楊珠芳 李 靜

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是發(fā)達國家 60 歲以上人群不可逆視力喪失最常見的眼病之一[1]，全世界患病率約為 8.69%，晚期病變率為1%～3%[2]。AMD 發(fā)病機制涉及多種因素，目前尚無有效干預(yù)措施來減緩或防止早期 AMD發(fā)展為致盲新生血管(MNV)或地圖樣萎縮(GA)[3]。脈絡(luò)膜毛細血管層(CC)主要生物學(xué)功能是向視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)層和視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，是黃斑中央凹無血管區(qū)(FAZ)代謝交換的唯一途徑,并負責(zé)清除和回收來自視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層的廢物[4]。因此，脈絡(luò)膜的結(jié)構(gòu)和功能異常在 AMD 病因?qū)W中具有重要的地位[5]。本文就 AMD 時脈絡(luò)膜的組織病理、基因表達、炎癥、血流變化作一綜述，旨在提供新的研究入手點和思路。

1 脈絡(luò)膜解剖和組織病理

位于RPE和Bruch膜正后方的脈絡(luò)膜供給視網(wǎng)膜約60%的氧氣和 75%的營養(yǎng)[6]，尤其是黃斑中央凹 250～600 μm 無血管區(qū)，以維持光感受器的高代謝活動[7]。脈絡(luò)膜最內(nèi)層是CC[8]，與其后的 Sattler 層、Haller 層共同構(gòu)成脈絡(luò)膜循環(huán)的血管床[9]。中/小血管所在 Sattler 層在 CC 形成離散的六邊形小葉[9]，大血管所在的 Haller 層為脈絡(luò)膜提供主要的動脈供應(yīng)和靜脈引流。視網(wǎng)膜中央的 CC 呈蜂窩狀或鵝卵石樣，往周圍赤道區(qū)域過渡為由毛細血管間柱分隔、縱行排列的管狀毛細血管[6]。CC 構(gòu)成 RPE/Bruch膜/CC 復(fù)合物，是外層視網(wǎng)膜的主要組成結(jié)構(gòu)[10]。電鏡下觀察可見CC通過開窗、小泡、質(zhì)膜凹陷、跨內(nèi)皮細胞通道(TEC)和囊泡-液泡細胞器(VVO)等轉(zhuǎn)運形式向 RPE 和光感受器細胞輸送并傳遞氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，同時清除代謝廢物[11]。健康 CC 表達多種免疫抗原和分子，如：人白細胞抗原 I 類(HLA)、細胞內(nèi)黏附分子 1(ICAM-1)、CA4 蛋白等，是體內(nèi)多種免疫相關(guān)疾病免疫反應(yīng)的作用靶點。血管周圍脈絡(luò)膜基質(zhì)的組成主要包括神經(jīng)元及其突起、黑素細胞、成纖維細胞、非血管平滑肌細胞、白細胞、肥大細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞、膠原蛋白、彈性蛋白和其他細胞外基質(zhì)成分[12]。

AMD 時以上脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。研究表明：毛細血管間柱是Drusen沉積的初始位置，CC 小葉形成的分水嶺區(qū)域特別容易受到缺氧和網(wǎng)狀假玻璃疣的影響[10]。失去功能的 CC 稱為“幽靈血管”，在早期 AMD (AREDS 2 級和 3 級)中，隨著幽靈血管數(shù)量增加，有效 CC 密度降低[13]。CC 窗孔消失、細胞質(zhì)增厚、細胞核異位，內(nèi)皮細胞喪失極性。這些可能是 AMD 發(fā)生和啟動的關(guān)鍵[14]。CC 發(fā)生病理改變后，開窗和小泡這兩個主要的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)功能障礙，導(dǎo)致 AMD Drusen 沉積、營養(yǎng)物質(zhì)運輸受阻[11]。生理條件下，水、氨基酸、糖類、脂肪酸、小分子激素成分通過開窗的方式轉(zhuǎn)運，小泡上的多種受體也可在 EC 中結(jié)合和攜帶低密度脂蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等配體。AMD 時，脈絡(luò)膜的新生血管缺乏開窗系統(tǒng)、缺失小泡。而 GA 及高危基因型開窗的減少更為顯著，小泡反而增加，并且后者的開窗缺乏隔膜發(fā)生滲漏，血清蛋白外滲可能通過開放TEC和VVO運輸途徑，這可能解釋了 AMD 脈絡(luò)膜中豐富的補體成分和 C 反應(yīng)蛋白(CRP)等血清蛋白的存在。RPE 來源的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)促進開窗結(jié)構(gòu)形成，而 GA 的 RPE 丟失，MNV 的 VEGF 受體與之結(jié)合，因此 AMD 中開窗整體減少可能是由于 VEGF 刺激作用降低所導(dǎo)致的[11]。

2 基因

2.1 脈絡(luò)膜基因的差異表達AMD的脈絡(luò)膜存在差異表達基因(DEGs)?，F(xiàn)已鑒定出 353 個 DEGs，其中 181 個基因在 AMD 患者 RPE/脈絡(luò)膜中表達下調(diào)，172 個基因表達上調(diào)[7]。另一個研究發(fā)現(xiàn)，AMD全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)與基因表達數(shù)量性狀基因座(eQTL)共定位只在 RPE/脈絡(luò)膜中，而不在視網(wǎng)膜中[15]。脈絡(luò)膜動脈、靜脈和 CC 內(nèi)皮細胞顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組，富集最多的基因是SEMA3G、HEY1(位于動脈)、CA4、 PLVAP(位于 CC)和 DARC(位于靜脈)[16]。

脈絡(luò)膜黑素細胞擁有100個DEGs，包括一系列CC趨化因子配體(CCL)和CXC趨化因子配體(CXCL)細胞因子以及細胞-細胞和細胞基質(zhì)黏附的介質(zhì)， 如ICAM-1、細胞緊密連接蛋白 1(CLDN1)、結(jié)締組織生長因子 3(CCN3)和整合素基因(ITGA1)，發(fā)揮控制炎癥途徑、免疫細胞運輸、細胞-細胞黏附、血管生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換的作用[17]。DEGs 之間的聯(lián)系值得進一步研究，其上下游的分子過程有助于全面了解脈絡(luò)膜在 AMD 中的發(fā)病機制。

2.2 基因表達對脈絡(luò)膜影響CC 隨著年齡的增長，特異性差異表達編碼使得促炎癥轉(zhuǎn)錄因子和白細胞跨內(nèi)皮細胞遷移黏附蛋白的基因富集，如 ICAM-1[18]。氧化應(yīng)激促進 AMD 脈絡(luò)膜核DNA 和線粒體 DNA 損傷，從而引發(fā) RPE/Bruch膜/CC 復(fù)合體的慢性炎癥[6]。單細胞 RNA 測序(RNA- seq)研究報道，AMD 時 CC 中富集多種 DEGs，如補體負相調(diào)節(jié)基因(CFH)、細胞周期調(diào)節(jié)基因(RGCC)、早期生長反應(yīng)蛋白 1 (EGR1)和激活轉(zhuǎn)錄因子 3 (ATF3)等[16]。最顯著的相關(guān)遺傳風(fēng)險因素之一是 CFH 基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)導(dǎo)致第9 外顯子 1277 位 T 堿基突變?yōu)?C 堿基，使 CFH 蛋白 402 位酪氨酸變?yōu)榻M氨酸(Y402H)，從而影響 CFH 與硫酸乙酰肝素蛋白多糖的結(jié)合，對補體系統(tǒng)激活的抑制效應(yīng)減弱[10,19-21]。另外，Y402H 變異發(fā)生的 CCP7 區(qū)域是與促炎癥相關(guān)單體C 反應(yīng)蛋白(mCRP)相互作用的兩個 CCP 區(qū)域之一，因此 mCRP 與突變型 CFH的結(jié)合親和力比 mCRP 與野生型 CFH低45%。純合子高危 CFH (Y402H)等位基因眼的 CC 和 Bruch膜內(nèi) mCRP 升高，脈絡(luò)膜內(nèi)皮細胞遷移率和通透性增高[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，AMD 和高危 CFH 基因型患者中膜攻擊復(fù)合物(MAC)在 CC 上的沉積比正常衰老更顯著[23]。MAC 上調(diào)并激活 RGCC 來增加炎癥基因的表達，導(dǎo)致類似動脈粥樣硬化的血管功能障礙，最后誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡和損傷[16,24]。

CFH 位點遺傳變異除了CFH，還包括補體因子 H 相關(guān)基因(CFHR1-5)，研究表明，對 AMD 具有保護作用的低頻 CFHR2 和 CFHR5 基因變異導(dǎo)致體循環(huán)補體因子 H 相關(guān)蛋白 FHR-2 和 FHR-5 濃度降低，并在 CC 和Drusen中檢測到[25]，使得下游靶基因和通路出現(xiàn)功能障礙。缺氧誘導(dǎo)因子 1(HIF-1)可導(dǎo)致全身 FHR-4 水平升高并積聚在 CC、Bruch 膜和Drusen中，其與調(diào)節(jié)因子H(FH)及其選擇性剪接變異因子 H 樣蛋白 1(FHL-1)競爭結(jié)合 C3b，阻止 FI 介導(dǎo)的 C3b 裂解， 介入補體途徑[26]。脈絡(luò)膜和 RPE 中缺乏免疫陽性細胞，CC 和脈絡(luò)膜上FHR蛋白的定位提示其來自體循環(huán)，通過 CC 開窗進入脈絡(luò)膜基質(zhì)，并擴散到 Bruch 膜和Drusen，改變 CC 和 Bruch膜中 FH 和 FHR 的微妙平衡，增加AMD發(fā)病風(fēng)險[25]。研究報道，脈絡(luò)膜中 CRP 水平與血清水平相關(guān)，而 MAC 水平與循環(huán)水平無關(guān)[27]。因此，基因表達影響全身 FHR 蛋白，從而關(guān)聯(lián) AMD 局部蛋白濃度的改變可能是 AMD 的發(fā)病機制之一。

3 炎癥

CC 在 AMD 早期就發(fā)生補體激活，MAC 的損傷導(dǎo)致脈絡(luò)膜毛細血管內(nèi)皮細胞(CECs)死亡[28]。補體系統(tǒng)包括經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑，受到膜抑制蛋白，如CD59、CD46、CD55、D35，和補體因子 H (CFH)、補體因子 I (CFI) 等補體抑制劑的嚴格調(diào)控[12]。補體替代途徑是 AMD 的主要途徑，C3 轉(zhuǎn)化酶與另外的 C3b 分子的組合產(chǎn)生 C5 轉(zhuǎn)化酶，裂解 C5 為 C5a 和 C5b，C5b 募集 C6、 C7、C8和C9，形成 MAC[29]，MAC 主要沉積在 CC，在細胞膜上形成通道導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的浸潤性損傷、溶解和死亡，最終造成 CC 的脫落。有研究證實：位于CC 內(nèi)側(cè)的 Bruch 膜在 AMD 發(fā)病早期即發(fā)生彌漫性增厚，缺氧加重；而位于 CC 外側(cè)的脈絡(luò)膜在Druse形成之前就顯示出了高水平的補體活性[30-31]；MAC 易在CC 積累，但具體的解剖學(xué)和分子特性尚不清楚[32]。

以往認為 AMD 補體激活僅限于脈絡(luò)膜 Bruch膜一側(cè)[17]，但研究表明，CC的補體激活每產(chǎn)生一個 MAC 就釋放一個 C5a 過敏性毒素分子，C5a 與膜上特定受體相互作用能穿過Bruch膜與 RPE，從而在視網(wǎng)膜中引發(fā)廣泛炎癥反應(yīng)[17]：促進 RPE高表達 VEGF、上調(diào) ICAM-1以及誘導(dǎo)白細胞的募集和激活[23]。VEGF 又通過結(jié)合VEGFR-1 和 VEGFR-2 激活 PI3K 和 MAPK 途徑，促進細胞存活、遷移和增殖[33]， 導(dǎo)致異常新生血管增生以糾正相對缺血的狀態(tài)。研究顯示，CC 是唯一表達ICAM-1 的內(nèi)皮細胞毛細血管系統(tǒng)[8]，ICAM-1 誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒，導(dǎo)致血管通透性增加，介導(dǎo)肥大細胞浸潤[34]；ICAM-1 募集循環(huán)單核細胞和中性粒細胞、MHC I 類蛋白向適應(yīng)性免疫提呈自身抗原[10,20-21]。所有 AMD 脈絡(luò)膜中觀察到肥大細胞數(shù)量增加，GA中肥大細胞在CC和Bruch膜附近聚集,肥大細胞脫顆粒過程中釋放的類胰蛋白酶在 RPE 萎縮之前與Bruch膜結(jié)合。類胰蛋白酶激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可降解Bruch膜中的細胞外基質(zhì)和基底膜成分,導(dǎo)致 AMD 脈絡(luò)膜變薄[35-37]。mCRP 作為組織內(nèi)炎癥觸發(fā)器在疾病發(fā)作前就在 CC 累積。AMD 早期，mCRP 可能結(jié)合已經(jīng)死亡的 CECs 來放大現(xiàn)有的炎癥信號,加劇炎癥[12]。

AMD的危險因素眾多，年齡是最主要的危險因素[6,38]。研究發(fā)現(xiàn)，老齡小鼠脈絡(luò)膜動脈沉積了腦血管相關(guān)的β淀粉樣蛋白和磷酸化 Tau 蛋白，可導(dǎo)致脈絡(luò)膜血管的破壞，使 CC 變薄，從而破壞視網(wǎng)膜外灌注[8]。衰老增加猴脈絡(luò)膜CECs對補體損傷的敏感性，表現(xiàn)出更高 Rho GTP 酶活性，加重補體損傷;抑制 Rho 活性可防止補體誘導(dǎo)衰老CECs的裂解[39]。所以，在 AMD 期間，CC、基底膜和間質(zhì)的環(huán)境積聚了炎癥分子(MAC、CRP 和其他補體成分)，CC 甚至在 AMD 早期就死亡或功能失調(diào)。CC 的丟失可能加速Drusen 形成，當(dāng)超過脈絡(luò)膜運輸系統(tǒng)負荷， 營養(yǎng)缺乏、新生血管血清成分泄漏和瘢痕形成，最終導(dǎo)致光感受器/RPE/Bruch膜/CC復(fù)合物功能的破壞[40]。

4 血流

4.1 AMD時CC 血流改變

4.1.1 干性 AMD時CC 改變GA的特征是外層視網(wǎng)膜丟失，包括光感受器/RPE變性、CC 變薄，定義為“完全 RPE 和視網(wǎng)膜外萎縮(cRORA)”[41]，是 AMD 的晚期形式之一。OCTA這項新型的無創(chuàng)、深度選擇性成像工具使得 CC 可視化[42]。CC 改變已經(jīng)被證明超越萎縮的界限，且 CC 退化先于 GA 的發(fā)展[43]。具體來說， GA 病變邊緣內(nèi)外均有明顯的CC 改變:OCTA檢查結(jié)果顯示 GA 邊緣及邊緣內(nèi)區(qū)域CC 血流密度損害較邊緣外區(qū)域更明顯， 中心凹受累者更為嚴重[44]；而 GA 邊緣外觀察到不同程度的 CC血液密度，并在對側(cè)也是 GA 病變包括中心凹保留眼中觀察到對稱CC 血流損害[45]。單眼 GA/對眼MNV 患者中，GA 的發(fā)展主要是由于脈絡(luò)膜變??；雙側(cè) GA 患者中，GA 的發(fā)展取決于早期的 Müller 細胞改變[46]，GA 明顯的邊界可能是由于 Müller 細胞的大量保護反應(yīng)來支持組織逐漸衰退[47]。研究表明，CC、Sattler 層、Haller 層以及整個脈絡(luò)膜層的血管密度均降低、基質(zhì)組織和血管比率低于健康組，干性 AMD 患者表現(xiàn)出明顯的脈絡(luò)膜血管耗竭和纖維替代，提示脈絡(luò)膜血流可能在干性 AMD 發(fā)病機制和進展中起重要作用[48]。OCTA檢查結(jié)果顯示，GA邊界內(nèi)區(qū)域存在血流空隙， 大約 1 年該區(qū)域進展為 GA 的概率將增加約 33%，提示 CC 血流損傷不僅可以預(yù)測 GA 病變的擴大，而且可以預(yù)測 GA 病變速率、位置和方向[49]，CC 損傷可被認為是 GA 進展的一個新的危險因素和一個生物標志物[50]。干性 AMD時CC 血流密度降低、血流量減少在 GA 區(qū)域最顯著，具體 GA 血管的病理生理改變及其發(fā)生發(fā)展仍需進一步研究。

4.1.2 濕性 AMD時CC改變MNV 是 AMD 另外一種晚期形式，是濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(nAMD) 病理基礎(chǔ)，較 GA 進展迅速，表現(xiàn)為中央暗點和中心視力突然喪失。CC 損傷超出MNV 的邊界,這種損傷在最靠近病變的區(qū)域最明顯。CC 血液流動空隙百分比(FD%)在距 MNV 邊界 500 μm 的“旁環(huán)”附近最高，距 MNV 邊界 1000 μm 的“周圍環(huán)”減少，兩者 FD%均高于正常對照組[51-52]。MNV 病變面積與血液流動空隙呈正相關(guān)，nAMD CC 血流缺陷明顯大于年齡相似的正常受試者，表明脈絡(luò)膜低灌注可能在 nAMD 發(fā)病機制中起一定作用[53]。OCTA 圖像顯示，MNV 病灶周圍存在低血流信號暗暈(DH)，距 DH 的 500 μm 界定為環(huán) 1，距 DH 邊界 1000 μm 界定為環(huán) 2，研究顯示 nAMD 組環(huán) 1 FD%顯著高于環(huán) 2，均高于正常對照組[43]。也有研究觀察到脈絡(luò)膜加速變薄，但無法確定脈絡(luò)膜明顯變薄[54]。這提示 GA 和 MNV 兩種不同晚期 AMD 形式發(fā)病機制可能不同。CC 破壞可能會驅(qū)動 MNV 生長，而DH是如何形成的，是否可以將 CC 作為 MNV 生物標志物[34]，均有待更多的前瞻性分析研究進一步證實。

OCTA 表現(xiàn)的 CC 血流缺失信號在病理方面也有發(fā)現(xiàn):所有階段 AMD 患者CC 血管損失均較對照組高，早期和中期AMD血管面積損失分別為20.5%和12.5%；GA 中 CC 丟失率為 39.0%，沒有 RPE 脫離的新生血管 CC 丟失率為38.2%[55]。因此，視網(wǎng)膜外灌注的病理改變可能是 AMD 的一個重要早期促成因素[30]。

4.2 脈絡(luò)膜血流脈絡(luò)膜血流主要控制機制包括神經(jīng)血管耦合、肌源性調(diào)節(jié)和自動調(diào)節(jié)[56]。脈絡(luò)膜血流量(CBF)主要由自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，脈絡(luò)膜小動脈受腎上腺素能神經(jīng)(頸上神經(jīng)節(jié))和副交感神經(jīng)(面神經(jīng)翼腭神經(jīng)節(jié))支配，刺激后分別引起血管收縮和血管舒張，周細胞因包裹著脈絡(luò)膜的動脈/小動脈參與CC 的血管張力調(diào)節(jié)[10]。AMD 的 CBF 神經(jīng)控制障礙可能在成年早期開始，隨著年齡增長而加重，進而導(dǎo)致視網(wǎng)膜血流量供應(yīng)和調(diào)控、影響脈絡(luò)膜灌注的血壓調(diào)節(jié)異常[57]。CBF 調(diào)節(jié)取決于脈絡(luò)膜循環(huán)動脈側(cè)和靜脈側(cè)的壓力水平[58]。當(dāng)大腦中動脈內(nèi)膜收縮，眼動脈阻力減少，脈絡(luò)膜血管血壓升高，后鞏膜硬度增加，前鞏膜壓力增加，脈絡(luò)膜血管壓力升高使靜水壓力增高阻止碎片從RPE 層到脈絡(luò)膜的清除，缺氧加重發(fā)生 MNV[59]。當(dāng)脈絡(luò)膜灌注和 CC 密度降低，黃斑區(qū)散熱能力降低，導(dǎo)致免疫激活，從而增加炎癥介質(zhì)(如補體和 Alu RNA)積聚;萎縮的 CC 引起鄰近毛細血管的剪切應(yīng)力升高，導(dǎo)致脈絡(luò)膜不適合清除視網(wǎng)膜廢物，也無法修復(fù)血管，最終加劇脈絡(luò)膜變薄、RPE 和視網(wǎng)膜萎縮導(dǎo)致 GA[22,59]。另外渦靜脈回流異常[56]、血管內(nèi)皮松弛劑一氧化氮(NO)生產(chǎn)過剩/不足的比例失衡也參與 CBF 調(diào)節(jié)[60]。研究表明，NO合成酶不同亞型的表達改變可參與脈絡(luò)膜微血管的改變，導(dǎo)致新生血管形成[61]。因此，脈絡(luò)膜血流功能障礙是AMD 發(fā)病的關(guān)鍵因素，AMD 中區(qū)域性 CBF 變化及是否在 AMD 發(fā)病機制中起主導(dǎo)作用、脈絡(luò)膜微環(huán)境與剪切應(yīng)力的關(guān)系、脈絡(luò)膜解剖轉(zhuǎn)變與局部血流動力學(xué)參數(shù)的關(guān)系有待進一步探索。

5 總結(jié)和展望

越來越多證據(jù)表明，脈絡(luò)膜，尤其是 CC 在 AMD 的發(fā)病機制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本文從組織病理、基因表達、炎癥、血流方面綜述了脈絡(luò)膜(特別是 CC) 在 AMD 中的研究進展。總而言之，AMD 中脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致通過 CC 向 RPE 和視網(wǎng)膜運輸氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、免疫細胞和清除代謝廢物的能力下降。在 AMD 多因素的作用下，脈絡(luò)膜發(fā)生從基因到蛋白水平變化，加之脈絡(luò)膜血流灌注降低加劇了細胞損傷和代謝廢物堆積，CC 退化，RPE 和光感受器細胞發(fā)生缺氧及營養(yǎng)障礙造成不可逆損害，最終進展為 GA 或 MNV。因此，CC丟失可能是 AMD 發(fā)展的起始因素。AMD 發(fā)病機制復(fù)雜，了解脈絡(luò)膜在 AMD 發(fā)病機制中的改變可能有助于識別 AMD 的早期特征，以期未來從脈絡(luò)膜的細胞及分子水平入手，提供AMD 的新療法和新思路。