徐 偉，張 山，唐會昌，李憶蒙

(邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外四科，邯鄲 056000；*通訊作者,E-mail:dpx699@163.com)

外傷性腦損傷是由于大腦受到直接的機械損傷而發(fā)生的，并引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化和神經(jīng)元細胞死亡。顱腦外傷后不僅是最初的原發(fā)性損傷會導致腦功能障礙，在很大程度上也與繼發(fā)性腦損傷密切相關，繼發(fā)性腦損傷首先會產(chǎn)生一系列生化降解過程的損傷級聯(lián)反應，主要包括氧化應激、炎癥、凋亡和興奮性氨基酸毒性等，致使神經(jīng)細胞進一步受損或致死，因此避免繼發(fā)性腦損傷引起的神經(jīng)元死亡對腦組織起一定的保護作用，如何減輕神經(jīng)損傷是臨床亟待解決的重要課題[1,2]。目前臨床上除少數(shù)患者需要手術治療外，多強調維持營養(yǎng)、水、電解質、酸堿平衡等預防各種并發(fā)癥。急需有效的治療措施來降低腦組織破壞水平，減緩/抑制神經(jīng)細胞的進一步損傷。依達拉奉是一種抗氧化劑和自由基清除劑，可清除多種自由基[3]。有研究顯示[4,5]，依達拉奉作為一種腦保護劑可減輕腦水腫，可能通過抑制脂質出現(xiàn)過氧化反應，捕獲自由基數(shù)量減少，減少自由基濃度，保護神經(jīng)細胞不被自由基損傷，從而降低危重型顱腦損傷病人的死亡率和致殘率。右莰醇是雙環(huán)單萜類化合物，可抑制炎性細胞因子的表達，進而可能減少細胞凋亡、壞死[6]。依達拉奉和右莰醇兩種活性成分組成的復方制劑即為依達拉奉右莰醇，在依達拉奉和右莰醇以4 ∶1的配比聯(lián)合應用時，研究發(fā)現(xiàn)可用于減輕急性腦梗死血管內治療開通良好患者的神經(jīng)損傷情況[7]以及應用于急性缺血性腦卒中的神經(jīng)保護[8]，但在顱腦外傷后腦損傷中的作用國內目前未見相關報道?；诖耍狙芯客ㄟ^建立大鼠液壓沖擊腦創(chuàng)傷動物模型，并應用依達拉奉右莰醇進行干預，以此來證實依達拉奉右莰醇的神經(jīng)保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究選取大鼠購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，均為雄性SD大鼠，總共96只，年齡8～12周，體質量250～350 g，平均(304.7±8.6)g。在本實驗開始前，于河北醫(yī)科大學實驗室動物房適應性喂養(yǎng)1周，相對濕度40%～70%，室溫(25±2)℃，采用標準鼠飼料常規(guī)喂養(yǎng)，鼠飼料和飲水自由進食。本研究已經(jīng)獲得邯鄲市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，審查批件號[2021-(倫審)-056]。

1.2 動物分組及建模

將96只大鼠隨機分為3組：假手術組、腦損傷組、依達拉奉右莰醇組，每組32只。采用河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院孫國柱等[9]設計的液壓沖擊裝置建立大鼠液壓沖擊腦損傷模型，打擊強度(1.50±0.20)個大氣壓，造成中度腦損傷。大致步驟為：稱重，隨后腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，固定于手術臺上，對大鼠頭部去毛并消毒，剪開頭皮、分離骨膜、暴露顱骨，采用牙科鉆磨在顱骨上開一直徑為5 mm的圓形骨窗。將自制打擊管固定于圓形骨窗上，以待后續(xù)注入藥物使用。假手術組大鼠只行麻醉后顱骨開窗，不行液壓沖擊處理。腦損傷組和依達拉奉右莰醇給藥組將液壓沖擊儀強度調整為2.026×105Pa，隨后再將打擊管與液壓沖擊儀器連接，從而進行打擊，大鼠出現(xiàn)四肢抽搐，有數(shù)秒呼吸抑制現(xiàn)象時提示建模成功。在建模成功后，依達拉奉右莰醇組大鼠用經(jīng)尾靜脈注射給藥方法，每次劑量為3 mg/kg，于造模后12 h、24 h、3 d、7 d連續(xù)給藥4次；假手術組和腦損傷組大鼠則給予注射等量生理鹽水。

1.3 腦組織含水量測定

分別在造模后12 h、24 h、3 d、7 d采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速處死大鼠，每組2只。腦組織含水量的測定采用干濕質量法。稱取濕重前需用濾紙吸取表面水分，稱取干重前則再將腦組織置于110 ℃恒溫烤箱中烘烤24 h。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測炎性細胞因子水平

分別在造模后12 h、24 h、3 d、7 d采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速處死大鼠，每組2只，取出血腫周圍腦組織，加入0.9%生理鹽水制成10%組織勻漿并在低溫3 000 r/min離心20 min后取上清液，實驗過程中嚴格按照大鼠ELISA試劑盒說明書進行操作。采用全自動酶標分析儀測定其吸光度值(波長為450 nm)，分別計算白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達水平。

1.5 腦組織中活性氧族(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)的測定

分別在造模后12 h、24 h、3 d、7 d采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速處死大鼠，每組2只并將水腫腦組織稱重，制作10%的組織勻漿(10 mmol/L磷酸鹽緩沖液)。在12 000g條件下取組織勻漿5 ml離心20 min，取上清液。ROS采用二氯熒光素乙酰乙酸鹽熒光分光光度法檢測(上海潤裕生物科技有限公司)，SOD采用黃嘌呤氧化酶法檢測(上海潤裕生物科技有限公司)。上述檢測方法的所有操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 免疫組織化學染色和單鏈DNA(ssDNA)、羥基脲(Hu)、8-羥化脫氧鳥苷(8-OHdG)或四羥壬烯醛(4-HNE)陽性細胞的定量分析

1.6.1 免疫組織化學染色 分別在造模后12 h、24 h、3 d、7 d采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，然后注入300 ml 0.1 mol/L磷酸鹽(PBS，pH 7.4～7.5)，在PBS中加入300 ml 4%多聚甲醛，迅速處死大鼠，每組2只并取出腦組織。使用微切片機將病變最大尺寸切成50 μm厚的連續(xù)冠狀切片。用3% H2O2在TBS緩沖液中浸泡30 min可阻斷內源性過氧化物酶活性。切片用含0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(TBS-T)的TBS緩沖液洗滌3次，用3%牛血清白蛋白在TBS-T中處理30 min，并與下列一級抗體在室溫下孵育過夜：兔多克隆抗ssDNA抗體、單克隆抗Hu抗體、單克隆抗8-OHdG抗體、單克隆抗4-HNE抗體。清洗后，切片進一步與大鼠試劑盒(由過氧化酶結合的抗小鼠或抗兔二抗組成，購于上海紀寧生物)孵育，室溫下處理60 min。大鼠試劑盒含有預吸收的大鼠血清，并在損傷大鼠組織中表現(xiàn)出可忽略的大鼠血清非特異性結合。

1.6.2 ssDNA、Hu、8-OHdG或4-HNE陽性細胞的定量分析 使用二氨基聯(lián)苯胺進行標記5 min，用蘇木精復染，定量Hu、8-OHdG和4-HNE陽性細胞數(shù)量。按照上述步驟，用正常大鼠血清代替初級抗體進行陰性對照染色。為明確ssDNA、Hu、8-OHdG和4-HNE陽性細胞的數(shù)量，記錄500 μm內所有二氨基聯(lián)苯胺標記的細胞受損區(qū)域(皮層)，不包括白質。取3個連續(xù)切片中顯微鏡下二氨基聯(lián)苯胺標記細胞數(shù)的平均值。使用CCD相機(北京星光光技術有限公司)放大測量區(qū)域的圖像，并通過計算機對每張圖像中測量的面積和體積進行跟蹤和測量。根據(jù)平均陽性細胞數(shù)和體積計算出二氨基聯(lián)苯胺標記細胞數(shù)。ssDNA、Hu、8-OHdG和4-HNE陽性細胞數(shù)均以陽性細胞數(shù)量/100 μm3表示。

1.7 Hu或膠質纖維酸性蛋白(GFAP)雙免疫熒光染色ssDNA

大鼠液壓沖擊腦損傷后，采集的切片用50 mmol/L甘氨酸在TBS中沖洗并在37 ℃下封閉2 h，以減少非特異性熒光。用TBS-T清洗切片，用3%牛血清白蛋白在TBS-T中阻斷，并在室溫下與抗ssDNA抗體(1 ∶300)孵育過夜。廣泛清洗后，切片進一步與Alexa Fluor 488抗兔IgG(北京百奧萊博科技有限公司)室溫下孵育80 min。然后，廣泛清洗切片，并與小鼠單克隆抗Hu抗體(1 ∶300)或小鼠單克隆抗GFAP(1 ∶300)抗體(星形膠質細胞標記物)在室溫下孵育過夜。大量清洗后，切片進一步與Alexa Fluor 555抗小鼠IgG(北京百奧萊博科技有限公司)室溫下孵育80 min。隨后使用共聚焦激光顯微鏡掃描。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織含水量比較

假手術組各時間點大鼠腦組織中基礎含水量基本相當。與假手術組比較，腦損傷組大鼠各時間點腦組織含水量均明顯增加(P<0.05)。與腦損傷組比較，依達拉奉右莰醇組大鼠各時間點腦組織含水量均明顯降低(P<0.05，見表1)。

表1 各組大鼠腦組織含水量的比較

2.2 各組大鼠炎性細胞因子水平比較

與假手術組比較，腦損傷組大鼠各時間點腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與腦損傷組比較，依達拉奉右莰醇組大鼠各時間點腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2～4)。

表2 各組大鼠腦組織中IL-1β水平的比較

表3 各組大鼠腦組織中IL-6水平的比較

表4 各組大鼠腦組織中TNF-α水平的比較

2.3 各組大鼠腦組織中ROS和SOD含量比較

與假手術組比較，腦損傷組各時間點腦組織中ROS含量均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與腦損傷組比較，依達拉奉右莰醇組大鼠各時間點腦組織中ROS含量均有所降低(P<0.05，見表5)。與假手術組比較，腦損傷組各時間點腦組織中SOD含量均降低(P<0.05)；與腦損傷組比較，依達拉奉右莰醇組大鼠各時間點腦組織中SOD含量均有所升高(P<0.05，見表6)。

表5 各組大鼠腦組織中ROS含量的比較

表6 各組大鼠腦組織中SOD含量的比較

2.4 8-OHdG、4-HNE、ssDNA和Hu陽性細胞定量分析

在腦損傷組大鼠各時間點腦組織損傷區(qū)域周圍出現(xiàn)大量8-OHdG、4-HNE、ssDNA陽性細胞，而在依達拉奉右莰醇組各時間點腦組織損傷區(qū)域周圍只有少數(shù)8-OHdG、4-HNE、ssDNA陽性細胞出現(xiàn)，兩組在各時間點8-OHdG、4-HNE、ssDNA陽性細胞表達量上對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在腦損傷后12 h、24 h、3 d、7 d，腦損傷組和依達拉奉右莰醇組Hu陽性細胞數(shù)量逐漸增多，且在第7天時最顯著，此時Hu陽性細胞表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表7～10)。

表7 各組大鼠8-OHdG陽性細胞定量分析陽性數(shù)/100 μm3)

表8 各組大鼠4-HNE陽性細胞定量分析陽性數(shù)/100 μm3)

表9 各組大鼠ssDNA陽性細胞定量分析陽性細胞數(shù)量/100 μm3)

表10 各組大鼠Hu陽性細胞定量分析陽性細胞數(shù)量/100 μm3)

2.5 Hu或GFAP雙免疫熒光染色ssDNA

在腦損傷組中觀察到大量的ssDNA免疫陽性細胞、Hu免疫陽性細胞和GFAP免疫陽性細胞。ssDNA免疫陽性細胞對Hu和GFAP呈雙免疫陽性(見圖1)。相反，在依達拉奉右莰醇組中，只有少數(shù)ssDNA免疫陽性細胞，但有較多Hu免疫陽性細胞和GFAP免疫陽性細胞，而未觀察到Hu或GFAP雙標記的ssDNA免疫陽性細胞(見圖2)。

A.綠色顯示大量ssDNA免疫陽性細胞 (×100);B.紅色為Hu和GFAP免疫陽性細胞 (×200);C.紅色為Hu和GFAP免疫陽性細胞 (×400);D.黃色顯示Hu和GFAP呈雙免疫陽性 (×200);E.黃色顯示Hu和GFAP呈雙免疫陽性 (×400)圖1 建模后7 d腦損傷組Hu或GFAP對ssDNA雙免疫熒光染色Figure 1 Double immunofluorescence staining of ssDNA by Hu or GFAP at 7 d after modeling in brain injury group

A.綠色顯示大量ssDNA免疫陽性細胞 (×100);B.紅色為Hu和GFAP免疫陽性細胞 (×200);C.紅色為Hu和GFAP免疫陽性細胞 (×400);D.未觀察到Hu和GFAP雙標記的ssDNA免疫陽性細胞 (×200);E.未觀察到Hu和GFAP雙標記的ssDNA免疫陽性細胞 (×400)圖2 建模后7 d依達拉奉右莰醇組Hu或GFAP對ssDNA雙免疫熒光染色Figure 2 Double immunofluorescence staining of ssDNA at 7 d after modeling by Hu or GFAP in edaravone dexcamphenol group

3 討論

外傷性腦損傷是由于大腦受到直接的機械損傷，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化和神經(jīng)元細胞死亡。在外傷早期，大腦會出現(xiàn)神經(jīng)元丟失、興奮性毒性損傷、微出血、血腦屏障破壞、彌漫性軸索損傷及自由基產(chǎn)生等，在細胞、代謝、分子級聯(lián)作用下出現(xiàn)神經(jīng)炎癥，進一步表現(xiàn)為腦組織水腫、腦細胞損傷/萎縮/死亡、腦容量變化等[10,11]。李萍等[12]研究證明抑制神經(jīng)炎癥反應，下調炎癥因子的表達水平，可改善腦組織水腫情況。大量研究資料表明，依達拉奉能通過多種信號通路抑制炎癥激活、促進抗氧化途徑、拮抗恢復凋亡相關調節(jié)因子等來減輕炎癥性損傷和氧化應激損傷，從而對腦外傷組織發(fā)揮神經(jīng)保護作用，包括抑制神經(jīng)功能缺損、細胞凋亡和結構損傷[13,14]。本研究結果顯示，依達拉奉右莰醇組大鼠各時間點腦組織含水量及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著低于腦損傷組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明依達拉奉右莰醇干預治療后可有效減輕腦損傷大鼠的腦組織水腫，減少炎癥因子含量，抑制腦外傷誘發(fā)的炎癥反應，從而降低對損傷周圍腦組織神經(jīng)元的損害，保護腦神經(jīng)功能。

Reis等[15]研究顯示，腦外傷后存在的高活性分子如活性氧自由基產(chǎn)生過多，不僅會直接對神經(jīng)細胞造成損傷，還可間接通過炎癥介質誘發(fā)神經(jīng)細胞凋亡和炎性損傷。而自由基可誘導神經(jīng)元和膠質細胞膜脂質過氧化，產(chǎn)生4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE)，并可直接引起神經(jīng)元和膠質細胞DNA損傷，產(chǎn)生8-羥基-20-脫氧鳥苷(8-OHdG)[16,17]。這些膜過氧化和DNA損傷的級聯(lián)反應可誘導神經(jīng)元和膠質細胞凋亡，可檢測為免疫陽性單鏈DNA(ssDNA)和神經(jīng)元功能障礙[18]。表明4-HNE和8-OHdG可用作實驗性腦損傷后的凋亡前標志物，ssDNA用作凋亡標志物。吳志寶等[19]通過建立大鼠液壓沖擊腦損傷模型，檢測氧化應激損傷活性指標活性氧族、丙二醛、超氧化物歧化酶、血紅素氧化酶1和磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶1的表達，證實自由基誘導的氧化應激在腦損傷中具有重要作用，早期調控氧化應激狀態(tài)有助于減輕繼發(fā)性腦損傷。本研究顯示，與假手術組比較，腦損傷組各時間點腦組織中ROS含量升高、SOD含量降低(P<0.05)；與腦損傷組比較，依達拉奉右莰醇組大鼠各時間點腦組織中ROS含量降低、SOD含量升高(P<0.05)。表明腦損傷后腦組織中會產(chǎn)生大量活性氧類物質，致使內源性抗氧化系統(tǒng)功能下降，最終導致神經(jīng)細胞和血管內皮細胞產(chǎn)生過氧化反應，從而發(fā)生氧化應激損傷。王旭平等[20]發(fā)現(xiàn)通過絞股藍總苷拮抗谷氨酸介導的氧化性神經(jīng)損傷機制可能與提高神經(jīng)細胞內抗氧化酶活性，清除氧自由基對線粒體膜的損傷有關。王鵬等[21]證實二十二碳六烯酸減輕全腦缺血/再灌注誘導的神經(jīng)元損傷機制可能與抑制氧化應激反應、激活線粒體途徑和抑制ERK信號通路有關。提示在腦損傷過程中，自由基誘導的信號通路可引起細胞損傷甚至凋亡。本研究結果顯示，依達拉奉右莰醇組大鼠各時間點腦組織損傷區(qū)域周圍8-OHdG、4-HNE、ssDNA陽性細胞數(shù)量少于腦損傷組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此認為依達拉奉右莰醇可能吸收了腦外傷產(chǎn)生的自由基并抑制其功能，從而防止自由基介導的神經(jīng)細胞凋亡和膠質細胞變性后死亡。此外，本研究顯示，與腦損傷組比較，依達拉奉右莰醇組中與ssDNA共定位的Hu和GFAP免疫陽性細胞較少，且腦損傷后第7天(即慢性期)損傷區(qū)域周圍有更多的Hu陽性細胞數(shù)量表達；在依達拉奉右莰醇組中，只有少數(shù)ssDNA免疫陽性細胞，但有較多Hu和GFAP免疫陽性細胞，而未觀察到Hu或GFAP雙標記的ssDNA免疫陽性細胞。Hu或GFAP與神經(jīng)元存活及功能有密切關系，在腦損傷后期，Hu或GFAP免疫陽性細胞數(shù)量增加，提示可能存在反應性星形膠質細胞增生活躍，在損傷腦組織周圍可以形成膠質副界膜，減少腦損傷區(qū)范圍的擴大，在損傷-正常腦組織之間起橋梁運輸?shù)淖饔茫⑼ㄟ^分泌細胞因子、生長因子等修復神經(jīng)元、誘導再生神經(jīng)元的遷移及促進軸突再生，從而恢復腦組織神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能[22-24]。上述結果進一步支持依達拉奉右莰醇治療抑制腦損傷后自由基介導的神經(jīng)元和膠質細胞凋亡。

綜上所述，腦損傷后依達拉奉右莰醇治療可改善腦水腫情況，抑制炎癥反應，下調炎癥因子的表達，抑制自由基誘導的神經(jīng)元變性和損傷區(qū)周圍細胞凋亡。