王 英， 陳 秋

[1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院長興院區(qū)(長興縣人民醫(yī)院)，浙江 湖州 313100；2.長興縣中醫(yī)院，浙江 湖州 313100]

慢性阻塞性肺疾病是可防可控的常見病，以持續(xù)呼吸道癥狀和氣流受限為特征，呼吸困難、咳嗽和(或)咳痰是其常見癥狀，我國該病患病率約為8.6%[1]，防治形勢嚴(yán)峻。本病屬中醫(yī)“咳嗽”“喘病”“肺脹”等范疇，主要病機(jī)是正虛積損，急性加重期以痰熱、痰濁、痰瘀為主兼氣虛、氣陰兩虛，穩(wěn)定期以氣虛、氣陰兩虛為主兼有痰瘀[2]。

三子養(yǎng)親湯出自《韓氏醫(yī)通》，以紫蘇子主氣喘咳嗽，白芥子主痰，蘿卜子主食痞兼痰，特為年老咳嗽，氣喘、痰多而設(shè)，恰好契合慢性阻塞性肺疾病的呼吸困難，咳嗽、咳痰。Meta分析證明，三子養(yǎng)親湯加減能改善慢阻肺患者的肺功能、血?dú)夥治鼋Y(jié)果和中醫(yī)證候積分[3]，其加味能改善急性加重期癥狀[4]。然而，三子養(yǎng)親湯治療慢性阻塞性肺疾病的作用機(jī)制尚不明確，故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[5]，構(gòu)建三子養(yǎng)親湯活性成分潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)活性成分與慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)蛋白進(jìn)行計(jì)算機(jī)虛擬預(yù)測，以期為進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分的篩選 檢索藥物的活性成分。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索紫蘇子、白芥子、蘿卜子的活性成分，并根據(jù)ADME特征篩選活性成分，設(shè)定口服生物采用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18。

1.2 藥物及疾病靶點(diǎn)的篩選 在TCMSP平臺(tái)中逐一檢索活性成分的靶點(diǎn)蛋白，并采用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成靶基因。TCMSP未檢索到數(shù)據(jù)的活性成分，在PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中獲取其2D分子結(jié)構(gòu)，然后采用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)進(jìn)行預(yù)測[6]，篩選可能性>0.11的條目，作為該藥物活性成分可能的靶基因，以保證靶點(diǎn)的合理性和完整性。以“chronic obstructivepulmonary disease”為檢索詞，分別檢索Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫。Genecards僅納入相關(guān)性得分>20的靶基因，OMIM納入全部檢索到的靶點(diǎn)基因。在R軟件(version 4.0.3)中采用VennDiagram包(version 1.6.20)繪制疾病靶基因和藥物靶點(diǎn)韋恩圖，得到的三子養(yǎng)親湯和慢性阻塞性肺疾病共有的網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對(duì)共有網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)進(jìn)行注釋，標(biāo)注對(duì)應(yīng)的藥物及其活性成分，形成藥物-活性成分-靶點(diǎn)的映射關(guān)系。然后采用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)獲得網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)表，根據(jù)degree值挑選出活性成分相關(guān)度高的網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，分析三子養(yǎng)親湯治療疾病的可能靶點(diǎn)。

1.4 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING數(shù)據(jù)庫(version 11.0,https://string-db.org/)構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)。設(shè)定minimum required interaction score>0.9，獲得蛋白互作關(guān)系圖，分析功能蛋白質(zhì)相互作用。將結(jié)果TSV格式導(dǎo)出，用R軟件統(tǒng)計(jì)靶點(diǎn)之間相互作用，分析關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)。

1.5 GO、KEGG富集分析 在R軟件中采用clusterProfiler包(version 3.18.0)和Bioconductor數(shù)據(jù)庫(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)用于相關(guān)分析包，對(duì)篩選出的靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，設(shè)定篩選閾值P-value<0.05，Q-value<0.05。對(duì)GO富集結(jié)果按照P值排序，各選取P值前10的條目進(jìn)行可視化。分析網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的生物過程、分子功能、細(xì)胞組成和作用的信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶點(diǎn) 在TCMSP平臺(tái)中檢索得到潛在活性成分共22種，包括紫蘇子16種，萊菔子3種，白芥子3種，見表1。在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中選取匹配度最高的10個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行整合，刪去重復(fù)(314個(gè))后共得到藥物靶點(diǎn)192個(gè)，包括紫蘇子163個(gè)，芥子18個(gè)，萊菔子3個(gè)。

表1 三子養(yǎng)親湯潛在活性成分

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選與“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 從GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得疾病靶基因1 150個(gè)，從OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得疾病靶基因1 231個(gè)，進(jìn)行整合，刪去重復(fù)的疾病靶點(diǎn)，共獲得2 209個(gè)疾病靶點(diǎn)。藥物靶點(diǎn)與疾病靶基因取交集后，得到共有靶點(diǎn)85個(gè)，見圖1，提示三子養(yǎng)親湯有可能通過這些靶點(diǎn)治療慢性阻塞性肺疾病。將三子養(yǎng)親湯潛在活性成分22種與上述85個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中，得到“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。由于連接度為1的基因表示在三子養(yǎng)親湯組分藥物治療疾病的過程中，僅有1種活性成分作用于該基因，為了清晰展示各個(gè)節(jié)點(diǎn)的關(guān)系，故在網(wǎng)絡(luò)圖中隱去。其中檸檬甾二烯醇、花生四烯酸、木犀草素連接的靶點(diǎn)基因較多；NCOA2、PGR、PTGS1、PTGS2、NR3C2、PPARG基因連接的藥物較多。紅色圓點(diǎn)表示靶點(diǎn)基因，紫色方塊表示紫蘇子的活性成分，藍(lán)色方塊表示白芥子活性成分，綠色方塊表示萊菔子活性成分。越靠近圓心字體越大，連接度越大，表示該成分連接的靶點(diǎn)(或該靶點(diǎn)承接的活性成分)越多。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(PPI) 將85個(gè)靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖3A)。圓點(diǎn)代表不同的靶點(diǎn)，不同顏色的連線表示不同的證據(jù)類型。用R軟件構(gòu)建各靶點(diǎn)連接數(shù)直方圖，由圖3B可知，連接度最高的靶點(diǎn)依次為Akt1、MAPK1、JUN、RELA、IL6、MAPK14、EGFR、ESR1、MYC、VEGFA、IL2、IL4等，提示這些基因可能是關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.4 GO富集分析 三子養(yǎng)親湯參與1 844個(gè)生物過程、110個(gè)分子功能、43個(gè)細(xì)胞組分，根據(jù)P值分別列出了GO富集分析中排名前10的結(jié)果，見圖4。

主要涉及的生物過程有肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖、增殖及其調(diào)控，其相關(guān)靶點(diǎn)有HMGCR、PPARG、TERT、PTGS2、MAPK1、Akt1、GJA1、JUN、EGFR、CDKN1A、MMP2、MMP9、IL10、IL6、MDM2、HMOX1、IFNG、GSTP1、MAPK14、RBP4；上皮細(xì)胞的增殖及調(diào)控，凋亡相關(guān)的過程，其相關(guān)靶點(diǎn)有AR、ESR1、PPARG、VDR、SCN5A、CCND1、MAPK1、ALOX5、Akt1、VEGFA、MYC、F3、GJA1、BAX、JUN、EGFR、IL10、RB1、IL6、TP63、ERBB2、HMOX1、PSEN1、AGTR1；炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其相關(guān)靶點(diǎn)有CYP19A1、ESR1、PPARG、NOS2、PTGS2、RELA、TNFRSF1A、ALOX5、TNFRSF1B、EGFR、MMP9、IL10、RB1、IL6、NFKBIA、IL2、IFNG、IL4、GSTP1、MAPK14、AGTR1、PLA2G2A；氧化應(yīng)激反應(yīng)，其相關(guān)靶點(diǎn)有G6PD、PTGS2、PTGS1、RELA、MAPK1、CASP3、ALOX5、Akt1、BCL2、JUN、EGFR、MMP2、MMP9、IL10、IL6、MDM2、APP、HMOX1、GSTP1、MET、PSEN1。

主要涉及的分子功能有磷酸酶結(jié)合和蛋白磷酸酶結(jié)結(jié)合，其相關(guān)靶點(diǎn)有PTPN1、HMGCR、PPARG、SLC6A3、MAPK1、Akt1、BCL2、EGFR、ERBB2、MET、MAPK14；核受體活性，配體激活的轉(zhuǎn)錄因子的活性，類固醇結(jié)合、生長因子受體結(jié)合，其相關(guān)靶點(diǎn)有AR、ESR1、ESR2、PPARG、VDR、NR3C2、RARB、SERPINA6、VDR、NR3C2、ABCA1、CETP等。

細(xì)胞組分結(jié)果提示藥物的作用靶點(diǎn)主要位于脂筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、細(xì)胞外器膜等處。

2.5 KEGG富集分析 三子養(yǎng)親湯的交集基因共涉及56條通路，根據(jù)P值分別列出了排名前20的通路，見圖5，涉及的通路主要集中于癌癥相關(guān)通路，其中與慢性阻塞性肺疾病聯(lián)系密切有小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。其他相關(guān)通路還有T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、Jak-STAT信號(hào)通路等。選擇主要信號(hào)通路Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路繪制通路圖，見圖6～7。

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，三子養(yǎng)親湯中的活性成分有對(duì)羥基苯乙腈、異香草酸、對(duì)羥基苯甲醛、胡蘿卜苷[7]、反式芥子酸、對(duì)羥基苯甲酸、β-谷甾醇[8]等。本研究發(fā)現(xiàn)，檸檬甾二烯醇、花生四烯酸、木犀草素可能是其重要活性成分。

活性成分連接個(gè)數(shù)最多的靶基因與激素受體和炎癥相關(guān)，如NCOA2、PGS、PPARG等。既往研究表明，慢性阻塞性肺疾病患者的核受體共激活受體(NCOA2)基因表達(dá)升高[9]，PPAR-γ激動(dòng)劑(吡格列酮)對(duì)于慢性阻塞性肺模型巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞具有清除效應(yīng)[10]。蛋白互作分析得到的關(guān)鍵基因[11]與免疫調(diào)控、炎癥反應(yīng)、血管和肺上皮細(xì)胞凋亡等相關(guān)，如Akt1、MARK1、VEGFA等。蛋白激酶B1(Akt1)的抑制劑和激活劑均對(duì)慢性阻塞性肺疾病表現(xiàn)出治療效果[12],阻斷MAPK通路可以控制慢性阻塞性肺疾病進(jìn)展[13]。研究發(fā)現(xiàn)，三子養(yǎng)親湯能降低支氣管哮喘模型大鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、TNF-α水平[14]。血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)參與血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長，肺氣腫中VEGF活性下降，導(dǎo)致肺葉上皮細(xì)胞凋亡，提高了肺泡壁對(duì)氧化應(yīng)激和蛋白酶的敏感性[15]。此外，雌激素受體(ESR)也值得關(guān)注，肺部存在所有ESR亞型，慢性阻塞性肺疾病患者肺部雌激素代謝酶mRNA表達(dá)存在變化，表明雌激素與疾病有關(guān)[16]。

GO功能分析顯示，三子養(yǎng)親湯可能調(diào)控了氣道平滑肌功能、上皮細(xì)胞增殖和凋亡等生物過程，磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、激素核受體活化等分子功能。研究發(fā)現(xiàn)，氣道平滑肌障礙會(huì)影響氣道對(duì)刺激、重塑和纖維化的反應(yīng)以及肺的順應(yīng)性[17]；上皮細(xì)胞增殖和凋亡異常則導(dǎo)致氣道病變[18]；蛋白磷酸酶2A(PP2A)是調(diào)節(jié)慢性阻塞性肺疾病炎癥的關(guān)鍵因素[19]。KEGG通路分析顯示，三子養(yǎng)親湯涉及的通路與癌癥相關(guān)，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)慢性阻塞性肺疾病是肺癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，且在炎癥、氧化應(yīng)激、基因損傷修復(fù)以及免疫中存在相同機(jī)制[20]，提示三子養(yǎng)親湯或可改善其遠(yuǎn)期結(jié)局。同時(shí)，KEGG分析所涉及的NOD受體通路參與固有免疫，T細(xì)胞受體通路參與特異性免疫，研究表明三子養(yǎng)親湯能夠通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡失調(diào)抑制哮喘大鼠的氣道炎癥[21]，提示三子養(yǎng)親湯可能對(duì)免疫應(yīng)答具有調(diào)控作用。Jak-STAT信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖，既往研究表明三子養(yǎng)親湯聯(lián)合西醫(yī)治療哮喘可改善氣道重塑[22-23]，提示三子養(yǎng)親湯對(duì)氣道重塑的調(diào)控。

綜上所述，三子養(yǎng)親湯治療慢性阻塞性肺疾病，可能通過靶向基因NCOA2、Akt1、PTGS1/2、MAPK1/14、RELA等，調(diào)控磷酸化和核受體活性，調(diào)控T細(xì)胞受體通路、NOD樣受體通路、Jak-STAT通路等，調(diào)節(jié)上呼吸道平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增殖與凋亡，炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮治療作用。