5-HT和DA均分別為181.82、45.45、5.682 ng/mL;GABA為18 181.82、4 545.46、568.18 ng/mL,保存于4℃冰箱中備用。
2.3.5 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 將約10.0 mg的DHBA對(duì)照品作為溶質(zhì),溶于溶劑(1.89%甲酸-甲醇,體積比為7∶3)中后定容至10 mL,得到的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液濃度約為1.0 mg/mL。加入溶劑直至適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液定容至100 mL,制得濃度為3.6 μg/mL的DHBA內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液,保存于4℃冰箱中備用。
2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(±s)表示。經(jīng)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果
3.1.1 GC-MS分析結(jié)果 根據(jù)各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖以相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行匹配篩選。再將各色譜圖進(jìn)行處理,去電溶劑峰,再通過(guò)歸一化的方法得出各化學(xué)成分含量較高的10個(gè)化學(xué)成分。(見(jiàn)圖1)各成分在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到108個(gè)靶點(diǎn),去重復(fù)后得到39個(gè)靶點(diǎn)。(見(jiàn)表1)
表1 蘇格木勒-4精油組分信息
圖1 蘇格木勒-4精油質(zhì)譜圖
3.1.2 藥物精油成分-疾病共同靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜索“失眠”,共得到疾病靶點(diǎn)2 599個(gè)(重復(fù)除外)。利用Venny 2.1在線軟件繪制成韋恩圖,共得到19個(gè)共同靶點(diǎn)。(見(jiàn)圖2)
圖2 蘇格木勒-4精油成分靶點(diǎn)與失眠相關(guān)基因交集韋恩圖
3.1.3 蘇格木勒-4精油成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索蘇格木勒-4精油的10種主要成分,將39個(gè)潛在靶點(diǎn)輸入到Cytoscape軟件中繪制網(wǎng)格,得到“藥物-成分-靶點(diǎn)”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。藥物用橢圓標(biāo)記,蘇格木勒-4精油中的10種活性成分用菱形標(biāo)記,39個(gè)靶點(diǎn)用長(zhǎng)方形標(biāo)記,直線表示化合物與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。(見(jiàn)圖3)
圖3 蘇格木勒-4精油-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖
3.1.4 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 所得PPI網(wǎng)絡(luò)中包含19個(gè)節(jié)點(diǎn)和94條邊。PPI網(wǎng)絡(luò)平均Degree為4.9,度值排名前5位的是SLC6A3、GABRA2、GRIA2、GABRA1和GABRA6。(見(jiàn)圖4)
圖4 蘇格木勒-4精油成分與失眠蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖
3.1.5 GO富集分析R語(yǔ)言運(yùn)行后,將19個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析提取出生物過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能3個(gè)部分。結(jié)果表明,交集基因集合會(huì)匯合到54條生物學(xué)過(guò)程通路中,主要有氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性(chloride transmembrane transporter activity)、神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)(neurotransmitter receptor activity)、無(wú)機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(inorganic anion transmembrane transporter activity)、參與突觸后膜電位調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(neurot ransmitter receptor activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential)、遞質(zhì)門控離子通道活性(transmitter-gated ion channel activity)、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(postsynaptic neurotransmitter receptor activity)、細(xì)胞外配體門控離子通道活性(extracellular ligand-gated ion channel activity)、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(passive transmembrane transporter activity)等。(見(jiàn)圖5)
圖5 GO分析生物過(guò)程
3.1.6 KEGG富集分析 在R語(yǔ)言的運(yùn)行下,19個(gè)藥物與疾病的靶點(diǎn)會(huì)得到14個(gè)KEGG通路,P表示富集顯著性,且顏色越紅,表示顯著性越強(qiáng)。結(jié)果表明共同靶點(diǎn)主要富集在神經(jīng)活性配體與受體之間的相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、尼古丁成癮(Nicotine addiction)、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)(Retrograde endocannabinoid signaling)、味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Taste transduction)、GABA能突觸(GABA ergic synapse)、嗎啡成癮(Morphine addiction)、鈣信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)、可卡因成癮(Cocaine addiction)、苯丙胺成癮(Amphetamine addiction)、血小板激活(Platelet activation)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、cGMP-PKG信號(hào)通路(cGMP-PKG signaling pathway)。(見(jiàn)圖6)
圖6 KEGG通路分析
3.1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果 使用Autodock 4.2.6軟件,得到關(guān)鍵靶點(diǎn)GABRA2與蘇格木勒-4精油中6個(gè)有效成分結(jié)合能。(見(jiàn)表2)關(guān)鍵靶點(diǎn)GABRA2與活性成分結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol,展現(xiàn)出較好的結(jié)合能力,說(shuō)明關(guān)鍵靶點(diǎn)與成分之間的結(jié)合力較好。將結(jié)合能為-7.2 kcal/mol的石竹烯與GABRA2靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果使用PyMOL軟件進(jìn)行可視化分析。(見(jiàn)圖7)
表2 蘇格木勒-4精油部分有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接信息表
圖7 石竹烯與GABRA2的相互作用
3.2 小鼠大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)結(jié)果
3.2.1 線性關(guān)系考察 以各神經(jīng)遞質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 4種神經(jīng)遞質(zhì)的線性方程
3.2.2 準(zhǔn)確度和精密度 精密量取45 μL被稀釋過(guò)后的腦組織上清液,分別加入5 μL內(nèi)標(biāo)溶液和5 μL高、中、低3個(gè)濃度的QC溶液,配制成高、中、低3個(gè)濃度水平的樣品,按照“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行預(yù)處理。所有濃度都要對(duì)6個(gè)樣本展開(kāi)分析,對(duì)本方法的精密度RSD和準(zhǔn)確度RE進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 4種神經(jīng)遞質(zhì)的精密度、準(zhǔn)確度和回收率
3.2.3 穩(wěn)定性 取“2.3.4”項(xiàng)下配制的混合對(duì)照品溶液,于4℃保存,分別在0、6、12、24 h進(jìn)樣分析,結(jié)果表明于4℃條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。取腦樣品3份,于-80℃保存,每天測(cè)定1份,比較各個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)在不同時(shí)間點(diǎn)的含量變化,表明腦樣品于4℃條件下在24 h內(nèi)較好,存于-80℃的樣品較穩(wěn)定,在3周內(nèi)無(wú)明顯降解。
3.2.4 各組小鼠大腦皮層5-HT、GABA、DA含量比較 與正常組比較,模型組小鼠大腦皮層DA含量明顯升高(P〈0.01),5-HT、GABA含量均明顯降低(P〈0.01),提示造模成功。與模型組比較,蘇格木勒-4組小鼠大腦皮層DA含量明顯降低(P〈0.01),5-HT、GABA的含量均明顯升高(P〈0.01);與模型組比較,安神補(bǔ)腦口服液組小鼠大腦皮層DA含量明顯降低(P〈0.01),而5-HT和GABA含量與模型組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)。(見(jiàn)表5)
表5 各組小鼠大腦皮層5-HT、GABA、DA含量比較(±s,μg/mL)
表5 各組小鼠大腦皮層5-HT、GABA、DA含量比較(±s,μg/mL)
注:與正常組比較,aP〈0.01;與模型組比較,bP〈0.01
組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量 5-HT GABA DA正常組 10 - 0.409±0.063 276.841±54.019 0.421±0.050模型組 10 - 0.293±0.011a 57.352±8.003a 0.959±0.434a安神補(bǔ)腦口服液組10 1.30 mL/100 g 0.306±0.015 110.705±25.273 0.414±0.060b蘇格木勒-4組 10 0.26 g/100 g 0.449±0.087b 568.354±92.052b 0.397±0.046b F 21.840 174.427 88.408 P 0.000 0.000 0.000
蒙藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn),應(yīng)探索蒙藥中可以代表藥效的多個(gè)有效成分。本研究通過(guò)GC-MS技術(shù)確定蘇格木勒-4精油中的成分,再結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,為尋找蘇格木勒-4精油治療失眠的多種活性成分提供了一定的理論依據(jù),而小鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了蘇格木勒-4精油治療失眠的相關(guān)作用機(jī)制。本研究探索的10種潛在活性成分,包括β-蒎烯、桉油精、芳樟醇、4-松油醇、L-α-松油醇、乙酸松油酯、石竹烯、大牛兒烯D、β-紅沒(méi)藥烯、乙酸橙花叔醇酯。其中,芳樟醇不僅具有緩解抑郁的作用[6],還可以鎮(zhèn)靜安眠[7]。以往的研究[8]中,已經(jīng)證實(shí)芳樟醇對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有安撫作用,如促進(jìn)睡眠、減少驚厥和降低體溫等。蒎烯可以緩解壓力[9]。石竹烯被認(rèn)為是催眠的活性成分[10]。研究證實(shí),薰衣草精油中乙酸松油酯有較好的助眠作用[7]。
基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建的蘇格木勒-4精油活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顯示,蘇格木勒-4精油治療失眠是通過(guò)多種成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生效應(yīng)。其中GABRA1、GABRA2、PTGS2、camC、NCOA2、SLC6A2、CHRM2、GABRA6、CHRM1、GABRA5、IL-6等為主要靶蛋白。NIWA Y[11]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毒蕈堿乙酰膽堿受體CHRM1和CHRM3對(duì)睡眠調(diào)節(jié)至關(guān)重要,尤其是對(duì)快速眼動(dòng)睡眠。而CHRM2作為毒蕈堿乙酰膽堿受體,同樣可對(duì)睡眠進(jìn)行調(diào)節(jié)[12]。GO分析表明蘇格木勒-4精油活性成分抗失眠的作用機(jī)制主要與配體門控氯通道、神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)、參與突觸后膜電位調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、遞質(zhì)門控離子通道活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等多個(gè)生物過(guò)程有關(guān)。KEGG分析通路顯示,蘇格木勒-4精油活性成分通過(guò)調(diào)控神經(jīng)活性配體-受體相互作用、尼古丁成癮、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、味覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)、GABA能突觸、多巴胺能突觸、鈣信號(hào)通路等方法來(lái)治療失眠的癥狀。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中受體與配體之間相互作用信號(hào)和神經(jīng)功能相關(guān),該通路與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞在失眠的治療過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[13-14]。共11個(gè)基因富集在該通路上(CHRM1、GABRA6、GABRA1、GABRA2、GABRA5、ADRA1A、NR3C1、GABRA3、ADRA1B、F2、GRIA2),大致可分為γ-氨基丁酸、多巴胺、腎上腺素α/β受體和乙酰膽堿類受體,是臨床上常用的鎮(zhèn)靜、抗焦慮及抗驚厥藥物的靶受體。其中GABRA1、GABRA2、GABRA6、GABRA5基因均編碼γ-氨基丁酸(GABA)受體[15]。GABA是哺乳動(dòng)物大腦中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),它作用于GABA-A受體,屬于配體門控氯通道。這些通道的氯離子電導(dǎo)可以通過(guò)結(jié)合GABA-A受體的苯二氮艸卓類藥物來(lái)調(diào)節(jié)。另外,分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)蘇格木勒-4精油中β-蒎烯、桉油精、方樟醇、4-松油醇、L-α-松油醇、石竹烯均與GABRA2有較好結(jié)合能力,而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中蘇格木勒-4組小鼠大腦皮層GABA含量明顯高于模型組,說(shuō)明蘇格木勒-4精油多個(gè)成分可以通過(guò)調(diào)控配體門控氯通道和GABA能突觸通路來(lái)發(fā)揮抗失眠作用。
DA是腦內(nèi)非常重要的神經(jīng)遞質(zhì),可以促使清醒過(guò)程的進(jìn)行[16],且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明大腦DA含量降低后可改善大鼠睡眠紊亂的癥狀[17]。本研究中蘇格木勒-4組小鼠大腦皮層DA含量下降,故蘇格木勒-4精油的抗失眠機(jī)制為下調(diào)DA含量,使覺(jué)醒減少,從而達(dá)到增加睡眠時(shí)間的效果。5-羥色胺是參與睡眠、食欲、焦慮及抑郁等生理功能活動(dòng)中很重要的神經(jīng)遞質(zhì)。研究報(bào)道,薰衣草精油中主要生物活性成分芳樟醇和乙酸松油酯[18],可以通過(guò)調(diào)控5-HT神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞發(fā)揮其抗焦慮作用[19]。蘇格木勒-4精油中的有效成分也包括芳樟醇和乙酸松油酯,且蘇格木勒-4組小鼠大腦皮層中5-HT含量增加,說(shuō)明蘇格木勒-4精油能通過(guò)改變大腦皮層中5-HT含量來(lái)發(fā)揮抗失眠作用。
綜上所述,將GC-MS檢測(cè)結(jié)果和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法相結(jié)合,對(duì)蘇格木勒-4精油的化學(xué)成分和作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,再結(jié)合小鼠大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)驗(yàn)可知蘇格木勒-4精油中多種成分都涉及與睡眠相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)靶點(diǎn)。蘇格木勒-4精油活性成分治療失眠存在多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,為下一階段的相關(guān)研究提供了方向與參考。