許紫薇，馮翠萍，樊雙喜，張柏林，趙宏飛，劉一諾，岳紅衛(wèi)，吉鑫，張松祥，陸瑋，王道兵，卜凡，鐘其頂*

1(北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100091)2(中輕檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司，北京，100015) 3(安徽古井貢股份有限公司，安徽 亳州，236800)4(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 5(泰科施普(北京)技術(shù)有限公司，北京，100039)

GB/T 17204—2008《飲料酒分類》中將飲料酒定義為酒精度在0.5%(體積分?jǐn)?shù))以上的酒精飲料，包括各種發(fā)酵酒、蒸餾酒及配制酒，如黃酒、啤酒、果酒、葡萄酒、白酒、白蘭地、威士忌、伏特加、朗姆酒和露酒等。酒精度是飲料酒的一項(xiàng)重要質(zhì)量指標(biāo)，是影響酒類產(chǎn)品等級(jí)及口感的重要因素[1]。以酒精度為標(biāo)準(zhǔn)可將白酒分為高度白酒、中度白酒和低度白酒。研究顯示，酒精度是影響濃香型白酒中總酸總酯含量的重要因素之一[2]。目前，國(guó)家有關(guān)部門根據(jù)食品質(zhì)量法、食品安全法加強(qiáng)了酒類產(chǎn)品的抽檢力度，酒精度是其中的重要指標(biāo)[3]。

現(xiàn)行飲料酒中酒精度的測(cè)定方法依據(jù)GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》。其中，密度瓶法適用于蒸餾酒、發(fā)酵酒和配制酒，儀器成本低、便于普及，但操作繁瑣、對(duì)溫度敏感[4]；酒精計(jì)法適用于酒精、蒸餾酒、發(fā)酵酒和配制酒(除啤酒外)，儀器操作簡(jiǎn)單，但易受酒中其他成分干擾、對(duì)溫度敏感[5]；氣相色譜法適用于葡萄酒、果酒和啤酒，儀器穩(wěn)定，但測(cè)定酒精度高的飲料酒時(shí)需蒸餾和稀釋，操作繁瑣；數(shù)字密度計(jì)法適用于啤酒、白蘭地、威士忌和伏特加，測(cè)試快速、簡(jiǎn)單，但需蒸餾法除去不揮發(fā)物質(zhì)，前處理復(fù)雜、樣品用量大。此外，王超等[6]利用直接酒精計(jì)法測(cè)定了不含糖露酒的酒精度，但無法準(zhǔn)確測(cè)定其他酒體含量復(fù)雜的飲料酒，樣品用量大。近紅外光譜法適用于發(fā)酵酒和蒸餾酒酒精度的測(cè)定[7-8]，但在實(shí)際測(cè)定中，樣品中水分掩蓋了其他成分的吸收信號(hào)，對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定影響[5,9]，且需蒸餾操作，測(cè)試過程相對(duì)復(fù)雜費(fèi)時(shí)。綜上，目前實(shí)驗(yàn)室中常用測(cè)定飲料酒中酒精度的方法，大都需要預(yù)先對(duì)飲料酒進(jìn)行蒸餾處理，且實(shí)際檢測(cè)過程中實(shí)驗(yàn)操作人員的熟練度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響很大。

定量核磁共振技術(shù)(quantitative nuclear magnetic resonance, QNMR)是一種十分有效的定量技術(shù)，具有前處理簡(jiǎn)單、樣品用量少、可同步進(jìn)行定性和定量分析的優(yōu)點(diǎn)[10]。目前，QNMR已經(jīng)廣泛應(yīng)用于制藥、食品、生命科學(xué)、化工等行業(yè)，并被各國(guó)藥典收錄[3]。QNMR在啤酒[11-12]、葡萄酒[13]、白酒[14-15]、黃酒[16]等飲料酒中均有相關(guān)應(yīng)用研究，如CAO等[11]用QNMR定量液體飲料中的蔗糖，欒曉菲等[12]用QNMR定量分析了啤酒中28種主要成分。

本文采用臺(tái)式低場(chǎng)(60 MHz)核磁共振波譜儀對(duì)飲料酒中酒精度進(jìn)行定量分析，基于一維核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)技術(shù)對(duì)飲料酒中酒精度測(cè)定方法進(jìn)行了研究，并對(duì)代表性的幾種飲料酒(白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒)酒精度測(cè)定方法做了方法驗(yàn)證，以期開發(fā)出一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確性好的飲料酒中酒精度測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬酸(99%)、琥珀酸(99%)，Sigma-Aldrich公司；無水乙醇(分析純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；重水(99.9%)，北京伊諾凱科技有限公司；白酒樣品購(gòu)于某電商平臺(tái)，含濃香型、濃香醬香兼香型和醬香型3種香型4個(gè)樣品；啤酒樣品購(gòu)于某超市，共4個(gè)樣品；葡萄酒樣品和櫻桃發(fā)酵酒樣品購(gòu)于某電商平臺(tái)。

NMReady-60PRO高性能60 MHz基準(zhǔn)核磁共振波譜儀，Nanalysis公司；AB204-N天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、檸檬酸溶液及琥珀酸溶液配制

乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：用無水乙醇和水配制成體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液。

白酒測(cè)定的檸檬酸外標(biāo)溶液：稱取檸檬酸4 g(精確到0.01 mg)，用水定容到10 mL。

啤酒、葡萄酒和櫻桃發(fā)酵酒測(cè)定的檸檬酸外標(biāo)溶液：稱取檸檬酸1 g(精確到0.01 mg)，用水定容到10 mL。

檸檬酸內(nèi)標(biāo)溶液：稱取檸檬酸4 g(精確到0.01 mg)，用重水定容到10 mL。

琥珀酸內(nèi)標(biāo)溶液：稱取琥珀酸0.4 g(精確到0.01 mg)，用重水定容到10 mL。

1.2.2 上機(jī)樣品制備

標(biāo)曲法：取500 μL酒樣加入到2 mL 離心管中，再加入500 μL重水，混勻后取600 μL于核磁管中待測(cè)。用同樣的方法制備乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)樣品。

外標(biāo)法：取500 μL酒樣加入到2 mL 離心管中，再加入500 μL重水，混勻后取600 μL于核磁管中待測(cè)。用同樣的方法制備檸檬酸外標(biāo)液上機(jī)樣品。

內(nèi)標(biāo)法：取500 μL酒樣加入到2 mL 離心管中，再加入500 μL檸檬酸或琥珀酸內(nèi)標(biāo)液，混勻后取600 μL于核磁管中待測(cè)。

1.2.31H NMR測(cè)定參數(shù)

空掃次數(shù)：0次；掃描次數(shù)：16次；譜寬：8 000 Hz；激發(fā)中心：標(biāo)曲法和外標(biāo)法中標(biāo)準(zhǔn)樣品和酒樣品激發(fā)中心位置為乙醇甲基的出峰位置δ1.0，白酒測(cè)定的外標(biāo)樣品為δ2.45，啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒測(cè)定的外標(biāo)樣品為δ2.85。內(nèi)標(biāo)法中激發(fā)中心位置為內(nèi)標(biāo)樣品出峰位置和乙醇甲基出峰位置的中間位置δ1.50；接收增益：14；檢測(cè)脈沖：激發(fā)角度為90°的單脈沖；弛豫時(shí)間：標(biāo)曲法和外標(biāo)法測(cè)定時(shí)，白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒酒精度測(cè)定弛豫延遲時(shí)間(D1)分別為10、30、15、15 s，內(nèi)標(biāo)法分別為10、30、25、25 s；采樣點(diǎn)數(shù)：4 096。

1.2.41H NMR譜圖預(yù)處理

使用MestReNova12.0軟件(Mestrelab Research S.L.，MestReNova(Mnova)NMR，USA)對(duì)測(cè)試所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行傅里葉變換、相位校正、基線校正及定標(biāo)處理，將乙醇甲基的化學(xué)位移定為δ1.00，檸檬酸外標(biāo)溶液中沒有乙醇，將H2O的化學(xué)位移定為δ4.79。

1.2.5 精密度分析

隨機(jī)取1份樣品，在1 d內(nèi)分別用標(biāo)曲法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法重復(fù)測(cè)定5次，求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析日內(nèi)精密度；隨機(jī)取1份樣品，在5 d內(nèi)分別用標(biāo)曲法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法重復(fù)測(cè)定5次，求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析日間精密度。

1.2.6 加標(biāo)回收率分析

取1份樣品，加入4份不同濃度水平的乙醇，每個(gè)濃度水平分別用外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、標(biāo)曲法分別測(cè)定2次，測(cè)定結(jié)果取平均值，分別計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.7 準(zhǔn)確性分析

將標(biāo)曲法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果與GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》中數(shù)字密度計(jì)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量方法選擇

核磁常用的定量方法有標(biāo)曲法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。標(biāo)曲法需要配制系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣品需要模擬待測(cè)樣品，不確定度高，但無需選擇外標(biāo)樣品和內(nèi)標(biāo)樣品。外標(biāo)法無需考慮外標(biāo)物質(zhì)與待測(cè)物是否相互影響，在保證外標(biāo)樣品不變質(zhì)的前提下可以多次重復(fù)使用，但需要同時(shí)測(cè)試樣品和外標(biāo)的90°脈沖寬度和定量1H NMR，不確定度也相對(duì)較高。內(nèi)標(biāo)法定量不確定度優(yōu)于標(biāo)曲法和外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)樣品只需經(jīng)過1次檢測(cè)即可，但需仔細(xì)選擇內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以避免內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和待測(cè)物之間的相互作用，導(dǎo)致信號(hào)重疊，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和待測(cè)物必須可溶于所選的核磁共振溶劑中。

本研究分別采用標(biāo)曲法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法對(duì)飲料酒的酒精度檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。

2.1.1 標(biāo)曲法

將乙醇標(biāo)準(zhǔn)液定量1H NMR的定量峰積分面積的絕對(duì)值為橫坐標(biāo)，乙醇標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=αx+β，再用相同方法得到待測(cè)樣品的定量1H NMR定量峰積分面積的絕對(duì)值，用插值法得到樣品中酒精度。乙醇標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品的測(cè)試參數(shù)和處理參數(shù)必須完全一致。

2.1.2 外標(biāo)法

PULCON外標(biāo)法定量使用外部參考樣品，將外部參考樣品的校準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到實(shí)際樣品中，因此無需考慮分析物和參考樣品之間的相互作用和信號(hào)重疊。此外，采用PULCON外標(biāo)法成本相對(duì)較低，可重復(fù)多次利用，進(jìn)一步降低了核磁共振的檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化了前處理操作。檸檬酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水，如圖1所示以水做溶劑的1H NMR譜僅在δ2.44處有檸檬酸2個(gè)亞甲基的4個(gè)氫的一組峰，用于定量分析結(jié)果準(zhǔn)確，因此選擇檸檬酸作為外部參考物，用公式(1)計(jì)算待測(cè)物的含量。

(1)

式中：C，分析物質(zhì)量濃度，mg/L；A，絕對(duì)積分面積；M，相對(duì)分子質(zhì)量，Da；nH，質(zhì)子數(shù)；NS，掃描次數(shù)；P1，1H 90°脈沖寬度；T，檢測(cè)溫度，℃；下標(biāo)Q表示外部參考樣品；下標(biāo)S表示待測(cè)分析物。

2.1.3 內(nèi)標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法定量需在樣品溶液中加入一定量的內(nèi)部參考物，在充分弛豫的條件下，核磁共振信號(hào)強(qiáng)度(峰面積)與產(chǎn)生該信號(hào)的原子的數(shù)目成正比，而與其化學(xué)性質(zhì)和所處的化學(xué)環(huán)境無關(guān)。琥珀酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不與酒中物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，在水中有較高的溶解度，其水溶液的1H NMR譜只有一組峰，代表4個(gè)氫原子，由圖1可知，其信號(hào)不與啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒中乙醇信號(hào)峰發(fā)生重疊，和乙醇的信號(hào)基線分離良好，所以選用琥珀酸作為酒精度較低飲料酒的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。白酒中酒精度較高，相應(yīng)的需要內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度也要高一些，但琥珀酸在20 ℃時(shí)的溶解度為7 g/100 g，對(duì)于酒精度一般大于18%vol的白酒，琥珀酸不適合作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。檸檬酸易溶于水，性質(zhì)穩(wěn)定，由圖1可知，檸檬酸的信號(hào)δ2.74不和白酒中乙醇的信號(hào)重疊，基線分離較好，所以用檸檬酸作為白酒酒精度測(cè)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。以內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)峰面積作為參考，飲料酒甲基的信號(hào)峰作為定量峰，根據(jù)公式(2)計(jì)算飲料酒中乙醇的濃度。

(2)

式中：C，分析物質(zhì)量濃度，mg/L；M，相對(duì)分子質(zhì)量,Da；nH，質(zhì)子數(shù)；A，信號(hào)積分面積；下標(biāo)S表示待測(cè)分析物；下標(biāo)Std表示內(nèi)標(biāo)物。

圖1 外標(biāo)檸檬酸和各飲料酒與內(nèi)標(biāo)混合溶液的1H NMR譜圖Fig.1 1H NMR spectrum of external standard citric acid and mixed solutions of alcoholic beverages with internal standards

2.2 測(cè)試參數(shù)優(yōu)化

核磁共振測(cè)試中，弛豫過程分為自旋-晶格弛豫(縱向弛豫)和自旋-自旋弛豫(橫向弛豫)，縱向弛豫時(shí)間(T1)一般大于橫向弛豫時(shí)間(T2)。弛豫延遲時(shí)間(D1)是QNMR中非常重要的一個(gè)參數(shù)，弛豫延遲時(shí)間設(shè)置太短會(huì)導(dǎo)致縱向磁化矢量不能完全恢復(fù)[18]，使定量峰的積分面積不能代表實(shí)際質(zhì)子數(shù)，從而影響定量的準(zhǔn)確性，但弛豫延遲時(shí)間設(shè)置過長(zhǎng)又會(huì)導(dǎo)致測(cè)試時(shí)間過長(zhǎng)。本文采用反轉(zhuǎn)恢復(fù)法測(cè)定了標(biāo)曲法和外標(biāo)法中白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃酒樣品中乙醇的甲基、亞甲基和外標(biāo)檸檬酸樣品的T1，以及內(nèi)標(biāo)法中白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃酒樣品中乙醇的甲基、亞甲基及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的T1，設(shè)置D1為定量峰T1的5倍[19]，以達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的，測(cè)定結(jié)果見表1。使用標(biāo)曲法和外標(biāo)法測(cè)定時(shí)，白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒酒精度測(cè)定時(shí)D1分別設(shè)為10、30、15、15 s，內(nèi)標(biāo)法分別為10、30、25、25 s。

表1 T1測(cè)定結(jié)果Table 1 T1 determination results

激發(fā)中心位置(o1p)在標(biāo)曲法和外標(biāo)法中為定量峰的出峰位置，對(duì)于內(nèi)標(biāo)法而言為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的出峰位置和乙醇定量峰的中間位置。接收增益值既不能太大也不能太小，太大數(shù)據(jù)會(huì)溢出，太小會(huì)影響定量的靈敏度，通過儀器計(jì)算發(fā)現(xiàn)增益值為14較合適。

需要特別說明的是標(biāo)曲法中標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品所有測(cè)試參數(shù)必須保持完全一致；外標(biāo)法中外標(biāo)樣品和待測(cè)樣品的所有測(cè)試參數(shù)必須保持一致。

2.3 定量峰和積分區(qū)域的選擇

定量峰應(yīng)包含的質(zhì)子數(shù)多、峰裂分少，才能使定量靈敏度高。定量峰所代表的基團(tuán)T1時(shí)間應(yīng)相對(duì)較短，測(cè)試時(shí)間才能短。乙醇的甲基信號(hào)峰相比亞甲基包含的質(zhì)子數(shù)多、裂分少，由表1和表2可知T1也較短，所以選用乙醇甲基的信號(hào)峰作為定量峰。

積分區(qū)域應(yīng)最大包含定量峰的區(qū)域，但不能把定量峰周邊其他雜質(zhì)峰包含進(jìn)去，在不把雜質(zhì)峰包含進(jìn)去的前提下，一般以定量峰為中點(diǎn)至少向兩邊延伸20倍的半峰寬。使用標(biāo)曲法及外標(biāo)法時(shí)，乙醇標(biāo)準(zhǔn)液的積分區(qū)域?yàn)棣?.43～0.30；白酒的積分區(qū)域?yàn)棣?.29～0.64，啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒的積分區(qū)域分別為δ1.30～0.67、δ1.30～0.65、δ1.30～0.64；白酒測(cè)定的外標(biāo)檸檬酸的積分區(qū)域?yàn)棣?.82～2.03，啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒測(cè)定的外標(biāo)檸檬酸的積分區(qū)域?yàn)棣?.22～2.46。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，白酒乙醇甲基積分區(qū)域?yàn)棣?.30～0.67，內(nèi)標(biāo)檸檬酸積分區(qū)域?yàn)棣?.12～2.31；啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒乙醇甲基積分區(qū)域分別為δ1.30～0.68、δ1.30～0.65、δ1.30～0.66，內(nèi)標(biāo)琥珀酸積分區(qū)域分別為δ2.63～2.30、δ2.61～2.30、δ2.62～2.30。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性分析

以1.2.3的參數(shù)測(cè)定1.2.1配制的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1H NMR，以乙醇標(biāo)準(zhǔn)液體積分?jǐn)?shù)作為橫坐標(biāo)，1H NMR中乙醇甲基峰積分面積作為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=10.63x-8.074，R2=0.996 1，可見乙醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%～80%時(shí)，標(biāo)曲法測(cè)定線性良好。

以外標(biāo)法測(cè)定1.2.1配制的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，乙醇標(biāo)準(zhǔn)液體積分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=1.054 4x-0.610 1，R2=0.996 1，可見乙醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%～80%時(shí)，外標(biāo)法線性良好。

以內(nèi)標(biāo)法測(cè)定1.2.1配制的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，乙醇標(biāo)準(zhǔn)液體積分?jǐn)?shù)作縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=0.953 6x+0.389 8，R2=0.999 5，可見乙醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%～80%時(shí)，內(nèi)標(biāo)法線性良好。

2.4.2 精密度分析

2.4.2.1 日內(nèi)精密度

白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒各取1個(gè)樣品，在1 d內(nèi)每間隔2 h分別用標(biāo)曲法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法測(cè)定酒精度，共測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度，由表2可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)<5%，日內(nèi)精密度良好，滿足方法準(zhǔn)確性要求。

表2 日內(nèi)精密度(n=5)Table 2 Intra-day precisions (n=5)

續(xù)表2

2.4.2.2 日間精密度

白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒各取1個(gè)樣品，分別用標(biāo)曲法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，共測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。從表3可見，RSD<3%，日間精密度良好，滿足方法準(zhǔn)確性要求。

表3 日間精密度(n=5)Table 3 Inter-day precisions (n=5)

2.4.3 回收率分析

白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒各取1個(gè)樣品，加入4份不同體積分?jǐn)?shù)乙醇(表4)，分別使用標(biāo)曲法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法對(duì)樣品中酒精度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。白酒的加標(biāo)回收率為94.62%～99.28%；啤酒的加標(biāo)回收率標(biāo)曲法和外標(biāo)法分別為97.81%和100.60%，內(nèi)標(biāo)法為83.73%；葡萄酒加標(biāo)回收率分別為84.67%～97.08%；櫻桃發(fā)酵酒加標(biāo)回收率分別為88.50%～100.25%?？梢妼?duì)于白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒3種方法的加標(biāo)回收率均能滿足定量準(zhǔn)確性要求。

表4 加標(biāo)回收率Table 4 Spiked recoveries

續(xù)表4

2.4.4 定量限和檢出限

將乙醇標(biāo)準(zhǔn)品樣品1.2.3的測(cè)試參數(shù)及1.2.4的數(shù)據(jù)處理?xiàng)l件下得到的譜圖，定量峰乙醇甲基峰信噪比為3時(shí)的濃度作為檢出限，信噪比為10時(shí)的濃度作為定量限[20-21]，該方法的檢出限為0.08%(體積分?jǐn)?shù))，定量限為0.26%(體積分?jǐn)?shù))，可滿足GB/T 17204—2008《飲料酒分類》中規(guī)定的酒精度在0.5%(體積分?jǐn)?shù))以上的酒精飲料酒精度測(cè)定要求。

2.4.5 和國(guó)標(biāo)法對(duì)比分析

用上述建立的1H NMR標(biāo)曲法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》中第四法-數(shù)字密度計(jì)法，分別對(duì)市售4個(gè)白酒、4個(gè)啤酒、1個(gè)葡萄酒和1個(gè)櫻桃發(fā)酵酒樣品酒精度進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品每種方法重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果取平均值，結(jié)果見表5。以國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)，分別以本文所建立的1H NMR標(biāo)曲法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)作線性回歸曲線，線性回歸關(guān)系R2分別為0.999 8、0.999 7和0.999 7。結(jié)果表明，本文所建立的1H NMR法與GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》中第四法-數(shù)字密度計(jì)法測(cè)定結(jié)果誤差在5%以內(nèi)，滿足方法的可行性驗(yàn)證要求。

表5 核磁共振波譜法與國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 單位：%vol

3 結(jié)論

本研究采用60 MHz低場(chǎng)臺(tái)式核磁共振波譜儀，基于1H NMR定量技術(shù)，分別采用標(biāo)曲法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法對(duì)飲料酒的酒精度測(cè)定方法進(jìn)行了研究，選取了具有代表性的飲料酒如白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒做了方法驗(yàn)證，對(duì)測(cè)定方法的線性、精密度、回收率、檢出限、定量限分別做了考察，并與GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》中第四法-數(shù)字密度計(jì)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。

結(jié)果表明，在0.5%～80%的濃度范圍內(nèi)，標(biāo)曲法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法的線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.996 1、0.996 1、0.999 5，說明這3種方法線性關(guān)系良好。分別用3種方法測(cè)定白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒的酒精度，日內(nèi)和日間精密度均<5%。其中，白酒的標(biāo)曲法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法的加標(biāo)回收率分別為94.62%、97.91%和99.28%；啤酒的加標(biāo)回收率分別為97.81%、100.60%和83.73%；葡萄酒的加標(biāo)回收率分別為97.08%、84.67%、87.62%；櫻桃發(fā)酵酒的加標(biāo)回收率分別為88.50%、100.25%和97.13%?？梢妼?duì)于白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發(fā)酵酒，3種方法的加標(biāo)回收率均能滿足定量準(zhǔn)確性要求。該方法的檢出限為0.08%(體積分?jǐn)?shù))，定量限為0.26%(體積分?jǐn)?shù))。本文所建立的1H NMR法與GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》中第四法-數(shù)字密度計(jì)法測(cè)定結(jié)果誤差在5%以內(nèi)，滿足方法的可行性驗(yàn)證要求。可見，基于低場(chǎng)臺(tái)式核磁共振波譜儀建立的1H NMR標(biāo)曲法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法可以用于飲料酒中酒精度的測(cè)定，且相比于GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》中酒精度的測(cè)定方法，樣品無需復(fù)雜前處理、樣品用量少(僅需500 μL)、測(cè)樣時(shí)間短(<5 min)。相對(duì)于高場(chǎng)核磁共振波譜儀(400 MHz)，低場(chǎng)臺(tái)式核磁共振波譜儀體積小、質(zhì)量輕、便于移動(dòng)，適合飲料酒中酒精度的快速和規(guī)?；治鰷y(cè)定。