宋姍姍，楊艾華，周艷萌，許譯文，賢 浩，李成玉，王微微

(遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)是一種人獸共患病原菌，可導(dǎo)致人和動(dòng)物的多種疾病(包括腹膜炎、心內(nèi)膜炎、肺炎等)，嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的生命安全[1]。當(dāng)前，抗生素依然是治療金黃色葡萄球菌感染的主要藥物，然而，由于傳統(tǒng)的抗菌藥物容易引起病原菌產(chǎn)生耐藥性以及抗生素研發(fā)的緩慢，臨床可能面臨無(wú)藥可用的窘境。

天然藥用植物因具有安全性高、毒副作用小和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注[2-3]。研究表明，藥用植物的抗菌機(jī)制主要包括改變細(xì)菌生物被膜的通透性、抑制參與菌體代謝的酶活性、影響細(xì)菌蛋白質(zhì)和核酸的合成等[4]。藥用植物中活性成分除了作用于病原體外，還可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體自身的免疫力來(lái)發(fā)揮其抑菌活性[5-6]。由此可見(jiàn)，藥用植物的有效藥物成分復(fù)雜，其抗菌作用可通過(guò)多種途徑來(lái)綜合實(shí)現(xiàn)，因此，需依據(jù)藥用植物的有效藥物成分的自身特點(diǎn)，采用體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)全面地評(píng)價(jià)其抗菌作用和抗菌效果。

傳統(tǒng)體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)模型常使用哺乳動(dòng)物，存在試驗(yàn)周期長(zhǎng)、效率低、成本高等問(wèn)題，無(wú)法滿足藥物研發(fā)高通量篩選的需要[7-8]。秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)具有通體透明、易觀察、易培養(yǎng)、繁殖快、與人類同源基因多等優(yōu)點(diǎn)，在新抗菌藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域受到眾多學(xué)者的關(guān)注，為促進(jìn)新型抗菌藥的探索提供了一個(gè)更方便的工具[9-13]。本試驗(yàn)應(yīng)用傳統(tǒng)水煎法制備火炭母水煎液，通過(guò)瓊脂平板法、微量肉湯稀釋法和秀麗隱桿線蟲(chóng)-金黃色葡萄球菌感染模型等體內(nèi)和體外試驗(yàn)，綜合地評(píng)價(jià)火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用，以期為進(jìn)一步研究和應(yīng)用火炭母提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 制霉菌素、5-氟尿嘧啶脫氧核苷(5-FUDR)，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；苯酚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸等有機(jī)試劑，均購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫水浴鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌種和模式生物 大腸桿菌(Escherichiacoli)OP50、金黃色葡萄球菌(編號(hào)：CMCC-26003，中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心標(biāo)準(zhǔn)菌株)和野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)(WT Bristol N2)，均由遵義醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 火炭母水煎液的制備 準(zhǔn)確稱取火炭母干燥粉末50.0 g，加10倍體積蒸餾水浸泡30 min，加熱煮沸后連續(xù)煎煮30 min，4層紗布過(guò)濾，收集濾液，藥渣再加10倍體積蒸餾水，重復(fù)煎煮并過(guò)濾。合并濾液，加熱濃縮至50 mL，制成生藥含量為1.0 g/mL的火炭母藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 主要活性成分的測(cè)定 參照趙仕花等[14]的苯酚-硫酸法，以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，測(cè)定多糖含量；參照Li等[15]的硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，以蘆丁為對(duì)照品，測(cè)定黃酮含量；參照Ebrahimabadi等[16]的Folin-ciocalteu法，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，測(cè)定多酚含量。

1.6 體外抑菌試驗(yàn)

1.6.1 供試菌液的制備 將金黃色葡萄球菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，然后挑取單菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)6 h后，用生理鹽水將菌液校正至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)[17]。

1.6.2 抑菌圈的測(cè)定 采用牛津杯法，取金黃色葡萄球菌菌液100 μL，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，然后在瓊脂平板上間隔放置孔徑6 mm的牛津杯，孔間距>20 mm。試驗(yàn)組：不同濃度(1 000、800、600、400 mg/mL和200 mg/mL)火炭母藥液100 μL；陽(yáng)性對(duì)照組：10 μg/mL環(huán)丙沙星100 μL；陰性對(duì)照組：生理鹽水100 μL。37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，觀察結(jié)果，測(cè)量并計(jì)算抑菌圈平均值[18]。判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)抑菌圈直徑≥20 mm時(shí)，表示極度敏感；當(dāng)15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm時(shí)，表示高度敏感；當(dāng)10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm時(shí)，表示中度敏感；當(dāng)6 mm≤抑菌圈直徑<10 mm時(shí)，表示低度敏感或者耐藥[19]。

1.6.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定火炭母藥液對(duì)不同菌株的MIC。具體方法：使用營(yíng)養(yǎng)肉湯將菌液稀釋100倍[20]，然后吸取100 μL菌液加于96孔培養(yǎng)板的第1～10孔，之后將不同濃度(1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.80、3.91 mg/mL和1.95 mg/mL)的藥液100 μL加至第1～10孔；空白對(duì)照孔(第11孔)：營(yíng)養(yǎng)肉湯200 μL，檢測(cè)培養(yǎng)基是否污染；陰性對(duì)照孔(第12孔)：菌液200 μL，檢測(cè)菌液是否生長(zhǎng)良好，每孔重復(fù)3次[21]。接種完成后，將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察其MIC。將最低抑菌濃度以上的幾個(gè)濃度細(xì)菌接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，觀察，菌落數(shù)小于5個(gè)的最小稀釋度的藥物濃度即為MBC[22]。

1.7 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

1.7.1 線蟲(chóng)的培養(yǎng)及同步化處理 參照Brenner[23]的方法，在顯微鏡下挑取處于產(chǎn)卵期的單個(gè)雌雄同體的線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基中，20 ℃培養(yǎng)。選取含較多產(chǎn)卵期線蟲(chóng)的NGM平板，M9緩沖液將線蟲(chóng)沖洗、收集、離心。棄上清液，加入1.5 mL線蟲(chóng)裂解液，劇烈振蕩8 min，至蟲(chóng)體全部裂解，迅速離心，棄上清液，用M9吹洗3次，離心，沉淀即可得到蟲(chóng)卵。收集蟲(chóng)卵，20 ℃靜置培養(yǎng)24 h，即可得到L1期線蟲(chóng)。將L1期線蟲(chóng)收集至涂布有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)48 h，即可得到同步化的L4期線蟲(chóng)[24]。

1.7.2 秀麗隱桿線蟲(chóng)-金黃色葡萄球菌感染模型的建立 吸取50 μL不同濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液，均勻涂布在NGM平板上。感染組1：菌液濃度為1.5×109CFU/mL；感染組2：菌液濃度為1.5×108CFU/mL；感染組3：菌液濃度為1.5×107CFU/mL；感染組4：菌液濃度為1.5×106CFU/mL。室溫下干燥20 min后，置于37 ℃培養(yǎng)8 h，取出室溫放置。轉(zhuǎn)接20條L4期線蟲(chóng)于感染平板上，并滴加一定濃度的5-FUDR，防止線蟲(chóng)繁殖。對(duì)照組：1.5×109CFU/mL 的E.coliOP50。20 ℃培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次線蟲(chóng)的存活，當(dāng)其身體僵直且對(duì)觸碰無(wú)反應(yīng)則判定為死亡。記錄線蟲(chóng)的平均生存時(shí)間和中位生存時(shí)間(LT50)。LT50即生存率在50%時(shí)對(duì)應(yīng)的時(shí)間，因此，記錄10條線蟲(chóng)死亡的時(shí)間。

1.7.3 火炭母水煎液對(duì)感染線蟲(chóng)的救治 確定細(xì)菌感染濃度，L4期線蟲(chóng)感染3 d后，將感染后的線蟲(chóng)用含有1 mmol/L NaN3的M9緩沖液洗滌，離心，棄上清液，重復(fù)3次后，收集蟲(chóng)體，取20條感染線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至不同濃度的藥物平板上，每組3個(gè)重復(fù)，并于20 ℃恒溫靜置培養(yǎng)。試驗(yàn)組1：加入1 000 mg/mL的火炭母藥液100 μL；試驗(yàn)組2：加入800 mg/mL的火炭母藥液100 μL；試驗(yàn)組3：加入600 mg/mL的火炭母藥液100 μL；試驗(yàn)組4：加入400 mg/mL的火炭母藥液100 μL；試驗(yàn)組5：加入200 mg/mL的火炭母藥液100 μL；陽(yáng)性對(duì)照組：加入10 μg/mL環(huán)丙沙星100 μL；對(duì)照組：E.coliOP50喂養(yǎng)線蟲(chóng)。每組設(shè)置3次平行試驗(yàn)，每隔24 h觀察1次線蟲(chóng)的存活。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用軟件SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Kaplan-Meier法繪制線蟲(chóng)生存曲線，Graph Pad Prism 7進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，Log Rank檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異比較。P<0.05表明具有顯著性差異，P<0.01表明具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 火炭母水煎液主要活性成分測(cè)定 本試驗(yàn)以傳統(tǒng)水煎法制備火炭母水煎液，取1 mL 1.0 g/mL水煎液測(cè)定多糖、黃酮和多酚含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 火炭母水煎液中多糖、黃酮和多酚含量

2.2 火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性 本試驗(yàn)采用牛津杯法測(cè)定了火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)火炭母水煎液濃度≥200 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制效果；濃度在1 000 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為(17.5±0.1)mm，屬于高度敏感。

表2 抑菌圈直徑大小隨火炭母水煎液濃度的變化

2.3 火炭母水煎液MIC和MBC的測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法，觀察培養(yǎng)板澄清度確定火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC。結(jié)果顯示，火炭母水煎液濃度在7.80～1.95 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)板內(nèi)液體渾濁，有菌生長(zhǎng)；在500～15.63 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)板內(nèi)液體澄清透明，無(wú)渾濁現(xiàn)象，最終確定火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為15.63 mg/mL。取該藥物濃度范圍的培養(yǎng)孔內(nèi)液體進(jìn)行涂板，菌落計(jì)數(shù)，最終確定火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC為31.25 mg/mL。

2.4 秀麗隱桿線蟲(chóng)-金黃色葡萄球菌感染模型的建立 金黃色葡萄球菌濃度可以影響線蟲(chóng)感染的程度，故選擇不同濃度的細(xì)菌(1.5×109、1.5×108、1.5×107CFU/mL和1.5×106CFU/mL)對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行感染，以確定建立線蟲(chóng)感染模型的最佳金黃色葡萄球菌濃度并構(gòu)建模型，結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。對(duì)照組線蟲(chóng)最長(zhǎng)生存時(shí)間為20 d，感染組1感染線蟲(chóng)最長(zhǎng)生存時(shí)間為15 d；隨著金黃色葡萄球菌菌液濃度的增加，線蟲(chóng)中位生存時(shí)間(LT50)逐漸縮短。采用Log Rank檢驗(yàn)顯示，感染組3和感染組4與對(duì)照組的生存曲線無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示該菌液濃度對(duì)線蟲(chóng)無(wú)明顯致死效果；感染組1和感染組2的生存率均低于對(duì)照組，并且生存曲線與對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說(shuō)明菌液濃度范圍在1.5×109～1.5×108CFU/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌感染可造成線蟲(chóng)顯著的致死效果，其中感染組1與對(duì)照組的差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明該組對(duì)線蟲(chóng)的致死作用更強(qiáng)。因此，選用感染組1，即金黃色葡萄球菌菌液濃度為1.5×109CFU/mL用于構(gòu)建線蟲(chóng)感染模型和感染線蟲(chóng)的救治試驗(yàn)。

圖1 不同濃度金黃色葡萄球菌感染線蟲(chóng)的生存曲線

表3 不同濃度金黃色葡萄球菌感染后線蟲(chóng)的生存時(shí)間

2.5 火炭母水煎液對(duì)感染后線蟲(chóng)的救治 采用濃度分別為1 000、800、600、400 mg/mL和200 mg/mL的火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌感染線蟲(chóng)進(jìn)行救治試驗(yàn)，以線蟲(chóng)是否死亡為結(jié)局變量，記錄線蟲(chóng)的生存狀況，以分析不同濃度藥物對(duì)感染線蟲(chóng)的救治情況。結(jié)果見(jiàn)圖2和表4。1.5×109CFU/mL金黃色葡萄球菌感染線蟲(chóng)，試驗(yàn)組1線蟲(chóng)生存時(shí)間延長(zhǎng)了4 d；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2的藥液可以明顯地提高線蟲(chóng)的存活率，并且生存曲線與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；試驗(yàn)組3、試驗(yàn)組4和試驗(yàn)組5的藥液幾乎無(wú)明顯救治效果，說(shuō)明在800～1 000 mg/mL的藥物濃度范圍內(nèi)，藥液能夠有效治療金黃色葡萄球菌感染的線蟲(chóng)。

表4 不同濃度火炭母水煎液對(duì)感染后線蟲(chóng)生存時(shí)間的影響

圖2 不同濃度的火炭母水煎液治療感染線蟲(chóng)的生存曲線

2.6 火炭母水煎液成分含量與抑菌活性的相關(guān)性 由表5可知，通過(guò)Pearson相關(guān)性分析，隨著火炭母水煎液成分含量的增加，其抑制金黃色葡萄球菌的活性逐漸增強(qiáng)，具有相關(guān)性。其中，3種活性成分相比較，火炭母水煎液抑菌活性與黃酮含量的相關(guān)性最強(qiáng)，與黃酮具有抗炎、抗病毒、抗肝炎等藥理作用相符。但火炭母水煎液的活性功效除受成分含量影響外，還與活性物質(zhì)成分間的協(xié)同作用以及其他因素有關(guān)。因此，火炭母水煎液生物學(xué)活性不能僅從其活性物質(zhì)含量的高低進(jìn)行推測(cè)。

表5 火炭母水煎液活性成分與功效的相關(guān)性

3 討論

近年來(lái)，隨著抗生素廣泛和大量的使用，細(xì)菌耐藥率越來(lái)越高，促使人類必須不斷開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物。由于天然藥用植物抗感染是利用其多種復(fù)雜有效成分調(diào)節(jié)機(jī)體平衡、提高機(jī)體免疫力，單純體外試驗(yàn)無(wú)法確定藥物效果，需體內(nèi)外試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)天然藥用植物的抗菌作用[25]。因此，本試驗(yàn)采用牛津杯法和微量肉湯稀釋法測(cè)定火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用，確定了火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為15.63 mg/mL、MBC為31.25 mg/mL，隨后建立秀麗隱桿線蟲(chóng)-金黃色葡萄球菌感染模型，體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示在800～1 000 mg/mL藥物濃度范圍內(nèi)，火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌感染的線蟲(chóng)有救治作用。

秀麗隱桿線蟲(chóng)作為一種簡(jiǎn)單、公認(rèn)的新型模式生物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，包括細(xì)菌致病機(jī)制和抗生素篩選等研究[26]。周雨朦等[9]建立了秀麗隱桿線蟲(chóng)-耐藥銅綠假單胞菌感染模型，并將其作為整體生物模型，用于排除毒性高且體內(nèi)外相關(guān)性差的抗生素。本試驗(yàn)通過(guò)建立秀麗隱桿線蟲(chóng)-金黃色葡萄球菌感染模型，評(píng)價(jià)了火炭母水煎液對(duì)線蟲(chóng)感染金黃色葡萄球菌后的治療效果，基于對(duì)不同濃度的火炭母水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌感染后線蟲(chóng)生存時(shí)間的觀察，結(jié)果顯示高濃度的火炭母水煎液能夠延長(zhǎng)感染后線蟲(chóng)的生存時(shí)間，但對(duì)生存時(shí)間的影響為非濃度依賴性，即隨著濃度的增加，線蟲(chóng)生存時(shí)間并無(wú)明顯變化。

本試驗(yàn)選取了天然藥用植物火炭母，通過(guò)體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)確定了其水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑菌效果，為金黃色葡萄球菌感染的治療提供了新思路。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，火炭母的藥理功效與其有效成分含量存在相關(guān)性，因而，在后續(xù)研究中將對(duì)火炭母水煎液中的有效成分進(jìn)行分離純化，分析各有效成分的抗菌效果，以期為火炭母抗菌成分的研究及應(yīng)用提供參考依據(jù)。