呼明哲， 李湘玲， 金靜怡， 王敏燕， 高俊杰*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心，上海 201203)

冠狀動脈閉塞引起的缺血性心臟病是威脅人類健康的主要死亡原因之一，目前對心肌缺血主要采用經(jīng)皮冠狀動脈介入、溶栓、冠狀動脈搭橋等恢復(fù)心臟血供的救治措施，但治療過程中出現(xiàn)的心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)嚴重影響療效[1-2]。MIRI屬于中醫(yī)“胸痹”“心痛”范疇，血液運行失常，血脈瘀阻是其主要病機，大多從調(diào)節(jié)氣血方面進行干預(yù)[3]。丹參飲是具有活血化瘀功效的中藥經(jīng)典方劑，方中丹參可有效改善血液流變學(xué)指標和紅細胞變形性，降低血液黏稠度[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參飲預(yù)處理能降低I/R大鼠心肌梗死面積，減輕炎癥反應(yīng)，減少線粒體腫脹，具有防治MIRI的作用[5-6]。

MIRI發(fā)病機制十分復(fù)雜，一般認為與氧自由基的產(chǎn)生、線粒體能量代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、心肌細胞凋亡等因素有關(guān)。心肌缺血缺氧時，線粒體功能和結(jié)構(gòu)受損，Cyt-C水平升高，促進氧自由基的形成；再灌注時，大量氧自由基產(chǎn)生導(dǎo)致氧化應(yīng)激，使線粒體通透性增加、膜電位喪失和Cyt-C釋放。Cyt-C通過激活caspase途徑或通過抑制氧化磷酸化而降低細胞ATP水平進而誘導(dǎo)細胞凋亡，加劇MIRI[7-8]，故改善心肌細胞能量代謝、減輕心肌細胞凋亡對防治MIRI至關(guān)重要。本研究采用大鼠I/R模型，擬從血流動力學(xué)、心肌能量代謝、心肌細胞凋亡3個角度探討丹參飲抗MIRI的作用及機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量(220±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2017-0011，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，室溫22～24 ℃，相對濕度50%～55%，給予普通飼料喂養(yǎng)。所有操作均符合實驗動物倫理委員會規(guī)定，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批通過，倫理號PZSHUTCM9032901。

1.2 試劑與藥物 丹參飲由丹參30 g、砂仁6 g、檀香6 g組成，購自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑室制作，方法為加10倍量水浸泡30 min后煎煮，煮沸后保持微沸1 h，濾過，濾渣加10倍量水繼續(xù)煎煮1 h，濾過，合并2次濾液，濃縮至生藥量1 g/mL，即得。三磷酸腺苷酸(ATP，批號N30M11W114336，純度≥96.0%)、二磷酸腺苷(ADP，批號S14M11Y112970，純度≥98.0%)、5-腺苷一磷酸(AMP，批號M14M7Y14791，純度≥98.0%)均購自上海源葉生物科技有限公司；5-氟尿嘧啶(內(nèi)標，批號100187-201203，純度99.6%)購自中國食品藥品檢定研究院；Cyt-C ELISA試劑盒(批號20200810)購自南京建成生物工程研究所有限公司；TUNEL試劑盒(貨號G1501)購自武漢賽維爾生物科技有限公司；cleaved caspase-3(貨號9664)、GAPDH(貨號5174)、anti-rabbit IgG(貨號7074)均購自美國Cell Signaling Technology公司；Bcl-2(貨號40639)購自南京川博生物技術(shù)有限公司；Bax(貨號T40051F)購自艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司。乙酸銨(批號4093405)購自北京迪科馬科技有限公司；氨水(批號C10923265)，購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 儀器 PowerLab/4SP型生物信號處理和分析系統(tǒng)，購自埃德儀器國際貿(mào)易(上海)有限公司；LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀、1260 Infinity液相系統(tǒng)，購自美國Agilent公司，AB API 4000質(zhì)譜儀、Analyst 1.5.2軟件，購自美國Applied Biosystem公司；Nikon Eclipse C1型正置熒光顯微鏡，購自日本尼康公司；Synergy H1型酶標儀，購自德國Bio-Tek公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 60只大鼠隨機分為假手術(shù)組、缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)模型組及丹參飲高、中、低劑量組，每組12只。根據(jù)大鼠與人給藥劑量換算，丹參飲高、中、低劑量組每天分別以8.4、4.2、2.4 g/kg劑量灌胃給藥，假手術(shù)組、模型組灌胃給予等量雙蒸水，每天1次，連續(xù)7 d。最后1次用藥后1 h內(nèi)，進行I/R造模。

2.2 造模 參考文獻[5-6]報道，鈍性剝開大鼠心包膜及胸腺，暴露左心耳及左心室，用6-0無損傷線于左心耳下緣下2 mm處進針，右1/3處出針，結(jié)扎左前降支。結(jié)扎左前降支時將1張紗布網(wǎng)墊置于結(jié)扎處以避免損傷血管，心電圖顯示ST段抬高，結(jié)扎心肌變白即為造模成功，結(jié)扎30 min后將絲線結(jié)松開，再灌注24 h后結(jié)束實驗?？瞻讓φ战M大鼠同法行開胸及心臟穿線，但不打結(jié)。

2.3 血流動力學(xué)指標檢測 造模結(jié)束后，大鼠腹腔注射肝素鈉(1 200 U/kg)抗凝20 min，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，固定后分離右側(cè)頸總動脈，插入PE-50型聚乙烯心導(dǎo)管，心導(dǎo)管在動脈中時測定心率(HR)、主動脈收縮壓(SAP)、主動脈舒張壓(DAP)，連續(xù)穩(wěn)定10 min后將其進一步插入左心室，穩(wěn)定5 min后測定左室峰壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(LV+dp/dtmax)及左室內(nèi)壓最大下降速率(LV-dp/dtmax)。

2.4 HE染色 造模結(jié)束后取出大鼠心臟，10%甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，在光鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.5 TUNEL染色 大鼠心臟經(jīng)石蠟切片后常規(guī)脫蠟至水，滴加蛋白酶K工作液，在37 ℃下孵育30 min，滴加3% H2O2室溫封閉，滴加破膜工作液，在37 ℃下孵育20 min，滴加TDT酶，置于37 ℃濕盒中孵育2 h，滴加DAPI染液，避光，在37 ℃下孵育10 min，抗熒光淬滅封片劑封片，鏡檢拍照，計算TUNEL染色陽性率。

2.6 心肌組織能譜檢測

2.6.1 樣品制備 大鼠心臟用預(yù)冷的甲醇-水(50∶50)以10 mL/g比例進行勻漿，4 ℃、12 500×g離心15 min，取10 μL上清，加入190 μL內(nèi)標溶液[含100 ng/mL 5-氟尿嘧啶的甲醇-水(50∶50)]混勻，4 ℃、12 500×g離心15 min，取上清進樣分析，以隨行標曲進行定量。

2.6.2 色譜條件 Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相水(含2 mmol/L乙酸銨和0.03%氨水)-甲醇(90∶10)；體積流量1 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；自動進樣器溫度6 ℃。

2.6.3 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，負離子掃描模式；電壓-4 500 V；離子源溫度600 ℃；離子源Gas1/Gas2 50 psi(1 psi=6.895 kPa)；Cur Gas 20 psi；多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)，碰撞氣壓力Medium；掃描時間150 ms；去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口電壓(CXP)及用于定量分析的母離子(Q1)、子離子(Q3)參數(shù)見表1。

表1 分析物和內(nèi)標質(zhì)譜參數(shù)

2.7 大鼠心肌組織中Cyt-C水平檢測 造模結(jié)束后取大鼠新鮮心肌組織，剪成糊糜，采用組織線粒體分離試劑盒，全程低溫操作，洗滌、勻漿、多次離心后制成胞漿提取液，采用Cyt-C ELISA試劑盒，按照說明書步驟操作，檢測胞漿提取液中Cyt-C水平。

2.8 Western blot檢測大鼠心肌組織中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達 取100 mg大鼠心肌組織，經(jīng)勻漿、裂解、離心后取上清液，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白變性后電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉、洗膜，cleaved caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)、Bcl-2(1∶2 000)、Bax(1∶1 000)抗體孵育后顯色，采用Image J軟件獲得灰度值，計算目的蛋白相對表達。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 在造模過程中，模型組、丹參飲高劑量組大鼠各死亡1只。在血流動力學(xué)檢測過程中，模型組、丹參飲高劑量組、丹參飲低劑量組大鼠各死亡1只。

3.2 丹參飲預(yù)處理對I/R大鼠心臟血流動力學(xué)指標的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠SAP、DAP、LVSP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax均降低(P<0.05，P<0.01)，LVEDP升高(P<0.01)；與模型組比較，丹參飲中劑量組大鼠SAP升高(P<0.05)，丹參飲中、低劑量組大鼠LVSP、LV+dp/dtmax均升高(P<0.05，P<0.01)，丹參飲中、低劑量組大鼠LVEDP均降低(P<0.05)，見表2～3。

表2 丹參飲對I/R大鼠心臟血流動力學(xué)指標的影響

表3 丹參飲對I/R大鼠心臟血流動力學(xué)指標的影響

3.3 丹參飲預(yù)處理對I/R大鼠心肌病理形態(tài)的影響 如圖1所示，假手術(shù)組大鼠心肌組織細胞排列整齊、紋理清楚；模型組大鼠心肌細胞腫脹變形，可見心肌纖維斷裂，纖維間隙增寬，大量炎性細胞浸潤；丹參飲各劑量組大鼠心肌纖維排列較整齊，間隙減小，細胞輕度腫脹，均較模型組明顯減輕。

3.4 丹參飲預(yù)處理對I/R大鼠心肌細胞凋亡的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率升高(P<0.01);與模型組比較，丹參飲各劑量組大鼠心肌細胞凋亡率均降低(P<0.01)，見圖2、表4。

表4 丹參飲預(yù)處理對I/R大鼠心肌細胞凋亡率的影響

3.5 丹參飲預(yù)處理對I/R大鼠心肌能譜的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠ATP、ADP、總核苷酸(TAN)、能荷(EC)水平均降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，丹參飲中劑量組大鼠ATP、ADP、EC水平及ATP/ADP比值均升高(P<0.05，P<0.01)，丹參飲中、低劑量組大鼠TAN水平均升高(P<0.05，P<0.01)，丹參飲高劑量組各項指標無明顯變化(P>0.05)，見表5、圖3。

表5 丹參飲對大鼠心肌能譜的影響

3.6 丹參飲預(yù)處理對I/R大鼠心肌組織中Cyt-C水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Cyt-C水平升高(P<0.01)；與模型組比較，丹參飲各劑量組大鼠心肌組織中Cyt-C水平均降低(P<0.01)，見表6。

3.7 丹參飲預(yù)處理對I/R大鼠心肌組織凋亡調(diào)控蛋白表達的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織cleaved caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax蛋白表達比值降低(P<0.01)；與模型組比較，丹參飲各劑量組大鼠心肌組織cleaved caspase-3蛋白表達均降低(P<0.05)，丹參飲中、低劑量組大鼠心肌組織Bcl-2/Bax蛋白表達比值均升高(P<0.05)，見圖4、表7。

表6 丹參飲預(yù)處理對I/R大鼠心肌組織中Cyt-C水平的影響

表7 丹參飲預(yù)處理對I/R大鼠心肌組織cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

4 討論

心肌血流短時間中斷后再恢復(fù)灌注，反而會加重心肌損傷[9-10]，即心肌缺血再灌注損傷。心臟的作用是推動血液流動，向器官、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營養(yǎng)物質(zhì)[11]，但當心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時其泵血功能受到一定影響。心導(dǎo)管血流動力學(xué)檢測是評價心臟泵血功能的經(jīng)典方法，一般認為左室峰壓(LVSP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(LV+dp/dtmax)反映了左室收縮功能，而左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大下降速率(LV-dp/dtmax)反映了左室舒張功能[12]。本研究顯示，當心肌缺血再灌注發(fā)生時，大鼠左室收縮與舒張功能受損，而丹參飲預(yù)處理后LVSP、LV+dp/dtmax升高，LVEDP降低，表明它可改善缺血/再灌注大鼠損傷的左室功能。

MIRI是一個復(fù)雜的病理過程，鈣超載、能量代謝障礙、氧自由基的堆積、細胞凋亡等均可造成心肌細胞的損傷[13-14]。目前認為，心肌能量代謝障礙是心肌缺血再灌注損傷的始發(fā)環(huán)節(jié)[12]。ATP是心肌細胞的直接供能物質(zhì)[15]，在心肌細胞節(jié)律性收縮時會大量消耗，在缺血、缺氧條件下有氧氧化受到抑制，該物質(zhì)產(chǎn)生不足，并且心臟能量代謝以糖酵解為主[16]；再灌注時由于大量氧自由基的產(chǎn)生，進一步導(dǎo)致其合成受到抑制，可能使線粒體內(nèi)鈣離子超載，最終導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)不可逆性的損害[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參飲預(yù)處理可以升高I/R大鼠心肌組織中ATP、ADP、TAN、EC水平，改善缺血/再灌注大鼠心肌線粒體的能量代謝。

細胞凋亡，特別是線粒體途徑細胞凋亡是與MIRI密切相關(guān)的生物學(xué)環(huán)節(jié)，Bcl-2、Bax是線粒體凋亡途徑的調(diào)控分子[9]。Bcl-2蛋白家族決定了細胞凋亡命運[17]，Bcl-2/Bax降低可觸發(fā)Cyt-C從線粒體釋放，從而激活起始凋亡蛋白酶如caspase-9，并最終激活凋亡細胞死亡的執(zhí)行者caspase-3活化為cleaved caspase-3，并激活內(nèi)切酶導(dǎo)致DNA片段化和細胞骨架破壞等一系列引起細胞凋亡事件[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參飲預(yù)處理可降低I/R大鼠心肌細胞漿中Cyt-C水平，升高心肌細胞中Bcl-2/Bax，降低cleaved caspase-3表達，并減輕I/R大鼠心肌細胞凋亡。

綜上所述，丹參飲預(yù)處理可改善缺血/再灌注大鼠損傷的左室功能，提高其心肌能量代謝水平，改善心肌細胞凋亡，具有防治MIRI的心臟保護作用。