基于高效液相色譜技術(shù)的啤酒花指紋圖譜研究

宋文杰,李慧帆,姜俊羽,劉欣欣,付冬梅

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連,116034)

啤酒花(HumuluslupulusL.)是桑科葎草屬多年生纏繞植物,雌雄異株,又名蛇麻花、忽布、唐草花[1-2]。啤酒花的雌性球穗花序通常被稱為啤酒花,具有釀造價(jià)值,被譽(yù)為“啤酒的靈魂”[3-5]。啤酒花中的樹(shù)脂類、揮發(fā)油、黃酮類等重要成分主要來(lái)源于雌花的蛇麻腺[6],其中黃腐酚作為啤酒花特有的天然異戊烯基黃酮類化合物而備受關(guān)注[7-8]。此外,由于啤酒花具有抑菌、抗炎、抗氧化、雌激素樣作用等功效[9-10],在制藥、制糖、食品防腐等領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用[2,11-12]。本文所指的啤酒花,是沿用人們的慣稱,為啤酒花植物的雌性球穗花序。

指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的鑒定方法[13],近年來(lái)已應(yīng)用于啤酒花的質(zhì)量評(píng)價(jià),如董志敏等[1]、劉曉燕等[14]在358 nm下建立了單一波長(zhǎng)的啤酒花反相高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜分析方法,對(duì)啤酒花中的中等極性、弱極性成分進(jìn)行了分離,但對(duì)啤酒花強(qiáng)極性成分的研究還有待完善。此外,有機(jī)酸類物質(zhì)是啤酒中重要的風(fēng)味和口味物質(zhì),啤酒花作為啤酒的“靈魂”,其中強(qiáng)極性物質(zhì)如有機(jī)酸的研究鮮有報(bào)道,目前僅有SNCHEZ-MATA等[15]對(duì)未開(kāi)花的啤酒花枝葉進(jìn)行了有機(jī)酸研究。強(qiáng)極性物質(zhì)在常規(guī)的C18反相色譜柱上很難實(shí)現(xiàn)分離,因?yàn)樵?00%水作為流動(dòng)相的條件下易發(fā)生色譜填料的塌陷[16-17]。前期的研究發(fā)現(xiàn)XAqua C18反相色譜柱的填料由于鍵合了3-氯丙基極性官能團(tuán),可以用純水做為流動(dòng)相,成功用于異麥芽酮糖酶解液的預(yù)處理[18]。受此啟發(fā),本文采用XAqua C18色譜柱,對(duì)啤酒花強(qiáng)極性、中等極性及弱極性成分同時(shí)進(jìn)行分離,完善對(duì)啤酒花強(qiáng)極性成分的研究。利用紫外檢測(cè)器,雙波長(zhǎng)切換法,于215、360 nm下建立了啤酒花指紋圖譜的HPLC分析方法,0～12 min,215 nm下分離有機(jī)酸等強(qiáng)極性物質(zhì);12～66 min,360 nm下分離酚酸、黃酮等中等極性和弱極性物質(zhì),對(duì)14批啤酒花進(jìn)行指紋圖譜分析。由于對(duì)啤酒花中的強(qiáng)極性物質(zhì)進(jìn)行了有效分離,首次發(fā)現(xiàn)啤酒花中含有蘋(píng)果酸。測(cè)定了啤酒花中蘋(píng)果酸、黃腐酚的含量,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)啤酒花進(jìn)行鑒別分析。本文建立的啤酒花HPLC指紋圖譜分析方法可以更全面、綜合地反映啤酒花的品質(zhì),為啤酒花的質(zhì)量鑒定提供一種科學(xué)的評(píng)價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品、色譜級(jí)乙醇,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;黃腐酚標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物科技有限公司;色譜級(jí)乙腈、色譜級(jí)甲醇,安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?色譜級(jí)磷酸,北京伊諾凱科技有限公司。水為超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜系統(tǒng)(包括泵、二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱恒溫系統(tǒng)、Chemostation色譜工作站)、Agilent 1290 Infinity LC/6545 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(包括電噴霧離子源、二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱恒溫系統(tǒng)、Agilent Mass Hunter軟件),美國(guó)安捷倫科技公司;XAqua C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),華譜科儀(大連)科技有限公司;KQ520DE數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;AB204-N電子分析天平,梅特勒-托利多(上海)有限公司;H1750R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀集團(tuán);Milli-Q超純水凈化系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司。

1.1.3 供試品

供試樣品為啤酒花雌性球穗花序制品,共14批,S1～S9為真空密封、避光保存的新鮮酒花(新鮮組),由新疆三寶樂(lè)農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司提供,S10～S14為露天存放的酒花(氧化組),購(gòu)自河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)。14批啤酒花的品種、產(chǎn)地、生產(chǎn)時(shí)間詳見(jiàn)表1。

表1 十四批啤酒花樣品信息Table 1 Sample information of 14 batches of Humulus lupulus L.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 啤酒花提取液的制備

將啤酒花粉碎后過(guò)40～60目篩備用。稱取0.500 g過(guò)篩后的樣品于50 mL具塞錐形瓶中,精密加入50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇25 mL,密塞,稱重,超聲(200 W,40 kHz)提取30 min,冷卻至室溫,再稱重,用50%乙醇補(bǔ)足損失的重量,搖勻,上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,備用。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精確稱取150 mg的蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品,加入75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇制成3.000 mg/mL的母液。精確稱取6 mg黃腐酚標(biāo)準(zhǔn)品,加入75%(體積分?jǐn)?shù))甲醇制成0.120 mg/mL的母液備用。稀釋母液,得到一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2 色譜條件

1.2.2.1 液相色譜條件

流動(dòng)相:A相為水(含0.03%磷酸,體積分?jǐn)?shù)),B相為乙腈(含0.03%磷酸,體積分?jǐn)?shù)),梯度洗脫:0～12 min,0% B;12～13 min,0%～20% B;13～23 min,20 %～30% B;23～41 min,30%～63% B;41～45 min,63% B;45～60 min,63%～80% B;60～61 min,80%～90% B;61～66 min,90% B。流速1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):0～12 min,215 nm;12～66 min,360 nm。

1.2.2.2 液質(zhì)聯(lián)用條件

流動(dòng)相:A相為水(含0.1%甲酸,體積分?jǐn)?shù)),B相為乙腈(含0.1%甲酸,體積分?jǐn)?shù)),XAqua C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,5 μm),華譜科儀(大連)科技有限公司,柱溫30 ℃,流速0.2 mL/min,進(jìn)樣量2 μL,梯度洗脫:0～10 min,0% B;10～30 min,100% B。Dual AJS ESI離子源,負(fù)離子模式,氣簾氣20 psi,溫度325 ℃,干燥氣流速5 L/min,毛細(xì)管電壓 3 500 V,噴嘴電壓2 000 V,全掃描范圍m/z50～1 700。

1.2.3 啤酒花指紋圖譜的相似度分析

將啤酒花提取液按照1.2.2.1的液相色譜分離條件進(jìn)行液相色譜分析,得到不同批次啤酒花的指紋圖譜。將圖譜導(dǎo)入2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”,將S3設(shè)定為參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法,時(shí)間窗寬度設(shè)定0.1 min進(jìn)行自動(dòng)匹配,得到啤酒花的對(duì)照?qǐng)D譜,并進(jìn)行相似度分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Agilent Chemostation色譜工作站提取色譜數(shù)據(jù),利用SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis,OPLS-DA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

利用2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”對(duì)各批次啤酒花指紋圖譜進(jìn)行分析,14批啤酒花的指紋圖譜如圖1所示。從14批啤酒花指紋圖譜中共確定了31個(gè)共有峰。進(jìn)一步計(jì)算14批啤酒花的相似度,如表2所示,14批啤酒花的相似度>0.890,除S5外,其他13批不同產(chǎn)地、不同年份以及不同保存形式的啤酒花相似度均>0.978,說(shuō)明各批次啤酒花之間化學(xué)成分差異較小,而S5與其他批次之間的相似度偏低,說(shuō)明馬克波羅(S5)與其他品種的啤酒花間存在一定的差異。

圖1 十四批啤酒花HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 14 batches of Humulus lupulus L.

表2 十四批啤酒花相似度Table 2 Similarity evaluation result of 14 batches of Humulus lupulus L.

通過(guò)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”對(duì)14批啤酒花指紋圖譜進(jìn)行分析,得到啤酒花的對(duì)照指紋圖譜如圖2所示,本研究所建立的啤酒花指紋圖譜可以將啤酒花的組成明顯分為幾個(gè)組分:0～10 min的1～7號(hào)共有峰為以純水(含0.03% H3PO4,體積分?jǐn)?shù))做流動(dòng)相進(jìn)行分離的強(qiáng)極性組分,15～45 min的8～26號(hào)共有峰為中等極性組分,45～66 min的27～31號(hào)共有峰為極性較弱的組分。與之前報(bào)道的啤酒花指紋圖譜相比[1，14],本研究所建立的啤酒花指紋圖譜分析方法可以將啤酒花中的成分進(jìn)行更好地分離,獲得更多的色譜峰,降低了因色譜峰重疊而產(chǎn)生的對(duì)啤酒花質(zhì)量評(píng)價(jià)的影響。

采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)啤酒花的化學(xué)組成進(jìn)行定性分析,通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)、一級(jí)精確相對(duì)分子質(zhì)量比對(duì),鑒定得到2號(hào)峰為蘋(píng)果酸([M-H]-:133.013 0),26號(hào)峰為黃腐酚([M-H]-:353.088 7),保留時(shí)間分別為4.11、44.37 min。由于采用了極性反相C18色譜柱,對(duì)啤酒花中的強(qiáng)極性成分進(jìn)行了較好的分離,首次從啤酒花中鑒定到蘋(píng)果酸。

2.2 定量分析

2.2.1 線性關(guān)系

取一系列濃度梯度的蘋(píng)果酸與黃腐酚的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,進(jìn)行色譜分析,得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(x),對(duì)應(yīng)濃度的峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在0.015 0～3.000 mg/mL的蘋(píng)果酸的濃度與峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=577.03x+9.713,R2為0.999 6;在0.000 120～0.120 mg/mL的黃腐酚的質(zhì)量濃度與峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=52 863x+4.655 1,R2為1。

2.2.2 十四批啤酒花蘋(píng)果酸、黃腐酚含量測(cè)定

對(duì)14批啤酒花中的蘋(píng)果酸、黃腐酚含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表3所示。14批啤酒花的蘋(píng)果酸含量為2.42 1～12.248 g/kg,黃腐酚的含量為0.092 0～4.73 4 g/kg。由表3中密封保存酒花的蘋(píng)果酸含量可以看出,香花(S4、S9)的蘋(píng)果酸含量最高,苦香兼?zhèn)湫途苹?S1～S3、S6～S8)次之,苦型花(S5)的蘋(píng)果酸含量最低。

a-啤酒花對(duì)照指紋圖譜3～6 min局部放大圖;b-啤酒花對(duì)照指紋圖譜19～25 min局部放大圖;c-啤酒花對(duì)照指紋圖譜34～43 min局部放大圖圖2 啤酒花對(duì)照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of Humulus lupulus L.

表3 十四批酒花的蘋(píng)果酸、黃腐酚含量 單位:g/kg

啤酒花的新鮮程度對(duì)黃腐酚的含量影響較大,密封保存組(新鮮組)啤酒花的黃腐酚含量普遍大于露天保存組(氧化組)。PRENCIPE等[19]對(duì)啤酒花中的黃腐酚進(jìn)行了含量測(cè)定,其含量為0.8～5 g/kg,與本文中新鮮組酒花的黃腐酚含量一致。進(jìn)一步從表3中的數(shù)據(jù)可知,除新鮮程度外,黃腐酚的含量還受到啤酒花的香型以及壓制類型的影響。同種壓制類型,香花品種(S4、S9)的黃腐酚含量要低于苦香兼?zhèn)湫途苹?S1～S3、S6～S8)或苦型酒花(S5),苦型酒花(S5)的黃腐酚含量最高。除壓縮馬克波羅(S5)、壓縮薩斯特3號(hào)(S8)外,酒花顆粒(S1～S4)的黃腐酚含量均高于壓縮啤酒花(S6、S7、S9～S14),由此可見(jiàn),啤酒花以酒花顆粒形式可以更好地進(jìn)行保存。

2.3 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.3.1 PCA

以14批啤酒花的共有峰峰面積為變量,使用SIMCA14.1軟件進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的主成分分析,得到PCA得分圖,如圖3所示。其中模型參數(shù)R2X代表了模型擬合的程度,數(shù)值即為對(duì)模型的解釋率,Q2表示模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)的效果,Q2>0.5表示模型具有良好的預(yù)測(cè)性[20-21]。本研究所構(gòu)建的模型R2X=0.985,Q2=0.562,說(shuō)明該模型可以解釋98.5%的樣本信息,且具有良好的預(yù)測(cè)性。

通過(guò)PCA得分圖可以看出,14批啤酒花可按新鮮程度明顯區(qū)分,聚為兩類。其中新鮮組的S1～S9聚為一類,S5因其品種為苦型花,故在散點(diǎn)圖中距離其他新鮮酒花較遠(yuǎn),氧化組的S10～S14聚為一類。說(shuō)明酒花的新鮮程度差異可以通過(guò)指紋圖譜的差異進(jìn)行表征。

圖3 十四批啤酒花PCA得分圖Fig.3 PCA scatter plot for 14 batches of Humulus lupulus L.

2.3.2 OPLS-DA

將14批啤酒花共有峰峰面積數(shù)據(jù)及分組信息導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中繼續(xù)進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA,得到OPLS-DA得分圖,如圖4所示。模型參數(shù)R2X=0.610、R2Y=0.962、Q2=0.882,說(shuō)明模型穩(wěn)定可靠[22]。由圖4可知,14批啤酒花明顯分為兩類,與PCA結(jié)果相一致。

由建立的OPLS-DA模型得到14批啤酒花的31個(gè)共有峰的變量投影值(variable importance for the projection,VIP),以VIP>1為條件[23]篩選出可區(qū)分啤酒花新鮮程度的差異性化合物,如圖5所示。按差異性化合物貢獻(xiàn)程度進(jìn)行排序:4號(hào)峰(VIP=1.236)>1號(hào)峰(VIP=1.171)>15號(hào)峰(VIP=1.142)>14號(hào)峰(VIP=1.137)>21號(hào)峰(VIP=1.134)>13號(hào)峰(VIP=1.104)>20號(hào)峰(VIP=1.088)>26號(hào)峰(VIP=1.085)>27號(hào)峰(VIP=1.070)>18號(hào)峰(VIP=1.060)>28號(hào)峰(VIP=1.053)>29號(hào)峰(VIP=1.035)>2號(hào)峰(VIP=1.006)。這13個(gè)色譜峰可作為評(píng)價(jià)啤酒花新鮮程度的標(biāo)志性指紋譜峰。

圖4 十四批啤酒花OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA scores plot for 14 batches of Humulus lupulus L.

圖5 啤酒花樣品的VIP值預(yù)測(cè)圖(VIP >1)Fig.5 VIP predicted values plot of Humulus lupulus L.(VIP>1)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用鍵合有極性官能團(tuán)的反相C18色譜柱建立了啤酒花的切換波長(zhǎng)HPLC指紋圖譜分析方法,實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)啤酒花強(qiáng)極性、中等極性及弱極性物質(zhì)的分離。對(duì)14批啤酒花進(jìn)行指紋圖譜分析,共確定31個(gè)共有峰,相似度>0.890,表明不同產(chǎn)地、不同品種、不同壓縮方式及保存方式的啤酒花樣品間差異不大。首次基于HPLC技術(shù)確認(rèn)啤酒花中存在蘋(píng)果酸,為2號(hào)指紋譜峰,同時(shí)指認(rèn)出26號(hào)指紋譜峰為黃腐酚。測(cè)定了14批啤酒花中蘋(píng)果酸和黃腐酚的含量,蘋(píng)果酸的含量為2.421～12.248 g/kg,黃腐酚的含量為0.092 0～4.734 g/kg,表明不同樣品間存在一定的差異。PCA和OPLS-DA結(jié)果表明,14批啤酒花可按新鮮程度分為新鮮酒花和氧化酒花,并確定了1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、13～15號(hào)、18號(hào)、20號(hào)、21號(hào)、26～29 號(hào)這13個(gè)色譜峰可作為啤酒花質(zhì)量控制的標(biāo)志性指紋譜峰。綜上所述,本研究發(fā)展的HPLC指紋圖譜分析方法為啤酒花的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了有效的方法依據(jù)。

在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,可通過(guò)多維液相色譜分離分析,聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)啤酒花中的未知化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn),以期對(duì)啤酒花有更加深入的了解。