黃玉玲， 李 玲， 楊玉玲， 楊清松， 彭翠仙， 田迎秋

(1.文山州農(nóng)業(yè)科學院，云南 文山 663099；2.文山學院三七醫(yī)藥學院，云南 文山 663099)

三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen是五加科人參屬的藥用植物，但由于鑒別和認識能力不足，民間將分布區(qū)存在重疊的姜狀三七Panaxzingiberensis、屏邊三七Panaxstipuleanatus等此類三七近緣種統(tǒng)稱為野三七。為合理有效利用三七及其近緣種資源，有必要對其進行準確分類及鑒定。

DNA條形碼(DNA barcoding)分子鑒定技術(shù)是由動物學家Paul Hebert[1]于2003年提出的，是利用基因組中一段標準的、相對較短的、具有足夠變異的、易擴增的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術(shù)。Hollingsworth等[2]建議將質(zhì)體片段matK、rbcL、psbA-trnH作為植物的通用條形碼，并推薦將matK和rbcL聯(lián)合使用。錯用和混用藥材威脅用藥安全，分子鑒定技術(shù)能從分子水平提供鑒別依據(jù)以減少錯用和混用現(xiàn)象，已成為目前藥材鑒定的熱點，如蔣超等[3]采用多重位點特異性PCR鑒別人參、三七、西洋參的摻雜問題，魏妙潔等[4]采用ITS2序列準確鑒定出市售三七片的原料藥材，基于ITS2序列可準確鑒別出藏柴胡及其易混品[5]、人參與西洋參[6]、九里香藥材及其近緣物種[7]、東北透骨草及其混偽品[8]，基于ITS序列可準確鑒定北柴胡種子及其混偽品[9]，采用ITS2及psbA-trnH可準確鑒別出雞血藤及其混偽品[10]、白頭翁及混偽品[11]、含巖白菜素藥用植物[12]。雖然DNA條形碼技術(shù)在人參屬物種鑒定中已有應用[13]，但由于相近類群單位點的DNA條形碼缺乏足夠的變化，所以不能鑒別所有種。與通用DNA條形碼相比，rDNA明顯提高了物種鑒定能力[14]，因此，為區(qū)分三七及其文山地區(qū)常見的易混淆種姜狀三七和屏邊三七，本研究綜合使用質(zhì)體片段及核片段，對ITS、matK、psbA-trnH序列進行擴增、測序及分析，探討這三個片段用于三者鑒別的可行性，以期建立快速準確的分子鑒定方法。

1 材料

三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen、屏邊三七Panaxstipuleanatus、姜狀三七Panaxzingiberensis共17批，采自云南文山、馬關(guān)、金平等地，經(jīng)中國科學院昆明植物研究所紀運恒博士鑒定為正品，具體信息見表1。

2 方法

2.1 DNA提取 采用改良型CTAB法。

2.2 PCR擴增和測序 采用人參屬DNA條形碼候選序列[15]中信息位點數(shù)較多、片段長度較短的ITS、matK、psbA-trnH進行分析，引物信息見表2。PCR擴增反應條件為總體積25 μL，其中dNTP 1 μL(10 mmol/L)、Taq Buffer(with MgCl2)2.5 μL(10X)、引物各1 μL(10 μmol/L)、Taq酶0.2 μL(5 U/μL)、模板DNA 1～2 μL(20～50 ng/μL)；擴增程序為預變性95 ℃ 5 min(變性94 ℃ 30 s，退火58～59 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 60 s)×38個循環(huán)，修復延伸72 ℃ 10 min。測序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物為PCR擴增中的正向、反向引物(雙向測序)。

表1 樣品信息

表2 引物信息

2.3 序列處理與數(shù)據(jù)分析 應用Geneious Prime軟件對17批樣品的測序結(jié)果進行拼接和比對，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，再通過MEGAX64統(tǒng)計已比對序列的長度、變異位點及信息位點數(shù)量，并計算其K2P遺傳距離。為確定物種鑒定成功率，即檢驗同一物種的不同個體能否聚類到一起，采用MEGAX64建立NJ樹，通過Kimura兩參數(shù)模型(Kimura 2-parameter model)重復1 000次的靴帶分析法(Bootstrap method)進行，Gaps和Missing data采用配對狀態(tài)刪除(pairwise deletion)。NJ樹上每個物種形成單系、支持率不低于50%的物種則認為鑒定成功，并且統(tǒng)計各候選片段的的擴增成功率、測序成功率、物種鑒定成功率。

3 結(jié)果

3.1 PCR擴增與測序 見表3。

表3 3個DNA條形碼特征比較

3.2 序列變異 如表3所示，ITS的比對長度為611 bp，變異位點、信息位點數(shù)分別為45、40，所占比例分別為7.36%、6.55%，在3個片段中變異最大；psbA-trnH的比對長度為508 bp，在3個片段中長度最短，變異位點、信息位點數(shù)均為16，所占比例為3.15%；matK比對長度為799 bp，變異位點、信息位點數(shù)分別為18、16，所占比例分別為2.25%、2.00%，是3個片段中變異最小的。

在種內(nèi)種間平均遺傳距離上，4個片段的種間分歧均大于種內(nèi)分歧，均滿足條形碼標準。其中，ITS的種間平均變異(0.044 105)、種內(nèi)平均變異(0.001 371)大于另外2個片段，psbA-trnH次之(0.017 859、0.000 931)，matK最小(0.013 631、0.000 278)。綜上所述，ITS、psbA-trnH、matK序列種內(nèi)種間平均遺傳距離差異較大，均適合作為三七及其兩個近緣種鑒別的DNA條形碼。

PCR成功率變化范圍在94.12%～100.00%之間，測序成功率變化范圍在93.75%～94.12%之間。3個片段中psbA-trnH、matK的PCR成功率達100%，單次測序成功率均為94.12%；ITS的PCR成功率和測序成功率較psbA-trnH、matK稍低，分別為94.12%、93.75%。

3.3 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹 ITS片段在人參屬6個種中的物種鑒定成功率為100%。除人參(Panaxginseng)、西洋參(Panaxquinquefolius)外，三七(Panaxnotoginseng)、屏邊三七(Panaxstipuleanatus)、姜狀三七(Panaxzingiberensis)、疙瘩七(Panaxjaponicasvar.bipinnatifidus)支持率均大于90%，即得到成功鑒定，見圖1。

psbA-trnH片段在人參屬6個種的物種鑒定中，僅姜狀三七(Panaxzingiberensis)、三七(Panaxnotoginseng)支持率大于90%，屏邊三七(Panaxstipuleanatus)也得到準確鑒定，支持率為79%，見圖2。

matK片段在屏邊三七(Panaxstipuleanatus)、假人參(Panaxpseudo-ginseng)、三七(Panaxnotoginseng)的鑒定中，支持率均大于80%，均得到成功鑒定，見圖3。

4 討論

由于三七(Panaxnotoginseng)、姜狀三七(Panaxzingiberensis)、屏邊三七(Panaxstipuleanatus)在形態(tài)特征上相似且化學成分存在差異，為保證三七用藥的安全性，有必要對三者進行準確鑒別，由于傳統(tǒng)鑒定方法多是基于形態(tài)學特征，依賴長期經(jīng)驗的積累，物種鑒定困難。本研究通過分析三七及其近緣種的3個DNA條形碼的特征，計算物種的種內(nèi)、種間遺傳距離，評估序列的barcoding gaps，使用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹等方法來評估3個DNA條形碼在三七及其兩個近緣種鑒定中的適用性。實驗結(jié)果表明，綜合引物通用性、序列變異、信息位點、種內(nèi)種間平均遺傳距離、擴增成功率及測序成功率、物種鑒定成功率等方面，可知ITS片段和psbA-trnH片段可用于三七(Panaxnotoginseng)、姜狀三七(Panaxzingiberensis)及屏邊三七(Panaxstipuleanatus)的分子鑒定中，matK可用于鑒別三七(Panaxnotoginseng)和屏邊三七(Panaxstipuleanatus)。雖psbA-trnH的物種鑒定率稍低(50%)，但這可能是由于疙瘩七(Panaxjaponicasvar.bipinnatifidus)、人參(Panaxginseng)、西洋參(Panaxquinquefolius)的個體數(shù)過少(1～2個個體)導致的，加大取樣量可能有助于解決鑒定率低的問題，未來可通過加大取樣量來提高鑒定的準確性。

綜上所述，ITS在3個片段中的序列變異最大(有45個變異位點和40個信息位點)，物種鑒定率最高(100%)，可作為三七(Panaxnotoginseng)、姜狀三七(Panaxzingiberensis)、屏邊三七(Panaxstipuleanatus)的快速鑒定條形碼；psbA-trnH雖物種鑒定率稍低(50%)，但三七(Panaxnotoginseng)、姜狀三七(Panaxzingiberensis)、屏邊三七(Panaxstipuleanatus)均得到了準確鑒定；matK能準確鑒別出三七(Panaxnotoginseng)及其屏邊三七(Panaxstipuleanatus)，可用于三七及其屏邊三七的物種鑒定。三七具有較高的藥用價值和經(jīng)濟價值，分子鑒定的開展有助于解決產(chǎn)品摻假等問題，進而維持市場穩(wěn)定、保護消費者權(quán)益。