鄭 奕， 閆樂玉， 陳 艷， 徐小波*

(1.黃淮學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 駐馬店 463000；2.黃淮學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000；3.黃淮學(xué)院建筑工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

常春藤皂苷元是從藤梨根、威靈仙等植物中提取的一種齊墩果烷型單萜類化合物，具有抗腫瘤等作用，可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[1]。在喉癌細(xì)胞中，lncRNA PCAT19呈高表達(dá)，并可通過調(diào)節(jié)miR-182/PDK4促進(jìn)細(xì)胞增殖[2]。靶基因預(yù)測軟件LncBase預(yù)測顯示，PCAT19與miR-4319有結(jié)合位點(diǎn)，并且后者在甲狀腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[3]，但PCAT19/miR-4319對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，本研究探討常春藤皂苷元是否通過調(diào)控PCAT19/miR-4319表達(dá)影響甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為，以期為甲狀腺癌治療藥物的研發(fā)提供新方向。

1 材料

1.1 細(xì)胞 甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞，購自通派(上海)生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 常春藤皂苷元(純度>98%)購自成都曼思特生物科技有限公司，溶于DMSO中備用。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT試劑、BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒、BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑、pcDNA均購自美國Invitrogen公司；miR-4319模擬物(miR-4319 mimics)、mimic NC序列(miR-NC)、PCAT19干擾RNA(si-PCAT19)、陰性對(duì)照(si-NC)均購自廣州市銳博生物科技有限公司；PCAT19過表達(dá)(pcDNA-PCAT19)購自吉滿生物科技(上海)有限公司；Matrigel購自美國BD公司；Transwell購自美國Corning公司；兔抗人Twist、Snail、N-cadherin、E-cadherin抗體和二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.3 儀器 Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)、Multiskan Sky 酶標(biāo)儀均購自美國Thermo Fisher公司；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；CO2培養(yǎng)箱購自濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、分組及給藥 取對(duì)數(shù)期TPC-1細(xì)胞接種于96孔板，用5、10、20 μg/mL常春藤皂苷元培養(yǎng)24 h[4]，分別作為常春藤皂苷元低、中、高劑量組，將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。si-NC、si-PCAT19轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞，6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別作為si-NC組、si-PCAT19組。pcDNA、pcDNA-PCAT19分別轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞，6 h后將培養(yǎng)基更換為含有20 μg/mL常春藤皂苷元的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別作為pcDNA組、pcDNA-PCAT19組。

2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖 各組TPC-1細(xì)胞接種于96孔板，每孔加20 μL MTT溶液培養(yǎng)4 h，棄上清，加150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處光密度(OD)值。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 各組TPC-1細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液(1×104/mL)，將細(xì)胞收集于流式管中，離心5 min后棄上清，加入300 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再加入700 μL無水乙醇，置于-20 ℃冰箱中固定24 h，1 572×g離心30 s后棄上清，PBS洗滌后加入400 μL PI染色液染色10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期占比。

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲能力 在上室中加40 μL Matrigel稀釋液，加入含有TPC-1細(xì)胞(1×104個(gè))、不含血清的培養(yǎng)基200 μL，下室加500 μL含有胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞。在遷移實(shí)驗(yàn)操作過程中，小室的上室不加入Matrigel基質(zhì)膠。

2.5 RT-qPCR檢測PCAT19、miR-4319 mRNA表達(dá) 采用TRIzol試劑提取各組TPC-1細(xì)胞總RNA，按照BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，按照BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix 說明書配制反應(yīng)體系，采用2-ΔΔCT法檢測目的基因相對(duì)表達(dá)。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測PCAT19、miR-4319的靶向關(guān)系 將PCAT19野生型/突變型(WT/MUT)克隆至pmirGLO載體中，分別將miR-NC、miR-4319 mimics、WT-PCAT19、MUT-PCAT19轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞，24 h后用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pcDNA、pcDNA-PCAT19、si-NC、si-PCAT19轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞，24 h后用RT-qPCR法檢測miR-4319的表達(dá)。

2.7 Western blot檢測Twist、Snail、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá) 收集各組TPC-1細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞，100 ℃水浴10 min，13 700×g離心10 min，取上清，即得總蛋白，檢測其濃度。配制12%分離膠與濃縮膠，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入Twist(1∶1 000)、Snail(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)一抗和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000)稀釋液，在4 ℃下孵育過夜，加二抗稀釋液(1∶10 000)室溫孵育1 h，采用Image J軟件分析各條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 常春藤皂苷元對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖及周期的影響 與對(duì)照組比較，常春藤皂苷元各劑量組細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例降低(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表1。

表1 常春藤皂苷元對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

3.2 常春藤皂苷元對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 與對(duì)照組比較，常春藤皂苷元各劑量組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，Twist、Snail、N-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖1、表2。

3.3 常春藤皂苷元對(duì)TPC-1細(xì)胞中l(wèi)ncRNAPCAT19、miR-4319表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，常春藤皂苷元各劑量組PCAT19表達(dá)降低(P<0.05)，miR-4319表達(dá)升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表3。

3.4PCAT19與miR-4319的靶向關(guān)系 LncBase預(yù)測顯示，PCAT19與miR-4319存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2A。與miR-NC組比較，過表達(dá)miR-4319降低WT-PCAT19熒光素酶活性(P<0.05)，見圖2B。PCAT19可負(fù)向調(diào)控miR-4319表達(dá)，見圖2C。

表2 常春藤皂苷元對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移及侵襲的影響

表3 常春藤皂苷元對(duì)TPC-1細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PCAT19、miR-4319表達(dá)的影響

3.5 抑制PCAT19表達(dá)對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移及侵襲能力的影響 與si-NC組比較，si-PCAT19組細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例、E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Twist、Snail、N-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；2組間G2/M期細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3、表4。

3.6 上調(diào)PCAT19表達(dá)可逆轉(zhuǎn)常春藤皂苷元對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移及侵襲的作用 與pcDNA組比較，pcDNA-PCAT19組miR-4319表達(dá)降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例降低(P<0.05)，S期細(xì)胞比例升高(P<0.05)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，Twist、Snail、N-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖4、表5。

表4 抑制PCAT19表達(dá)對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移及侵襲的影響

表5 上調(diào)PCAT19表達(dá)逆轉(zhuǎn)常春藤皂苷元對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移及侵襲的作用

4 討論

甲狀腺癌細(xì)胞的高度轉(zhuǎn)移能力導(dǎo)致患者預(yù)后較差，且患者生存期縮短，越來越多的研究表明部分中藥可減緩甲狀腺癌的發(fā)展進(jìn)程，其可通過多途徑或調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)而達(dá)到治療目的[5-6]。lncRNA在甲狀腺癌中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，并可能發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，當(dāng)癌基因活化或抑癌基因失活時(shí)均可能促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展，通過調(diào)控lncRNA表達(dá)可逆轉(zhuǎn)甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)而抑制其發(fā)生發(fā)展[7-8]。

常春藤皂苷元可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。常春藤皂苷元可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。常春藤皂苷元還可通過抑制順鉑耐藥性頭頸癌細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)其對(duì)順鉑的敏感性[11]。但常春藤皂苷元對(duì)甲狀腺癌的研究尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，常春藤皂苷元以劑量依賴性地降低甲狀腺癌細(xì)胞存活率，并可誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞比例升高，而降低S期細(xì)胞比例，提示常春藤皂苷元可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期而抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)錄因子Twist、Snail與細(xì)胞遷移調(diào)控相關(guān)，是調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要轉(zhuǎn)錄因子，EMT主要是指在某些條件下，具有極性的上皮細(xì)胞失去極性轉(zhuǎn)化成間充質(zhì)細(xì)胞，從而促使遷移及侵襲發(fā)生，Twist、Snail、N-cadherin表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)降低可促進(jìn)EMT發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移[12]。本研究結(jié)果顯示，常春藤皂苷元處理后甲狀腺癌遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，Twist、Snail、N-cadherin蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高，提示常春藤皂苷元可抑制甲狀腺癌細(xì)胞遷移及侵襲，但常春藤皂苷元調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量常春藤皂苷元處理后甲狀腺癌細(xì)胞中PCAT19表達(dá)降低，miR-4319表達(dá)升高。研究表明抑制PCAT19表達(dá)可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲[13]，沉默PCAT19可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[14]。本研究結(jié)果顯示，抑制PCAT19表達(dá)可降低甲狀腺癌細(xì)胞存活率，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，還可抑制細(xì)胞遷移及侵襲，提示PCAT19高表達(dá)可通過調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為而促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究進(jìn)一步證實(shí)PCAT19可靶向結(jié)合miR-4319。研究表明miR-4319可通過靶向ABTB1而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[15]。在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞[16]、乳腺癌[17]中miR-4319表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-4319表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。本研究顯示，上調(diào)PCAT19表達(dá)可通過抑制miR-4319表達(dá)而逆轉(zhuǎn)常春藤皂苷元對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用，提示PCAT19/miR-4319可能介導(dǎo)常春藤皂苷元調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為過程。

綜上所述，常春藤皂苷元可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，其作用機(jī)制與抑制PCAT19表達(dá)及促進(jìn)miR-4319表達(dá)有關(guān)。