熊永強 ,李江偉 ,李韌 ,黃娜 ,鞏妮 ,張澍

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院:1.干部病房普通外科;2.科研中心實驗室,陜西西安 710004)

肝硬化是各種慢性肝損傷機制導致的炎癥壞死、纖維化及假小葉形成[1-2],其原因多種多樣,如肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酒精性或非酒精性脂肪肝病[3],其特點是細胞外基質(zhì)(ECM)的合成和降解不平衡,導致明顯的ECM 沉積[4]。肝硬化最終可能發(fā)展成肝衰竭和肝癌,這極大地影響患者的生存和生活質(zhì)量[5]。肝硬化中藥復方治療可基本分為經(jīng)典方、現(xiàn)代名家名方和自擬方。中藥復方治療體現(xiàn)了病證結合的辨證思想,針對肝硬化病因、分期、并發(fā)癥、特有臨床指標辨證施治,在改善臨床癥狀、阻止及預防和治療并發(fā)癥方面有顯著優(yōu)勢。相關研究證明,益氣解毒通絡方(YQJDTLF)可明顯緩解臨床癥狀,療效顯著。本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法確定YQJDTLF 治療肝硬化的潛在機制,以助于肝硬化藥物的篩選,改進YQJDTLF的劑型,并為探索其他中藥的治療機制提供有益的可能參考。

1 材料與方法

1.1 YQJDTLF的活性化合物和相應潛在治療靶點的篩選

應用TCMSP[Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(tcmsp-e.com)]篩選YQJDTLF 的活性化合物和相應的潛在治療靶點[6]。在TCMSP 中檢索YQJDTLF中相對生物利用度(OB)≥30%、藥物相似度(DL)≥0.18被設置為活性化合物和相應的潛在治療靶點篩選的閾值。

1.2 肝硬化相關治療靶點的篩選

肝硬化相關靶點篩選通過搜索如下數(shù)據(jù)庫進行,如Drugbank(https://go.drugbank.com/structures/search/small_molecule_drugs/structure)[7]、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[8]、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)[9]、GeneCard(http://www.genecards.org)[10],檢索名詞為肝硬化。刪除重復的靶點基因以獲得最終的疾病靶點合集。

1.3 YQJDTLF 蛋白互作網(wǎng)絡及成分-靶點-疾病網(wǎng)絡的構建

將檢索獲得的YQJDTLF 相關靶點和肝硬化相關靶點進行維恩圖分析,找出交叉的目標,然后用Cytoscape(Cytoscape_v3.8.2)構建藥物-化合物-靶點基因圖網(wǎng)絡[11]。網(wǎng)絡中的節(jié)點代表YQJDTLF 中的活性化合物和靶點,網(wǎng)絡中的邊代表每個節(jié)點的關系,每條邊的數(shù)量被定義為“度”。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡構建主要是通過交叉靶點上傳至String 在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)生成的[12]。所需的最低交互分數(shù)設置為“中等置信度=0.9”,而其他參數(shù)保持默認,然后將生成的PPI網(wǎng)絡加載到Cytoscape。進一步利用CytoCNA 的內(nèi)置模塊生成主要目標網(wǎng)絡,當介數(shù)、接近度、度/連通性、特征向量、基于局部平均連通性的方法和每個節(jié)點的網(wǎng)絡都大于中位數(shù)時,通過拓撲分析生成核心目標網(wǎng)絡。

1.4 基因本體論(GO)生物學功能富集及基因組百科全書(KEGG)通路分析

使用Metascape(http://metascape.org/)進行了GO 和KEGG 的通路富集分析,以P-Value 值(P≤0.01)為篩選條件,GO 分析依據(jù)相關性選用靠前的10位生物學過程(biological process,BP)、前10位分子功能(molecular function,MF),將KEGG的前20條富集途徑在氣泡圖中可視化,氣泡的大小代表在指定途徑中富集的目標數(shù)量,氣泡的顏色代表富集的P值,富集分析的KEGG通路以及相應的化合物和靶標隨后被加載到Cytoscape軟件中,通過單獨調(diào)整繪圖,生成了一個可視化的化合物-目標-通路網(wǎng)絡。

1.5 分子對接

從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載PPI網(wǎng)絡中相互作用核心蛋白的3D 結構,并從PubChem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)及ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org)下載活性小分子的3D結構。應用AutoDock Tools 1.5.6對獲取的小分子及蛋白3D結構進行去水、加氫、計算電荷等處理后,導入到AutoDock Vina進行對接,計算出藥物活性成分與靶蛋白相結合所需的最低結合效能,通過Rx64 4.1.3將核心蛋白及小分子結合能繪制熱圖,再利用Pymol2.1.1將對接所獲得的相互作用結構進行可視化處理。

2 結果

2.1 主要化學成分及靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找YQJDTLF 的所有成分,根據(jù)藥動學參數(shù)篩選出其中口服OB≥30%且DL≥0.18的潛在活性成分及相應靶點,YQJDTLF的活性化合物93個,相應潛在治療靶點1 460 個(表1)。將“肝硬化”置于Drugbank、OMIM、TTD、DisGe NET、GeneCard搜索,經(jīng)過篩選最終獲得總共1 266個肝硬化相關靶點基因,中藥成分-潛在靶點基因網(wǎng)絡圖由Cytoscape構建(圖1)。

圖1 YQJDTLF-中藥成分-潛在靶點基因網(wǎng)絡圖Fig.1 Yiqi Jiedu Tongluo Recipe-Traditional Chinese Medicine Ingredients-Potential Target Gene Network Map

表1 YQJDTLF的中藥成分和相應的潛在治療靶點數(shù)目Tab.1 The number of Chinese herbal components and corresponding potential therapeutic targets of Yiqi Jiedu Tongluo Recipe

2.2 藥物-化合物-靶點基因圖網(wǎng)絡的構建

得到YQJDTLF和肝硬化相關的潛在靶點后,通過維恩圖確定相交的靶點,得到YQJDTLF與肝硬化交集靶點共135個(圖2)。根據(jù)化合物中靶點基因數(shù)目篩選活性化合物,篩選出前10位活性化合物(表2)。

表2 YQJDTLF的中藥化合物相關靶點Tab.2 Targets related to traditional Chinese medicine compounds in Yiqi Jiedu Tongluo Recipe

續(xù)表2

圖2 YQJDTLF與肝硬化的交集靶點維恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection target of Yiqi Jiedu Tongluo Recipe and liver cirrhosis

2.3 PPI網(wǎng)絡及關鍵成分和靶點分析

由String 數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)構建的蛋白PPI網(wǎng)絡,生成主要目標網(wǎng)絡,截斷值設置如下:節(jié)點=135,邊=697,度數(shù)中位數(shù)=10.3,PPI網(wǎng)絡中的節(jié)點愈大、顏色愈深,此節(jié)點蛋白與其他節(jié)點蛋白的作用關系就越多,重要性就越強(圖3)。將YQJDTLF與肝硬化的核心靶點分別導入Cytoscape,生成相應的網(wǎng)狀圖,進一步利用CytoCNA 內(nèi)置模塊生成主要目標網(wǎng)絡,并通過拓撲分析,得到核心網(wǎng)絡。利用MOCDE 插件篩選出10個藥物治療疾病的核心靶點,包括腫瘤蛋白p53(TP53)、AKT1、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、白介素6(IL6)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)、MAPK8、胱天蛋白酶3(CASP3)、JUN、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT 3)。

圖3 YQJDTLF與肝硬化交叉靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡Fig.3 Protein-protein interaction (PPI) network of crosstargets between Yiqi Jiedu Tongluo Recipe and liver cirrhosis

2.4 核心靶點GO 生物學功能及KEGG 通路富集分析結果

將YQJDTLF治療肝硬化的135個核心靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫,得到富集的通路與核心靶點網(wǎng)絡圖(圖4),說明YQJDTLF是通過多條通路與多個靶點相互配合,共同起到治療肝硬化的目的。以P＜0.01為篩選條件,GO 分析獲得813條生物過程(BP)主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter)、基因表達的正向調(diào)控(positive regulation of gene expression)、信號轉(zhuǎn)導(signal transduction)等,79條細胞組成(CC)主要涉及胞質(zhì)溶膠(cytosol)、細胞核(nucleus)、細胞質(zhì)(cytoplasm)、核質(zhì)(nucleoplasm),127條分子功能(MF)主要涉及蛋白質(zhì)結合(protein binding)相同的蛋白質(zhì)結合(identical protein binding)、酶結合(enzyme binding)、蛋白激酶結合(protein kinase binding)等,各選取前10條信息如圖5A(圖中的Count值代表與此條目相關的靶點基因的數(shù)量,Count值愈大,代表相關的靶點基因數(shù)量愈多)。以P＜0.01為篩選條件,KEGG 富集分析獲得135條信號通路,選擇前20條KEGG 通路并以氣泡圖方式呈現(xiàn),氣泡的大小代表在指定途徑中富集的目標數(shù)量,氣泡的顏色代表富集的P值。富集程度較高的代謝通路為pathways in cancer、fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、proteoglycans in cancer、TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等(圖5B)。

圖4 YQJDTLF治療肝硬化的135個核心靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫獲得的富集通路與核心靶點網(wǎng)絡圖Fig.4 Enrichment pathway-core target network diagram

圖5 YQJDTLF治療肝硬化的核心靶點GO 分析(A)和KEGG 分析(B)的結果Fig.5 The results of GO analysis(A)and KEGG analysis(B)of the core targets of Yiqi Jiedu Tongluo Recipe in the treatment of liver cirrhosis

2.5 分子對接結果

為了明確YQJDTLF治療肝硬化的內(nèi)在分子機制,選取PPI網(wǎng)絡中的10個關鍵靶點作為受體,選擇篩選的活性化合物作為配體。當配體與受體結合能量越低時,其結合構象越穩(wěn)定,相互作用的可能性越大。分子對接中最低化學結合能小于0 kJ/mol時可以在自然狀態(tài)下對接,最低化學結合能小于＜-5 kJ/mol時,對接結果良好。從分子對接熱力圖可看出關鍵基因與有效成分對接后,CASP3、STAT3與活性化合物結合能處于0～5 kJ/mol,其余靶點與活性化合物最低化學結合能小于＜-5 kJ/mol(圖6),提示有效成分有可能成為先導藥物,為藥物的設計開發(fā)提供思路。利用Pymol 軟件將結合能較低的相關靶點蛋白與有效成分的蛋白對接模式進行可視化結果(圖7) 。

圖6 活性成分與潛在靶點對接結果熱圖Fig.6 Heat map of the docking results of active ingredients and potential targets

圖7 核心靶點分別與其結合能最低活性化合物生成的對接模式圖Fig.7 The docking pattern of the core target and its lowest binding energy compound

3 討 論

2007年HOPKINS[13]首次明確網(wǎng)絡藥理學概念。網(wǎng)絡藥理學在中藥領域的應用可解決中藥現(xiàn)代化遇到的困難,揭示潛在的機制。北京東直門醫(yī)院徐光福教授[14]自擬YQJDTLF 治療肝硬化患者,取得滿意效果。本研究利用網(wǎng)絡藥理學明確YQJDTLF 對于肝硬化的治療的相關可能機制,為今后研究中藥配方治療肝硬化的具體機制提供了參考。本研究使用TCMSP、GeneCard、KEGG、TTD、DrugBank和Dis-GeNET 明確藥物相關基因可能是YQJDTLF 改善肝硬化的關鍵靶點,然后生成化合物-靶點的PPI網(wǎng)絡,并通過使用Cytoscape和String數(shù)據(jù)庫確定核心靶點,對核心靶點的GO 和KEGG 富集分析顯示,介導的pathways in cancer、fluid shear stress and atherosclerosis等相關信號通路是最富集的通路。

研究顯示,槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、黃芩素(baicalein)、小紅參醌丙(trijuganone B)、異鼠李素(isorhamnetin)、豆甾醇(stigmasterol)是YQJDTLF治療肝硬化的主要活性化合物。槲皮素屬于黃酮醇家族,具有抗氧化、抗炎、保護心臟和抗肥胖的作用[15],參與調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT 和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2/c-Jun N 端激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK-1/2/JNK/MAPK)信號通路[16],以及通過調(diào)控細胞色素C參與凋亡途徑[17]。黃芩素是一種從黃芩根中提取的黃酮類化合物,可誘導人肝母細胞瘤細胞(Hep G2)凋亡,黃芩素可能是急性肝細胞凋亡或損傷的治療候選藥物[18-20]。槲皮素和黃芩素還顯示出體外抗纖維化活性,可抑制TGF-β1誘導的結節(jié)形成[21-22]。木犀草素能增加了肝臟基質(zhì)金屬蛋白酶-9的水平和金屬硫蛋白(MT)Ⅰ/Ⅱ的表達,可消除纖維蛋白沉積物,促進纖維化肝組織中的ECM 降解和增強肝再生能力來治療肝纖維化[23]。異鼠李素可以抑制TGF-β1表達,從而影響TGF-β1/Smad3 及TGF-β1/p38 MAPK 通路的活化,緩解氧化應激從而起到抗纖維化的作用[24-25]。而越來越多的研究證實,線粒體激活的蛋白激酶(MAPK)下游信號在肝硬化病程中起著重要的作用[26]。Smads、ERK/MAPK、PI3K/AKT、NF-κB、PPAR 等信號通路是肝硬化發(fā)生發(fā)展過程中細胞因子發(fā)揮作用的重要信號通路。

通過cytoscape軟件拓撲分析得出YQJDTLF治療肝硬化的核心靶點基因有TP53、AKT1、VEGFA、IL6、TNF、MAPK3、MAPK8、CASP3、JUN、STAT 3。TNFα參與TNF受體相關因子(TRAF)2、受體相互作用蛋白-1、絲裂原活化蛋白(MAP)激酶、c-Jun-N末端激酶(JNK)、核因子κB(NFκB)通路的調(diào)控[27],而TNF/TNFR1 復合物可以引起caspase-8 的激活[28],caspase-8可激活如caspase-3的下游效應子,從而誘發(fā)凋亡細胞死亡[29-30],這些通路對肝損傷、肝硬化進展起著一定的作用。蛋白激酶(AKT)是PI3K 信號通路的主要下游點,AKT1通過IKKα激活NF-κB 參與多種促炎反應作用的共同通路,從而調(diào)節(jié)炎癥反應介導肝硬化的發(fā)生[31-33]。

GO 富集分析主要集中在凋亡過程的負調(diào)控、藥物敏感性、炎癥反應、細胞增殖的正調(diào)節(jié)等。肝細胞凋亡導致的肝細胞死亡是肝硬化演變過程中炎癥和肝星狀細胞活化的主要觸發(fā)因素[34-35],靶點基因參與凋亡過程中的負調(diào)控有利于肝硬化的治療。病毒性肝炎是肝硬化疾病進展諸多因素中的最主要因素之一。乙型肝炎病毒能引起免疫應答導致肝細胞損傷及炎癥壞死,肝細胞進入“炎性壞死與再生修復”的循環(huán)中,部分患者最終發(fā)展為肝硬化[36-38],炎癥反應調(diào)控對于改善肝硬化結局是有益的。KEGG 分析得出YQJDTLF通過pathways in cancer、TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway 等通路在肝硬化的治療中發(fā)揮作用。pathways in cancer是富集程度最高的通路。通路靶點圖可以看出該復方主要通過干預關鍵靶點的上下游基因,而發(fā)揮對pathways in cancer中的ERK signaling、TGF-βsignaling pathway、calcium signaling、nuclear receptor signaling、cell cycle G1/S 等信號通路的間接調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),肝硬化的發(fā)生和發(fā)展與Raf/MEK/ERK信號通路有密切的關系,若抑制該通路的活性,可起到抑制星狀細胞肝的增殖、促進其凋亡的作用[39-40]。TGF-β是生理(傷口愈合)和病理纖維發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子[41]。本研究結果表明,該中藥復方通過調(diào)控AR 參與androgen receptor signaling pathway,可能起到干預肝硬化進一步進展的作用。THOLE 等[42]報道,使用甾體或非甾體抗雄激素可能會導致肝硬化,表明雄激素/AR信號可能會阻止肝硬化的進展。在小鼠模型研究中,WU 等[43]證明AR 在促進HBV復制和肝炎中起關鍵作用,其發(fā)現(xiàn)肝細胞中AR的敲除導致HBV復制減少。雄激素/AR信號抑制脂肪變性的發(fā)展,也可能抑制肝硬化的發(fā)展。在非癌性肝病的研究中,肝病AR敲除小鼠模型顯示雄激素/AR信號可以抑制脂肪變性、病毒相關肝炎和肝硬化的發(fā)展。

通過對核心靶點對關鍵靶點和關鍵中藥成分進行分子對接研究,除了CASP3、STAT 3與活性化合物結合能處于0～5 kJ/mol,其他對接復合物的最低結合能都小于-5.0 kJ/mol,其中IL6 與豆甾醇結合能為-11.1 kJ/mol。一般認為,結合能小于-4.25 kJ/mol、-5.0 kJ/mol或-7.0 kJ/mol分別表示配體和受體之間的特定、良好或強的結合活性[44],表明這些中藥成分都能夠較好地結合到關鍵靶點蛋白的活性位點中。

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接的方法學,通過對YQJDTLF 中的化學活性成分的生物學功能通路富集分析,闡明了其通過腫瘤相關通路等生物學過程,參與治療肝硬化過程的分子機制。并通過分子對接初步驗證了化學活性成分與肝硬化疾病靶點的相互作用模式。而目前的研究工作主要來自生物信息學分析,未來可采用體外和體內(nèi)的實驗驗證。本研究為后續(xù)的研究奠定了思路基礎。