陳文東，陳耀年，何玉鵬，葉文斌，蘇滿春，徐永平

(1.隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

灰鶴(Grusgrus)屬鶴形目鶴科，又稱千歲鶴、番薯鶴、玄鶴等，為棲息在近水區(qū)域和沼澤地的大型遷徙涉禽，其為雜食性動(dòng)物，常選擇草洲、稻田、淺水區(qū)和泥灘生境作為棲息地，以植物根莖、植物嫩芽、草籽、蒲公英、農(nóng)作物種子等為食[1]。我國(guó)境內(nèi)灰鶴的分布廣泛，東起黑龍江撫遠(yuǎn)縣，西至新疆喀什地區(qū)，南到四川若爾蓋草原，北達(dá)內(nèi)蒙古甘河流域，包括甘肅、吉林、內(nèi)蒙古、青海、黑龍江、新疆和寧夏等，分布范圍在東經(jīng)76°～135°，北緯32°20′～53°[2]。研究表明，甘肅地區(qū)灰鶴多為旅鳥或夏候鳥，少部分為冬候鳥，境內(nèi)隴南山地、蘭州黃河、甘南高原、祁連山地、黃土高原和河西走廊的灰鶴為遷徙灰鶴[3]。

本試驗(yàn)從隴南受傷的灰鶴泄殖腔內(nèi)分離出1株大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)，對(duì)其進(jìn)行生化試驗(yàn)、16S rRNA基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化樹分析，并通過藥敏試驗(yàn)和小鼠致病試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行耐藥性和致病性分析，為大腸桿菌引起灰鶴腹瀉的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、革蘭染液，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；BGI D2 000 Plus DNA Ladder、BGI 2×Super PCR Mix，均購(gòu)自武漢華大基因科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自廈門太陽(yáng)馬生物工程有限公司；磁珠法PCR清潔試劑盒，購(gòu)自上海碩美生物科技有限公司；18種藥敏紙片，購(gòu)自湖南比克曼生物科技有限公司。PCR引物合成及測(cè)序由武漢華大基因科技有限公司完成。

1.2 主要儀器 PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；電熱式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.3 樣品采集及細(xì)菌分離純化 用無(wú)菌棉簽采集灰鶴泄殖腔內(nèi)容物，置于裝有無(wú)菌生理鹽水的離心管內(nèi)，充分混勻后，離心，將上清液接種于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，用接種環(huán)挑取紅色菌落接種于另一麥康凱瓊脂平板，繼續(xù)37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，如此反復(fù)純化細(xì)菌5次，最后1次將菌株分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，觀察2種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，再挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌的染色特點(diǎn)和形態(tài)特征。

1.4 生化鑒定 參照《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[4]中生化試驗(yàn)培養(yǎng)基配制方法、操作步驟和結(jié)果判定方法，對(duì)分離菌進(jìn)行生化鑒定，觀察并記錄結(jié)果。

1.5 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 常規(guī)提取分離菌株的基因組DNA，制備DNA模板并進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增，PCR所用引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：1 μL DNA模板，15 μL 2×GC Buffer Ⅰ，2 μL引物(上、下游各1 μL)，最后加ddH2O至30 μL。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性5 min；96 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，于4 ℃保存。參照磁珠法PCR清潔試劑盒說明書純化PCR產(chǎn)物，純化后進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察條帶大小，回收PCR產(chǎn)物后寄至武漢華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST比對(duì)并用鄰接法(Neighbor-Joining algorithm,N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 引物信息

1.6 藥敏試驗(yàn) 用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer，K-B)[5]對(duì)分離菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)整菌液濃度至5×108CFU/mL，將菌液均勻涂布于普通瓊脂平板，靜置片刻后，用無(wú)菌鑷子將18種常用抗菌藥藥敏紙片貼于平板表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，結(jié)果按耐藥(R)、敏感(S)和中介(I)判定。

1.7 致病性試驗(yàn) 將12只BALB/c小鼠(體重18～22 g，雌雄各半)隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。試驗(yàn)組腹腔注射細(xì)菌懸液(生理鹽水將菌液調(diào)配至濃度為2.12×109CFU/mL)，每只0.5 mL，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，觀察小鼠死亡情況，剖檢死亡小鼠，做剖檢記錄，并于病變明顯部位取樣分離病原菌。將剖檢小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟固定于4%多聚甲醛內(nèi)，制作病理組織切片，觀察各器官的組織形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離純化 分離菌株可在鮮血培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，無(wú)溶血環(huán)；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為紅色菌落，菌落呈圓形、半透明，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上形成紫黑色菌落，菌落有金屬光澤，呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊。革蘭染色顯示菌體呈長(zhǎng)短不一的短桿狀，兩端鈍圓，紅色，散在分布。

2.2 生化鑒定 分離菌株可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖和麥芽糖，對(duì)甘露醇、MR試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)硝酸鹽、尿素酶、硫化氫、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽反應(yīng)呈陰性反應(yīng)。上述結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[6]比對(duì)，初步判定分離菌株為大腸桿菌，命名為HH1。

2.3 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，樣品均可得到明亮的大小為1 500 bp的電泳條帶(圖1)，與預(yù)期大小相符，符合測(cè)序條件。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，HH1與大腸桿菌的同源性達(dá)99%。用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，HH1與大腸桿菌(MT424913.1.seq、MH111527.1.seq、MK729001.1.seq、OK325789.1.seq、MW175585.1.seq)聚為一簇，親緣關(guān)系最近(圖2)。PCR擴(kuò)增、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果結(jié)合生化鑒定結(jié)果，判定HH1為大腸桿菌。

圖1 分離菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增

圖2 分離菌16S rRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(N-J法)

2.4 藥敏試驗(yàn) HH1對(duì)青霉素、紅霉素、多西環(huán)素和四環(huán)素耐藥，對(duì)慶大霉素、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢呋辛、哌拉西林、氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素和多黏菌素敏感(表2)。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組小鼠于腹腔接種細(xì)菌懸液8 h后開始出現(xiàn)死亡，至接種17 h后全部死亡，對(duì)照組小鼠未見異常。剖檢死亡小鼠，可見小鼠胃呈明顯臌氣狀，脾臟、腎臟出現(xiàn)輕微充血，肺臟有明顯淤血斑塊。從死亡小鼠的肺臟內(nèi)分離病原菌，經(jīng)鑒定為大腸桿菌，與攻毒菌株一致。病理組織切片觀察可見，死亡小鼠肺臟肺泡內(nèi)有明顯的滲出，其余內(nèi)臟組織未見明顯病理變化。

死亡小鼠內(nèi)臟病理切片結(jié)果顯示，心臟未見明顯異常，可見縱切心肌纖維及部分心肌纖維斷面，心肌細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞胞核清晰可見，心肌內(nèi)毛細(xì)血管未見擴(kuò)張；肝臟中央靜脈和肝血竇內(nèi)見少量紅細(xì)胞，其他結(jié)構(gòu)未見明顯異常，肝細(xì)胞胞質(zhì)呈粉紅色，邊界清晰，胞核呈圓形，藍(lán)紫色，核仁清晰可見，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈索狀排列，形成不規(guī)則的肝索；脾臟未見明顯異常，組織切片觀察可見明顯的白髓和紅髓區(qū)，白髓內(nèi)可見中央動(dòng)脈及動(dòng)脈周圍淋巴鞘，紅髓內(nèi)含較多紅細(xì)胞，脾小梁清晰可見；肺臟切片可見呼吸性細(xì)支氣管和大部分肺泡內(nèi)有明顯滲出，部分肺泡外周見少量炎性細(xì)胞，肺泡壁略增厚(圖3)；腎小管部分管腔及管腔之間有紅細(xì)胞聚集，腎小球未見明顯異常。

圖3 分離菌致死小鼠肺臟病理切片觀察(200×)

3 討論

灰鶴是國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物，被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ中[7]，據(jù)報(bào)道，截至21世紀(jì)初，我國(guó)分布的灰鶴總數(shù)為21 632～22 401只[3]。張成林等[8]對(duì)我國(guó)鶴類疾病發(fā)生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)引起鶴類發(fā)病的主要原因?yàn)榧?xì)菌感染、寄生蟲感染和營(yíng)養(yǎng)因素，細(xì)菌感染因素中大腸桿菌為引起鶴類發(fā)病的主要病原菌之一。張偉木等[9]證實(shí)，引起3例幼灰鶴死亡的致病性大腸桿菌血清型為O111B14。此外，在孔雀、蓑羽鶴和丹頂鶴等珍稀飛禽中均有因感染大腸桿菌而死亡的病例，因此，大腸桿菌正嚴(yán)重威脅著野生飛禽的生命健康[10-11]，給保護(hù)珍稀野生飛禽工作帶來(lái)諸多挑戰(zhàn)。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，HH1對(duì)青霉素、紅霉素、多西環(huán)素和四環(huán)素具有耐藥性。Dou等[12]報(bào)道，國(guó)內(nèi)東部地區(qū)的243株禽致病性大腸桿菌中，有98%的菌株對(duì)四環(huán)素耐藥；胡紫萌等[13]分離鑒定的禽致病性大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率更是高達(dá)100%；郭長(zhǎng)明等[14]分離的大腸桿菌對(duì)多西環(huán)素的耐藥率為100%；彭嚴(yán)嚴(yán)等[15]分離的9株鵝源大腸桿菌全部含β-內(nèi)酰胺類耐藥基因；陳文靜等[16]研究表明，鴨源致病性大腸桿菌100%對(duì)紅霉素耐藥，上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)分離大腸桿菌的耐藥性結(jié)果一致，這可能是灰鶴在采食或遷徙的過程中與家禽接觸產(chǎn)生的相互感染。野生飛禽幾乎不使用抗菌藥，但其所攜帶致病菌卻表現(xiàn)多重耐藥性(對(duì)3種或3種以上抗菌藥耐藥)，這可能會(huì)嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全，值得高度重視[17]。本試驗(yàn)為救治灰鶴的臨床用藥提供理論依據(jù)，并取得了較好的治療效果。

本試驗(yàn)16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示，分離菌株與大腸桿菌同源性最高，達(dá)99%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，本試驗(yàn)分離菌株與大腸桿菌(MT424913.1.seq、MH111527.1.seq、MK729001.1.seq、OK325789.1.seq、MW175585.1.seq)為同一聚類，親緣關(guān)系最近，而MH111527.1.seq和OK325789.1.seq均為來(lái)自于人類腸道內(nèi)的大腸桿菌，表明該分離菌株有成為人獸共患病病原體的潛在性。

本試驗(yàn)小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株HH1主要引起小鼠肺泡腔內(nèi)明顯滲出，而對(duì)其他器官(心、肝、脾、腎)無(wú)明顯致病作用。研究發(fā)現(xiàn)，禽類等多種動(dòng)物的肺炎、敗血癥和腸炎等疾病多是因腸外致病性大腸桿菌引起的[18]，近年來(lái)大腸桿菌引起動(dòng)物呼吸系統(tǒng)病變死亡的報(bào)道較多，有學(xué)者分別從水貂肺臟[19]、狐貍肺臟[20]及因患呼吸系統(tǒng)疾病而死亡的水貂肺臟[21]內(nèi)分離出致病性大腸桿菌。由此可見，本試驗(yàn)分離到的大腸桿菌極有可能為禽腸外致病性大腸桿菌，且該菌具有一定的器官侵害傾向。