史 梅綜述， 谷有全審校

卒中是全世界人類死亡和長期殘疾的主要原因，其中缺血性腦卒中是由向腦組織提供氧氣和營養(yǎng)的血管狹窄或閉塞引起的。由于腦組織高速消耗能量，血液供應(yīng)不足導(dǎo)致大腦穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激、興奮性毒性、炎癥、血液-腦脊液屏障的破壞以及外周免疫細(xì)胞向缺血中心區(qū)的滲透[1]。目前，重組人組織型纖溶酶原激活物(rt-PA)靜脈溶栓和血管內(nèi)治療是其優(yōu)選的治療方法。然而，因?yàn)檫@些治療具有時(shí)間窗的限制，并非所有患者都能從中受益。近年來，褪黑素在腦血管疾病領(lǐng)域有了許多突破性的研究，本文將圍繞褪黑素抑制自由基產(chǎn)生和減輕氧化應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、減輕腦水腫及聯(lián)合其他藥物治療腦缺血方面進(jìn)行綜述。

1 褪黑素在腦缺血中的作用

褪黑素在松果體中合成，釋放到血液和腦脊液中以發(fā)揮調(diào)節(jié)作用、控制晝夜節(jié)律，參與多種生理過程，包括情緒行為、血壓調(diào)節(jié)、卵巢生理和成骨細(xì)胞分化[2]。大量研究表明褪黑素與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，包括卒中、創(chuàng)傷性腦損傷、阿爾茨海默病和帕金森氏病等，且人們發(fā)現(xiàn)，血清和腦脊液褪黑素水平與年齡呈負(fù)相關(guān)[3]。

2 褪黑素在腦缺血時(shí)抑制自由基產(chǎn)生和減輕氧化應(yīng)激

成年人的大腦只占總體重的2%，但卻獲得了總心輸出量的15%，消耗了總攝氧量的20%。中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有相對(duì)較低的內(nèi)源性抗氧化水平。氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)是腦組織缺血導(dǎo)致早期損傷的重要組成部分，與在病理?xiàng)l件下由于自由基(Free Radicals，F(xiàn)R)的過度形成而產(chǎn)生的興奮性毒性一起產(chǎn)生氧化和亞硝化應(yīng)激，進(jìn)一步損傷腦組織，造成神經(jīng)功能異常。褪黑素通過非受體介導(dǎo)或增加抗氧化酶的活性和表達(dá)對(duì)活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)、活性氮簇(Reactive Nitrogen Species，RNS，)起到強(qiáng)大的清除作用[4]。此外，羥自由基在腦缺血中加重神經(jīng)毒性，引起DNA損傷、ATP耗竭，褪黑素可以減輕腦組織缺血再灌注后產(chǎn)生的羥自由基依賴性損傷。ROS的產(chǎn)生涉及許多生物過程，NADPH氧化酶(NADPH Oxidases，NOX)被證明是ROS產(chǎn)生的主要催化酶，NOX2和NOX4是缺血性卒中大鼠腦組織ROS產(chǎn)生的主要亞型，可以誘導(dǎo)腦缺血再灌注模型大鼠的神經(jīng)元凋亡和腦損傷，而褪黑素可以降低NOX2、NOX4的表達(dá)，從而降低ROS水平[5]。再者，谷胱甘肽可提高胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性，降低丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，減少大鼠腦組織氧自由基的堆積，在腦缺血條件下，谷胱甘肽的水平降低，給予褪黑素后可以觀察到谷胱甘肽水平顯著恢復(fù)[6]。此外，褪黑素還可以減少引起脂質(zhì)過氧化和DNA損傷的大腦應(yīng)激標(biāo)志物，如MDA以及其他硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(Thiobarbituric Acid Reactive Substances，TBARS)[7]。

3 參與褪黑素對(duì)腦缺血神經(jīng)保護(hù)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

腦缺血啟動(dòng)了很多的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中的每一步都是通過多條途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)的。褪黑素可以通過調(diào)控不同信號(hào)通路來參與腦缺血的病理生理過程。

3.1 褪黑素受體及其激動(dòng)劑 褪黑素受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官。褪黑素受體有2種亞型，分為 MT1 和 MT2 型，這兩種受體均屬于G蛋白耦聯(lián)受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布。褪黑素受體可以快速激活多種信號(hào)級(jí)聯(lián)，隨后觸發(fā)保護(hù)作用，減輕缺血誘導(dǎo)的炎癥、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙。MT1的激活導(dǎo)致多種G蛋白的刺激，抑制環(huán)磷酸腺苷(cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低蛋白激酶A(PKA)活性。同時(shí)，褪黑素受體MT2與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路偶聯(lián)，包括磷脂酰肌醇的產(chǎn)生、腺苷酸環(huán)化酶(Adenyl Cyclase，AC)的抑制和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble Guanylyl Cyclase，sGC)途徑的抑制[8]。近年來，褪黑素受體激動(dòng)劑引起了研究者們的興趣。阿戈美拉汀是褪黑素MT1/MT2受體的激動(dòng)劑，它的抗氧化和抗炎作用類似于褪黑素。Wijitra等[9]首次發(fā)現(xiàn)阿戈美拉汀治療顯著減少了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，降低了促凋亡蛋白Bax和caspase-3的水平，增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，同時(shí)減少了神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，并且發(fā)現(xiàn)阿戈美拉汀顯著增加血紅素加氧酶1(Heme Oygenase-1，HO-1)、抗氧化酶的表達(dá)和SOD的活性，通過激活抗凋亡及抗氧化途徑有效減輕腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷。近期進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)阿戈美拉汀可以通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1途徑減輕永久性腦缺血后的腦損傷[10]。

3.2 鈣離子水平及鈣離子蛋白的調(diào)節(jié) 鈣離子是細(xì)胞內(nèi)最重要的第二信使之一，對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要。褪黑素除了能清除線粒體中的FR和減少FR的形成外，還能有效地防止Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)。在缺血再灌注條件下細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，Ca2+被重排到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，過量的Ca2+聚集在線粒體基質(zhì)中會(huì)擾亂生物能量學(xué)，刺激線粒體產(chǎn)生ROS，并導(dǎo)致線粒體膜通透性增加、功能受損和塌陷。過量的Ca2+也會(huì)激活多種鈣依賴性的酶促蛋白，促進(jìn)細(xì)胞骨架降解和自由基生成，引起細(xì)胞死亡或凋亡[11]。此外，動(dòng)脈粥樣硬化鈣化的原因包括基質(zhì)代謝失調(diào)、礦物質(zhì)沉積、炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，血管鈣化主要由血管平滑肌細(xì)胞介導(dǎo)，褪黑激素通過AMP激活A(yù)MPK/OPA1途徑促進(jìn)線粒體融合或有絲分裂，或通過AMPK/mTOR/ULK1途徑激活自噬，從而保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞免于鈣化[12，13]。Hussain等發(fā)現(xiàn)褪黑素可能通過降低小電導(dǎo)Ca2+激活的K+通道的表達(dá)來改善腦低灌注大鼠的記憶缺陷[14]。

3.3 抗細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，這一過程涉及一系列凋亡相關(guān)因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。揭示神經(jīng)元凋亡的機(jī)制，減少腦缺血后神經(jīng)元的凋亡是非常重要的。作為細(xì)胞的動(dòng)力來源，線粒體在介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡途徑中發(fā)揮重要作用，線粒體的膜通透性受促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族成員的調(diào)節(jié)。當(dāng)腦缺血再灌注發(fā)生時(shí)，Bcl-2表達(dá)減少，促凋亡因子Bax表達(dá)增加，細(xì)胞色素c通過線粒體外膜釋放，參與形成凋亡小體，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。褪黑素通過增強(qiáng)沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(Sirtuin 1，SIRT1)的表達(dá)來誘導(dǎo)Bcl-2的上調(diào)和Bax的減少來保護(hù)神經(jīng)形態(tài)和功能免受破壞，并起到腦保護(hù)作用[16]。褪黑素抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore，MPTP)的開放，減少細(xì)胞色素C、Caspase的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡[17]。近些年，有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡[18]。這些發(fā)現(xiàn)證明了褪黑素通過與凋亡級(jí)聯(lián)相關(guān)的各種機(jī)制發(fā)揮強(qiáng)大的抗凋亡作用。

3.4 PI3K/Akt的調(diào)控 PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡。生存因子激活A(yù)kt，Akt通過磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制凋亡。腫瘤抑制轉(zhuǎn)錄因子p53可介導(dǎo)缺血性卒中后神經(jīng)元損傷[19]，褪黑激素通過PI3K/Akt途徑抑制p53磷酸化，增加神經(jīng)元存活。有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在激酶催化區(qū)域Thr308位點(diǎn)上能更大程度的激活PI3K/Akt信號(hào)通路[20]。此外，γ-烯醇化酶，也稱為神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-Specific Enolase，NSE)，是直接評(píng)估神經(jīng)元損傷和修復(fù)程度的重要分子。NSE通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路來控制神經(jīng)元存活、分化和軸突再生，而褪黑素可以增強(qiáng)NSE的神經(jīng)營養(yǎng)活性，使NSE通過激活下游靶點(diǎn)(PI3K/Akt)從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[21]。

3.5 基質(zhì)金屬蛋白酶 基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMP)是細(xì)胞外基質(zhì)重塑、組織形態(tài)發(fā)生和傷口愈合所必需的物質(zhì)。然而，在再灌注期間，金屬蛋白酶水平的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的破壞和炎癥。腦周細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)MMP-9的主要來源。褪黑素通過內(nèi)源性MMP抑制劑和纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)的雙重調(diào)節(jié)，有效抑制缺血后MMP‐9的激活和表達(dá)。在大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校^長給藥時(shí)間及較高劑量的褪黑素對(duì)MMP-9的活性和表達(dá)都有明顯的抑制作用[22]。此外，褪黑素增強(qiáng)血腦屏障的完整性，可能是通過減弱IL-1β調(diào)節(jié)周細(xì)胞NOTCH3/NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[23]。

3.6 SIRT1 Sirtuins是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinu-cleotide，NAD+)依賴性組蛋白和非組蛋白去乙?；?，由7個(gè)成員組成(SIRT1至SIRT7)。2014年，Carloni[24]首次證明，褪黑素在缺氧缺血后保留了神經(jīng)細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)。褪黑素誘導(dǎo)的sirt1激活通過改善p53和Nf-κb的乙?；?，并促進(jìn)腦中的抗凋亡信號(hào)，從而起到腦保護(hù)作用。另外，小膠質(zhì)細(xì)胞是缺氧損傷的早期反應(yīng)者，能嚴(yán)重影響神經(jīng)元的功能，在動(dòng)物模型中，褪黑素可在缺氧條件下抑制小膠質(zhì)細(xì)胞促炎極化，這種作用最近被證明依賴于SIRT1及其下游的AMPK途徑[25]。除了缺血性腦損傷，在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中，褪黑素通過受體依賴機(jī)制改善神經(jīng)功能評(píng)分，減輕腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這一過程是通過SIRT1/NF-κB信號(hào)通路增加Bcl-2的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[26]。

3.7 SIRT3 最近的研究數(shù)據(jù)表明，除SIRT1外，SIRT3也與缺血性卒中相關(guān)，當(dāng)腦組織缺血缺氧發(fā)生時(shí)，腦中SIRT3表達(dá)下調(diào)[27]。國內(nèi)一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，短暫大腦中動(dòng)脈閉塞模型中，褪黑素可以通過激活SIRT3信號(hào)通路，促進(jìn)SIRT3的表達(dá)，減輕腦缺血再灌注損傷[28]。另外，褪黑激素可能通過STAT3途徑調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向抗炎方向趨化來預(yù)防缺血性卒中[29]。

4 褪黑素與腦水腫

腦水腫是腦梗死致死的重要原因之一。缺血性損傷后，由于細(xì)胞內(nèi)積累的溶質(zhì)如鈉、氯化物等引起的細(xì)胞腫脹，以及細(xì)胞外含水量的升高，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，從而導(dǎo)致腦血流量的減少，進(jìn)一步增加了缺血、顱內(nèi)內(nèi)容物突出、腦結(jié)構(gòu)損傷、神經(jīng)損傷甚至死亡。褪黑素可以改變水腫相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄活性，對(duì)缺血缺氧后腦組織具有保護(hù)作用，而水腫相關(guān)蛋白如水通道蛋白(Aquaporin 4，AQP4)、閉鎖小帶蛋白1(Zonula Occludens 1，ZO-1)可能間接促成了褪黑激素的水腫保護(hù)機(jī)制[30]。

5 褪黑素聯(lián)合其他藥物或方法治療腦缺血

褪黑素在許多疾病中的治療價(jià)值是眾所周知的，褪黑激素與其他藥物結(jié)合，可能會(huì)得到1+1大于2的結(jié)果，給卒中治療提供新思路。

5.1 聯(lián)合地塞米松 褪黑素和地塞米松聯(lián)合治療在減輕腦水腫、避免星形膠質(zhì)細(xì)胞浸潤、抑制凋亡和金屬蛋白酶以及減少誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)方面提供了比單一藥物更大的有益效果[31]。

5.2 聯(lián)合美金剛 非競爭性NMDA受體阻滯劑美金剛，一種已知的神經(jīng)保護(hù)劑，褪黑素和美金剛單獨(dú)或聯(lián)合使用可明顯減輕缺血損傷。在應(yīng)激激酶p21、p38/MAPK和SAPK/JNK1/2通路失活中表現(xiàn)出減輕腦組織損傷的協(xié)同作用，特別是減少腦細(xì)胞的凋亡[32]。

5.3 聯(lián)合硒 硒具有清除FR的能力，通過參與抗氧化防御和氧化還原平衡調(diào)節(jié)大腦功能，可通過激活抗氧化酶的活性，減輕脂質(zhì)過氧化作用保護(hù)腦組織。Ahmad等[33]在短暫性局灶性腦缺血模型中同時(shí)給予亞硒酸鈉和褪黑素，通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，抗細(xì)胞凋亡來改善神經(jīng)功能。

5.4 聯(lián)合針刺 針刺具有抑制炎癥反應(yīng)、減輕腦組織損傷和水腫、促進(jìn)神經(jīng)再生的作用，國內(nèi)一項(xiàng)研究[34]證明了在大鼠短暫性局灶性腦缺血模型中，褪黑素結(jié)合電針(刺激強(qiáng)度0.5 mA，刺激頻率2 Hz)可以顯著改善神經(jīng)功能，包括減少梗死體積、腦部炎癥和TUNEL陽性細(xì)胞。

5.5 聯(lián)合黃體酮 黃體酮參與卒中的病理生理過程，包括水腫形成、神經(jīng)毒性、血腦屏障破壞、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和線粒體功能。Hedayatpour等[35]發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血再灌注模型中，聯(lián)合給予黃體酮和褪黑素可以增加錐體神經(jīng)元的存活并減少海馬CA1區(qū)的抗精神病因子，從而減少神經(jīng)元死亡來增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶等執(zhí)行功能。根據(jù)這一研究結(jié)果，黃體酮和褪黑素的聯(lián)合可能是治療短暫性全腦缺血的潛在靶點(diǎn)之一。

5.6 聯(lián)合氧療 常壓氧具有神經(jīng)保護(hù)作用，可增加腦組織中的氧分壓，改善有氧代謝，減少對(duì)血腦屏障(Blood-Brain Barrier，BBB) 的損傷，并減少急性缺血性卒中動(dòng)物模型的缺血性腦損傷和梗死體積。常壓氧和褪黑素聯(lián)合治療可以通過減少梗死體積、減輕腦組織腫脹、減少細(xì)胞凋亡顯著改善缺血核心和半暗帶的腦血流量，從而降低腦缺血的神經(jīng)缺損功能評(píng)分[36]。

高壓氧治療改善缺血相關(guān)器官功能障礙的機(jī)制可能主要是通過使缺血區(qū)氧壓升高(即短暫的高氧)、增加血管壁通透性和增加缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxic Inducible Factor，HIF-1α)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(Sromal-cell Derived Factor，SDF-1α)的生成，從而促進(jìn)了缺血區(qū)的血管生成和增加循環(huán)血量[37]。最近國內(nèi)一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素或高壓氧單獨(dú)治療均可以改善急性缺血性腦卒中模型大鼠的預(yù)后并縮小了梗死面積，并且進(jìn)一步證實(shí)褪黑素和高壓氧聯(lián)合治療在改善預(yù)后方面優(yōu)于任何一種治療方式單獨(dú)治療[38]。

5.7 聯(lián)合抗癲癇藥物 托吡酯是一種耐受性良好的抗癲癇藥物，它通過阻斷AMPA/KA受體和發(fā)育過程中使用依賴的鈉離子通道而起到神經(jīng)保護(hù)作用，已發(fā)現(xiàn)在新生兒缺氧缺血性腦損傷中起神經(jīng)保護(hù)作用。褪黑素和托吡酯是兩種作用于不同缺氧缺血階段的藥物，無論單獨(dú)或聯(lián)合使用，都能顯著降低新生兒缺氧缺血模型的梗死面積百分比和凋亡細(xì)胞數(shù)[39]。

6 總結(jié)及前景

綜上所述，褪黑素作為一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑，在腦缺血性損傷的中起到神經(jīng)保護(hù)作用，通過各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抗氧化應(yīng)激、減少氧自由基、減少細(xì)胞凋亡。它也是參與神經(jīng)元組織損傷的多個(gè)信號(hào)通路的多功能調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和神經(jīng)再生，減輕腦水腫，單獨(dú)或與其他神經(jīng)保護(hù)藥物聯(lián)合治療促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。目前還沒有研究表明褪黑激素具有嚴(yán)重的毒性。以上特點(diǎn)使褪黑素成為一種潛在的治療腦缺血性損傷的藥物。不足之處在于褪黑素對(duì)缺血性腦損傷的作用在動(dòng)物模型上的被證實(shí)，但仍缺乏相關(guān)的臨床研究。希望隨著科技和醫(yī)療的發(fā)展，褪黑素可以逐漸在臨床應(yīng)用上取得肯定的研究，在未來腦血管疾病，尤其在缺血性腦卒中中提供新的治療靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)其實(shí)用價(jià)值。此外，褪黑素在缺血性腦卒中中的應(yīng)用時(shí)機(jī)及劑量也需要進(jìn)一步研究。