陳紹文

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 湖北 武漢 430065)

腦溢血(ICH)指原發(fā)性腦實(shí)質(zhì)出血(SICH)，約占所有卒中的10%-15%，發(fā)病率約為0.01-0.03%，即每100000人中可能有10-30人發(fā)生腦溢血，發(fā)病率非常高[1]。在所有卒中類型中，腦溢血的死亡率也最高，30天死亡率達(dá)30%-50%。腦出血的長期預(yù)后也不容樂觀，約有75%的腦出血患者1年后留下嚴(yán)重的殘疾或死亡，可見腦出血具有高發(fā)病率，高致殘率，高死亡率，其危害十分大，給病人帶來沉重的負(fù)擔(dān)[2]。{Keep, 2012 #4;Asch, 2010 #5}因此探究腦溢血的發(fā)病機(jī)制和尋求干預(yù)此疾病的藥物顯得尤為重要。現(xiàn)有老中醫(yī)慣用大黃治療腦溢血效果明顯，同時(shí)周德融[3]對2000年以來采用活血化瘀法為主治療腦出血急性期的臨床報(bào)道38篇統(tǒng)計(jì)，其中大黃的使用頻率最高。因此開發(fā)大黃，研究大黃干預(yù)腦溢血的作用，將為腦溢血病人帶來新的希望。

大黃藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是在中藥組方中應(yīng)用范圍最大、使用頻率最高的為數(shù)不多的幾種重要中藥之一，也已作為一種世界性藥物載人19個(gè)國家的藥典中。現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究表明，大黃能顯著改善危重癥患者各項(xiàng)凝血功能指標(biāo)，糾正凝血功能紊亂，改善凝血功能。目前研究表明大黃其活血化瘀作用可能是通過調(diào)節(jié)維持血管形態(tài)的NO,ET-1以及參與血液微循環(huán)的PGI2 ,VWF的水平而達(dá)到的。[5]但目前對于大黃治療腦溢血的機(jī)制尚不清楚，對于大黃治療腦溢血的機(jī)制的研究缺乏整體系統(tǒng)的方法。

因此，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，從整體出發(fā)，構(gòu)建不同層次復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，分析、預(yù)測腦溢血發(fā)病機(jī)制和大黃的治療作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)大黃干預(yù)腦溢血的作用靶點(diǎn)和信號通路，為探究大黃治療腦溢血的機(jī)制尋求思路和方向，從而擴(kuò)大其藥用范圍，指導(dǎo)中藥大黃的臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 腦溢血相關(guān)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的收集

應(yīng)用DisGeNET在線數(shù)據(jù)庫提供的多種信息，包括17074個(gè)基因與20370種疾病、失調(diào)、性狀及臨床或異常人類表型之間的561119個(gè)基因-疾病關(guān)聯(lián)(GDA)，及83002個(gè)SNP與9169個(gè)疾病和表型之間的135588個(gè)變異-疾病關(guān)聯(lián)(VDA)。以“cerebral hemorrhage”為關(guān)鍵詞在此數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，收集與腦溢血相關(guān)的基因,。

1.2 腦溢血相關(guān)蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING 10.0數(shù)據(jù)庫提供的蛋白質(zhì)之間直接和間接相互作用的排序信息，將TTD中收集到的與腦溢血相關(guān)的蛋白質(zhì)名稱輸入，進(jìn)行檢索，選取得分高于0.7的高置信度蛋白質(zhì)互作信息，得到腦溢血相關(guān)蛋白質(zhì)的蛋白互作數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)再導(dǎo)入生物信息分析軟件Cytoscape 3.7.1 ，構(gòu)建腦溢血相關(guān)的蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)可視化瀏覽和分析。STRING 10.0數(shù)據(jù)庫是一個(gè)儲(chǔ)存已知的和預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，并對每一對蛋白互作信息進(jìn)行評分，得分越高則說明蛋白質(zhì)相互作用信息的置信度越高；Cytoscape是一種開源的生物信息分析軟件，用于構(gòu)建蛋白質(zhì)、基因、藥物等相互作用構(gòu)成的分子交互網(wǎng)絡(luò)[3]。

1.3 大黃活性成分的收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析(TCMSP)平臺(tái)，檢索大黃的所有化學(xué)成分，以口服利用度≥30%、類藥性 ≥0.18 作為參數(shù)，篩選活性成分，導(dǎo)出這些活性成分的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。

1.4 大黃潛在靶蛋白的預(yù)測

將上述所得的活性成分三維化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分別上傳至SwissTargetPrediction平臺(tái)進(jìn)行預(yù)測，得到化學(xué)小分子潛在靶點(diǎn)和生物活性結(jié)果。鑒于所得的藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)存在命名不規(guī)范的問題，應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫中的，獲得活性成分潛在靶蛋白的信息。該信息導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.7.1中，構(gòu)建活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)合并

利用軟件Cytoscape 3.7.1中，將腦溢血的PPI網(wǎng)絡(luò)與大黃活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，構(gòu)建大黃活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以便系統(tǒng)分析大黃治療腦溢血的潛在作用靶點(diǎn)。

1.6 靶點(diǎn)-通路富集分析

為說明大黃治療腦溢血的潛在作用靶點(diǎn)在信號通路中的作用，對大黃活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的各蛋白在David v 6.7數(shù)據(jù)庫[6-8]平臺(tái)上進(jìn)行KEGG的生物通路富集分析，所得的KEGG通路富集分析的信號通路信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 腦溢血相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)

在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中，檢索到66個(gè)與腦溢血相關(guān)的一級蛋白，經(jīng)STRING 10.0數(shù)據(jù)庫檢索，得到60個(gè)與一級蛋白互作的腦溢血相關(guān)二級蛋白。這些一級蛋白、二級蛋白信息經(jīng)Cytoscape 3.7.1軟件被構(gòu)建成腦溢血相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)，包含60個(gè)腦溢血相關(guān)蛋白質(zhì)和155條腦溢血相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系。

2.2 大黃活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

在TCMSP平臺(tái)檢索出的大黃化學(xué)成分中，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 作為參數(shù)進(jìn)行篩選，得到16個(gè)活性成分及其三維化學(xué)結(jié)構(gòu)基本信息。這些活性成分的基本信息具體見表2，相應(yīng)的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)信息經(jīng)SwissTargetPrediction平臺(tái)、UniProt數(shù)據(jù)庫及Cytoscape 3.7.1軟件擬構(gòu)，得到大黃活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),包括240條活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)聯(lián)系、16個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和119個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)。

2.3 與腦溢血相關(guān)的大黃活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

腦溢血相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)與大黃活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行合并，刪除其中沒有交集的蛋白，得到直觀的大黃活性成分治療腦溢血的潛在靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，腦溢血相關(guān)的大黃活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)Degree的平均值為2.8，有7個(gè)靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的Degree≥2，提示這些蛋白質(zhì)很可能是大黃活性成分發(fā)揮作用的潛在靶點(diǎn)。

2.4 KEGG通路富集分析

應(yīng)用DAVID平臺(tái)，對腦溢血相關(guān)的大黃活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中25個(gè)靶點(diǎn)蛋白在信號通路中的作用進(jìn)行分析研究，得到29條信號通路，其中P<0.01的信號通路有15條涉及人類疾病、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程與組織系統(tǒng)信號通路。其中，人類疾病信號通路為10條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有3條；細(xì)胞過程信號通路有1條，免疫系統(tǒng)信號通路為1條。

3 討論

腦溢血相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)包含了60個(gè)腦溢血相關(guān)蛋白質(zhì)和155條腦溢血相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系，說明腦溢血是一種多蛋白相互作用的復(fù)雜疾病。在大黃活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，有240條活性成分-預(yù)測靶點(diǎn)聯(lián)系、16個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和119個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，可知一種化學(xué)成分可作用多個(gè)靶點(diǎn)，一個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)也受多種化學(xué)成分作用，充分體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的特色。由圖3可知，大黃治療腦溢血的潛在活性成分有11個(gè)，潛靶點(diǎn)有25 個(gè)，即ESR1、MMP2、CASP3、MMP9、IL6、IL1B、APP、F7、VEGFA、BCL2、MMP3、PTGS2、CRP、TIMP2、F10、SERPINC1、APOB、PLAT、APOE、FLT1、HMOX1、BAX、PRKCQ、BCL2L1、ADD1，說明大黃干預(yù)腦溢血是通過多成分，多靶點(diǎn)來發(fā)揮作用的。其中雌激素受體-1(ESR1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)、人半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)、白介素-6(IL6)、白細(xì)胞介素-1β(IL1B)、β-淀粉樣前體蛋白(APP)、的degree值大于2，說明這些基因與腦溢血的發(fā)作有很大的相關(guān)性。圖四為與腦溢血相關(guān)的大黃潛在靶點(diǎn)富集通路，得到29 條通路，其中P<0.01的有15條，表明大黃干預(yù)腦溢血可能是參與了這些通路的調(diào)控。其中基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 ( MMP9)是腦內(nèi)最重要的基質(zhì)金屬蛋白酶。相關(guān)研究證實(shí)，其在腦卒中發(fā)病后表達(dá)量明顯升高，能夠通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，進(jìn)而破壞血腦屏障，引發(fā)并加重腦水腫的發(fā)生。[6],[7]IL-6是具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，在炎性反應(yīng)、抗感染及損傷等過程中發(fā)揮多種生物學(xué)作用，具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)B細(xì)胞的增生分化和抗體分泌;誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)，如:PDGF，F(xiàn)BGF，MCSF等;其它作用:極性相反應(yīng)、抗瘤效應(yīng)等。有報(bào)道它與血管性疾病及動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展密切相關(guān)，其作用的重要機(jī)制是IL-6直接促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖以及單核細(xì)胞趨化因子1的釋放。[8]而ESR1的遺傳多態(tài)性可能有助于腦溢血的發(fā)展，尤其是女性腦溢血患者。并且腦內(nèi)ESR1的多態(tài)性可作為腦梗死的潛在生物標(biāo)志。[9]同樣有研究稱CASP3可能成為判斷腦溢血出現(xiàn)或著腦溢血嚴(yán)厲程度的潛在生物標(biāo)志。綜上，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測了大黃治療腦溢血可能的16個(gè)化合物及25個(gè)干預(yù)腦溢血的潛在作用靶點(diǎn)，初步闡述了大黃干預(yù)腦溢血的可能通路，為進(jìn)一步開發(fā)大黃對于腦溢血的治療提供參考。