亞硝酸鈉對鲅魚魚肉組織及肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響

郝子娜，張古龍，馬雅楠，馮靜，李宗澤

1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（錦州 121000）；2.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（錦州 121000）

腌制水產(chǎn)品是一種傳統(tǒng)的加工保藏產(chǎn)品，其風(fēng)味獨特，深受大眾的青睞[1]。而腌制用鹽一般為粗鹽（含有亞硝酸鈉），并且亞硝酸鈉作為一種常用的食品添加劑，常被作為發(fā)色劑、防腐劑和抗氧化劑人為添加到食品中（發(fā)色、抑菌、抗氧化、改善風(fēng)味和改善品質(zhì)）。

國內(nèi)外對于亞硝酸鹽在腌制水產(chǎn)品方面的研究集中于亞硝酸鹽與和胺反應(yīng)生成產(chǎn)物亞硝基化合物對人體的危害[2-4]、對亞硝酸鹽含量檢測方法的優(yōu)化[5-7]，以及亞硝酸鹽的發(fā)色、抑菌等機理的研究[8-9]。而水產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量豐富，研究表明，亞硝酸鹽對腌制水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的作用主要機制是亞硝酸鹽在酸性條件下生成亞硝酸，亞硝酸極不穩(wěn)定，能夠分解出NO，NO與蛋白質(zhì)反應(yīng)進而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[10]。Villaverde等對亞硝酸鈉影響蛋白質(zhì)氧化方面進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與75 mg/kg亞硝酸鈉相比，150 mg/kg亞硝酸鈉能夠顯著促進干腌香腸中蛋白質(zhì)的羰基化，從而促進了蛋白質(zhì)氧化[11]。然而，F(xiàn)eng等[12]研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鈉既有抗氧化作用，又具有促氧化作用。NaNO2對蛋白質(zhì)氧化的抗氧化作用表現(xiàn)為顯著降低羰基含量、提高游離胺含量和降低表面疏水性。NaNO2對蛋白質(zhì)氧化的促氧化作用是巰基的減少和二硫鍵的增加。因此，對于亞硝酸鈉促進或抑制蛋白氧化仍沒有統(tǒng)一結(jié)論。

國內(nèi)對肉制品亞硝酸鈉的最高限量多為150 mg/kg[13]。在國外，如美國、歐盟，也允許亞硝酸鈉使用在肉制品中。Bedale等[14]研究表明，高濃度的亞硝酸鹽會與DNA發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致DNA突變，給人類健康帶來潛在的危害。因此，試驗以鲅魚為研究對象，系統(tǒng)研究濃度在150 mg/L以下的亞硝酸鈉溶液對鲅魚魚肉組織及肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響包括魚肉組織學(xué)特性、蛋白抽提率、蛋白組分、蛋白總巰基含量、蛋白羰基含量、蛋白表面疏水性等指標，闡明亞硝酸鈉對鲅魚魚肉組織及肌原纖維蛋白的影響，為亞硝酸鈉在腌制水產(chǎn)品中的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲅魚（Scomberomorus niphonius，購自錦州水產(chǎn)品市場）；NaCl、MgCl2、HCl、NaNO2、甘氨酸、SDS、疏基乙醇、甘油、KCl、尿素、溴酚藍、EDTA、DTNB、1-苯胺基-8萘基磺酸鹽（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，分析純，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-25MS冷凍離心機（上海盧湘儀儀器有限公司）；FC酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Bio-Rad電泳儀（美國伯樂公司）；MJ-WBL2521H勻漿機（中國美的集團股份有限公司）；TU-1810紫外分光光度計（北京普析通用有限責(zé)任公司）；F4600熒光分光光度計（日立集團）；BX41光學(xué)顯微鏡（日本Olympus光學(xué)儀器有限公司）；AUW320分析天平（日本島津公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取方法參考Toldra等[15]的方法并略有修改。取5 g背部魚肉，加10倍體積的溶液A（15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5），勻漿（10 000 r/min，1 min），勻漿液在冷凍離心機中離心（7 000 r/min，15 min），去除上清液，沉淀加10倍體積溶液A，勻漿，冷凍離心，去除上清液。所得沉淀加入10倍體積溶液B（0.45 mol/L KCl，15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5），勻漿（10 000 r/min，1 min），勻漿液冷凍離心，取上清液，再次離心，取上清液得肌原纖維蛋白。此過程在4 ℃下進行。

1.3.2 對肌原纖維蛋白進行亞硝酸鈉處理

在上述蛋白溶液中添加亞硝酸鈉，使亞硝酸鈉最終濃度分別為0，20，40，100和150 mg/L，并在25 ℃水浴下處理1 h后離心，取上清液為肌原纖維蛋白溶液繼續(xù)試驗。

1.3.3 肌原纖維蛋白溶解度的測定

肌原纖維蛋白溶液的蛋白溶解度用考馬斯亮藍染料結(jié)合比色法[16]測定。

1.3.4 電泳分析

采用Laemmli[17]的方法，分離膠濃度15%，濃縮膠濃度5%。蛋白上樣量為10 μg。

1.3.5 巰基含量的測定

參照Ellman[18]的方法測定蛋白質(zhì)的總巰基含量，并略有改動。取0.5 mL蛋白溶液，加入4 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L NaCl，6 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0）混勻。加入0.5 mL 10 mmol/L 5,5-二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）混合均勻。將該反應(yīng)體系放入40 ℃水浴鍋中反應(yīng)0.5 h，在412 nm處測定吸光度。巰基濃度用摩爾消光系數(shù)13 600 L/mol·cm計算。

1.3.6 羰基含量的測定

羰基含量的測定按照Oliver等[19]的方法并略加改動。取0.3 mL蛋白溶液，加入0.3 mL 10 mmol/L 2, 4-二硝基苯肼（DNPH），室溫放置1 h，每隔10 min振蕩1次。反應(yīng)結(jié)束后，加入20%三氯乙酸0.6 mL，離心（9 000 r/min，15 min），離心后靜置10 min，沉淀用2 mL乙醇∶乙酸乙酯（1∶1）溶液洗滌后加入2 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液，振蕩后37 ℃孵育20 min，離心15 min（9 000 r/min），靜置10 min后取上清液，在367 nm處測其吸光度。使用分子吸光系數(shù)22 000 L/mol·cm計算羰基含量。

1.3.7 蛋白表面疏水性的測定

測定蛋白表面疏水性采用Cardamone等[20]的ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸）熒光探針法，并略有改動。蛋白液用蛋白提取時使用的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）稀釋成5個梯度濃度的蛋白溶液（質(zhì)量濃度在0.05～10 mg/mL）。取2 mL蛋白液加入20 μL 8 mmol/L的ANS溶液，迅速振蕩混勻后在暗室中靜置3 min使其充分反應(yīng)，測定樣品的熒光強度。激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，以樣品的熒光強度對蛋白質(zhì)濃度作圖，曲線的初始斜率即為蛋白質(zhì)分子表面疏水性指數(shù)。

1.3.8 魚肉組織學(xué)特性的測定

按照李新等[21]的方法，并做了修改。將魚肉切成3 cm×3 cm×2 cm小塊后，在25 ℃分別用0，20，40，100和150 mg/L亞硝酸鈉溶液處理1 h，樣品被切成5 mm×5 mm×5 mm的小塊，固定在4%的多聚甲醛溶液中24 h后，用梯度乙醚溶液（75%～100%，V/V）進行脫水處理。將樣品包埋在石蠟中，采用光學(xué)顯微鏡進行觀察，掃描圖像放大倍數(shù)調(diào)整為1 500。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

整體試驗重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)采用SPSS進行重復(fù)測量的方差分析及顯著性分析，采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鈉對肌原纖維蛋白溶解度的影響

蛋白溶解度能夠反映蛋白變性和聚集狀態(tài)，同時也是衡量蛋白質(zhì)功能的一個很好的指標[22]。肌原纖維蛋白溶解度如圖1所示。

圖1 不同濃度亞硝酸鈉處理對肌原纖維蛋白溶解度的影響

結(jié)果表明，亞硝酸鈉的處理導(dǎo)致鲅魚肌原纖維蛋白溶解度下降。未處理的新鮮鲅魚肌原纖維蛋白溶解度為5.69 mg/mL，隨著亞硝酸鈉濃度的提高，魚肉肌原纖維蛋白的溶解度逐漸下降。20 mg/L亞硝酸鈉處理的魚肉與對照組相比，蛋白溶解度沒有顯著性變化（P＞0.05），原因可能是由于亞硝酸鈉濃度過低，蛋白變性并不明顯。40 mg/L亞硝酸鈉以上濃度處理的魚肉，蛋白溶解度發(fā)生顯著變化（P＜0.05），40 mg/L、100 mg/L和150 mg/L亞硝酸鈉處理后的蛋白溶解度依次下降13.53%，20.91%和25.83%。研究表明，蛋白構(gòu)象改變是引起蛋白溶解度變化的一個重要原因[23]。因此試驗中肌原纖維蛋白溶解度的下降原因可能由于亞硝酸鈉的處理導(dǎo)致肌原纖維蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，形成不溶性聚集體，并且亞硝酸鈉濃度越高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性程度越高，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度隨之發(fā)生改變。

2.2 SDS-PAGE電泳分析

聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）可用于評價在不同加工處理后蛋白質(zhì)的組分變化情況[18]。肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白、肌動蛋白、肌原蛋白和肌原球蛋白等[24]。經(jīng)過不同處理所得的鲅魚魚肉肌原纖維蛋白聚丙烯酰胺電泳結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度亞硝酸鈉處理的肌原纖維蛋白電泳圖譜

結(jié)果表明，肌球蛋白重鏈和副肌球蛋白組分隨著亞硝酸鈉濃度的增大而逐漸降低。45～116 kDa之間的蛋白條帶隨著亞硝酸鈉濃度的增大而逐漸降低直至消失。其原因可能是亞硝酸鈉處理后魚肉部分蛋白發(fā)生變性，導(dǎo)致部分蛋白成為不可溶蛋白，因此使電泳條帶變細或消失。然而45 kDa以下的蛋白組分含量處理前后并無明顯變化，說明NaNO2處理對45 kDa以下的蛋白無明顯影響。

2.3 亞硝酸鈉對肌原纖維蛋白巰基含量的影響

蛋白總巰基含量的變化能夠影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、易變性及酶的催化作用[25]。不同濃度亞硝酸鈉處理對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響如圖3所示。

圖3 不同濃度亞硝酸鈉處理對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

結(jié)果表明，肌原纖維蛋白總巰基含量隨著亞硝酸鈉濃度的增大而顯著性降低（P＜0.05）。與對照組相比，經(jīng)過20 mg/L亞硝酸鈉處理的魚肉總巰基含量下降6.82%，下降程度不高，而隨著亞硝酸鈉濃度增加，40 mg/L及更高濃度亞硝酸鈉處理后魚肉總巰基含量發(fā)生急劇下降，與對照組相比，40 mg/L亞硝酸鈉處理后魚肉總巰基含量下降40.33%，而100 mg/L亞硝酸鈉處理后魚肉總巰基含量下降47.08%，150 mg/L亞硝酸鈉處理后魚肉總巰基含量下降55.95%。肌原纖維蛋白總巰基含量的下降是由于暴露在蛋白質(zhì)表面的活性巰基中的半胱氨酸殘基發(fā)生氧化，生成二硫鍵形成分子內(nèi)或分子間交聯(lián)導(dǎo)致[26]。由此可知，亞硝酸鈉能夠引起含硫氨基酸的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化。蛋白質(zhì)的部分巰基形成二硫鍵，不僅使總巰基含量下降，而且改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[27]，從而影響蛋白的溶解度和聚集程度，這與前2個試驗指標結(jié)果一致。

2.4 亞硝酸鈉對肌原纖維蛋白羰基含量的影響

蛋白質(zhì)中的羰基含量是反映蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標之一[28]，羰基主要由氨基酸側(cè)鏈（通常為帶有—NH或者—NH2的氨基酸殘基）及肽鍵的氧化斷裂產(chǎn)生[29]。亞硝酸鈉處理對肌原纖維蛋白羰基含量的影響如圖4所示。

圖4 不同濃度亞硝酸鈉處理對肌原纖維蛋白羰基含量的影響

結(jié)果表明，20，40和100 mg/L亞硝酸鈉處理后肌原纖維蛋白羰基含量雖有波動，但與對照組相比并沒有顯著性差異（P＞0.05），這表明低濃度亞硝酸鈉處理對肌原纖維蛋白并沒有明顯的促進或抑制氧化的作用。而150 mg/L亞硝酸鈉處理后肌原纖維蛋白羰基含量與對照組相比略有升高（P＜0.05），這表明150 mg/L的亞硝酸處理能夠加速魚肉肌原纖維蛋白的氧化進程。馬國源[30]研究發(fā)現(xiàn)低濃度亞硝酸鈉能夠促進雞肉肌紅蛋白的氧化，這與試驗結(jié)果相似。但其研究發(fā)現(xiàn)低濃度亞硝酸鈉卻降低牦牛肉肌紅蛋白羰基含量，馬國源認為這與牦牛肉和雞肉肌紅蛋白含量及亞硝酸鈉作用位點的差異有關(guān)。因此，低濃度亞硝酸鈉能夠促進鲅魚肌原纖維蛋白的氧化進程，分析其原因，也可能與亞硝酸鈉對肌原纖維蛋白的作用位點有關(guān)。

2.5 亞硝酸鈉對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

不同濃度亞硝酸鈉處理對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響如圖5所示。

圖5 不同濃度亞硝酸鈉處理對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

結(jié)果表明，20 mg/L亞硝酸鈉處理后肌原纖維蛋白表面疏水性與對照組相比并沒有顯著性差異（P＞0.05），40 mg/L及以上濃度的亞硝酸鈉處理后，肌原纖維蛋白表面疏水性發(fā)生了顯著性升高（P＜0.05），并且亞硝酸鈉濃度越高，升高幅度越大。蛋白質(zhì)表面疏水性的升高表明亞硝酸鈉可以促使蛋白疏水性基團的暴露。被亞硝酸鈉處理后的鲅魚肌原纖維蛋白的表面疏水性比對照組高，這說明亞硝酸鈉促進魚肉肌原纖維蛋白氧化。

2.6 亞硝酸鈉對鲅魚肌肉微觀組織的影響

經(jīng)過亞硝酸鈉處理后魚肉肌肉微觀組織如圖6所示。

圖6 不同濃度亞硝酸鈉處理對魚肉肌肉微觀組織的影響

結(jié)果表明，對照組鲅魚肌纖維排列緊密度較高，肌纖維間的間隙比較緊密。隨著亞硝酸鈉濃度增大，鲅魚魚肉微觀組織整體形態(tài)與對照組相比肌纖維間隙有增高趨勢但并不明顯，鲅魚魚肉微觀組織整體形態(tài)仍較為完整。魚肉肌纖維增大能夠?qū)е卖~肉水分流失，致使魚肉剪切力下降[31]。因此，用低濃度亞硝酸鈉處理魚肉會導(dǎo)致魚肉水分部分少量流失，但對魚肉整體組織狀態(tài)作用不明顯。

3 結(jié)論

試驗對亞硝酸鈉處理后鲅魚魚肉微觀組織及肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)進行研究。結(jié)果表明：亞硝酸鈉對鲅魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)影響較顯著，但對魚肉微觀組織影響并不明顯，亞硝酸鈉能夠?qū)е脉阳~肌原纖維蛋白溶解度下降，45 kDa以上蛋白組分減少，表明蛋白發(fā)生聚集；總巰基含量和表面疏水性明顯下降，羰基含量呈下降趨勢，表明蛋白氧化受到抑制；魚肉肌纖維間的間隙略有增大，但并不明顯，表明150 mg/L亞硝酸鈉對魚肉整體組織狀態(tài)作用不明顯。