魏丹妮， 彭 穎， 馬 萍， 李曉波

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

急性肺損傷是臨床常見的由細(xì)菌或病毒等感染后所導(dǎo)致的急性炎癥性疾病[1]，其病程快、發(fā)病急且致死率高，失控的炎癥反應(yīng)是急性肺損傷最重要的發(fā)病機(jī)制之一[2]。臨床敗血癥并發(fā)急性肺損傷患者常經(jīng)歷早期“炎癥風(fēng)暴”狀態(tài)后逐漸向免疫抑制狀態(tài)過(guò)渡，出現(xiàn)促炎因子和抗炎因子分泌嚴(yán)重受阻及免疫功能障礙，機(jī)體最終因無(wú)力清除致病菌而死亡[3-5]。急性肺損傷缺乏特效治療藥物，目前大多采用保護(hù)性機(jī)械通氣、ECMO和微循環(huán)等支持治療，抗生素和中成藥進(jìn)行輔助治療[6-7]，其中抗生素常用于治療合并肺部和其他器官感染[8-9]，但其作用效能存在較大差異，需依病情選擇性治療[10]；一些清熱解毒類中成藥具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等藥理作用[11]，也在多種急性炎癥性疾病治療中具有一定優(yōu)勢(shì)[12-13]。

炎寧糖漿由鹿茸草、白花蛇舌草、鴨拓草3味中藥組成，具有清熱解毒、消炎止痢之功效[14]，臨床上廣泛用于治療上呼吸道感染、尿路感染、腸炎等多種疾病。前期小鼠耳腫脹和大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)證實(shí)，炎寧糖漿總提取物對(duì)急性或炎癥早期毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性亢進(jìn)、滲出、水腫等具有明顯的抑制作用[15-16]，但尚無(wú)治療急性肺損傷的報(bào)道。本文采用腹腔注射脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠模型，比較炎寧糖漿、臨床常用抗生素(阿莫西林、阿奇霉素和左氧氟沙星)以及常用中成藥(蒲地藍(lán)消炎口服液、連花清瘟膠囊)對(duì)大鼠的改善作用，以期為急性肺損傷的用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量230～290 g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(浙)2019-0001，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由攝食飲水，12 h照明，溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度(55±10)%。所有操作均由上海交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查通過(guò)后開展(審查編號(hào)A2018100)。

1.2 試劑與藥物 炎寧糖漿(批號(hào)1704003)，購(gòu)自哈爾濱市康隆藥業(yè)有限責(zé)任公司；阿莫西林(批號(hào)1809015)，購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠；阿奇霉素(批號(hào)200501)，購(gòu)自天津市健生制藥有限公司；左氧氟沙星(批號(hào)BX007A1)，購(gòu)自第一三共制藥(北京)有限公司；蒲地藍(lán)消炎口服液(批號(hào)1809613)，購(gòu)自濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司；連花清瘟膠囊(批號(hào)A1801193)，購(gòu)自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司。LPS(批號(hào)028M4094V)，購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；Bio-Plex Pro Rat Cytokine 23-Plex Assay試劑盒(批號(hào)12005641)，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；Rat IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α High Sensitivity ELISA Kit(貨號(hào)70-EK380HS-96、70-EK302HS-96、70-EK304HS-96、70-EK306HS-96、70-EK310HS-96、70-EK317HS-96、70-EK382HS-96)，購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技股份有限公司；BCA試劑盒(貨號(hào)PC0020)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器 SYSMEX pocH-100iV Diff 全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀，購(gòu)自希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司；Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BX53M工業(yè)正置顯微鏡，購(gòu)自?shī)W林斯巴(中國(guó))有限公司；電子天平，購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Bio-Plex MAGPIX System，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為10組，即空白組，模型組，炎寧糖漿低、中、高劑量組，阿莫西林組，阿奇霉素組，左氧氟沙星組，蒲地藍(lán)消炎口服液組，連花清瘟膠囊組，空白組大鼠腹腔注射生理鹽水，模型組、給藥組大鼠腹腔注射LPS(8 mg/kg)，3 h后給藥組大鼠灌胃給予不同藥物，連續(xù)3 d，模型組和空白組大鼠灌胃等量蒸餾水，具體見表1。

表1 大鼠分組及給藥方案

2.2 樣本采集 實(shí)驗(yàn)期間，觀察并記錄大鼠造模前后及給藥后體質(zhì)量、毛色、活躍度、飲食飲水量、大便性狀、死亡情況等指標(biāo)，計(jì)算死亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹主動(dòng)脈取血，取全血1 mL，采用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)(血小板、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中間細(xì)胞、粒細(xì)胞密度)。另取大鼠全血7 mL至促凝管中，在4 ℃下靜置過(guò)夜，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清分裝，在-80 ℃下保存，結(jié)扎右肺下葉和支氣管進(jìn)行灌洗，摘取肺和腸組織，在-80 ℃下保存，用于后續(xù)研究。

2.3 大鼠肺組織濕干重比檢測(cè) 取大鼠右肺下葉，濾紙吸干肺表面滲液和血跡，電子天平稱定質(zhì)量，即濕重，再將其置于65 ℃烘箱中72 h至恒重，即干重，計(jì)算濕干重比。

2.4 大鼠肺組織病理變化觀察 大鼠肺組織置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后，在顯微鏡下觀察病理變化。參照美國(guó)胸科學(xué)會(huì)[17]及文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道，對(duì)各組大鼠肺損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體見表2。

表2 大鼠肺損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.5 大鼠肺組織細(xì)胞因子檢測(cè) 大鼠右肺中葉勻漿后，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液分裝，在-80 ℃下保存，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α水平。

2.6 大鼠血清細(xì)胞因子檢測(cè) 大鼠全血離心取血清，按照Bio-Plex Pro Rat Cytokine 23-Plex Assay試劑盒說(shuō)明書，通過(guò)Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α水平。

3 結(jié)果

3.1 炎寧糖漿與5種常用藥物對(duì)大鼠體征及死亡率的影響 如圖1A所示，LPS誘導(dǎo)后大鼠初期體質(zhì)量均下降，出現(xiàn)不同程度精神萎靡，弓背、易驚、蜷臥，進(jìn)食減少，部分出現(xiàn)大便溏瀉。給藥期間，模型組大鼠仍精神萎靡，眼角和鼻部流出較多血性分泌物，大便干結(jié)難解甚至便血，說(shuō)明LPS誘導(dǎo)后大鼠體征狀況不佳并伴有充血性反應(yīng)。炎寧糖漿中、高劑量組和阿奇霉素組大鼠較模型組活動(dòng)增多，反應(yīng)靈敏，行為學(xué)狀態(tài)明顯恢復(fù)；炎寧糖漿低劑量組、左氧氟沙星組和中成藥(蒲地蘭口服液、連花清瘟膠囊)組大鼠行為學(xué)狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)但不及炎寧糖漿中、高劑量組和阿奇霉素組；阿莫西林組大鼠行為學(xué)狀態(tài)較模型組無(wú)明顯變化。給藥結(jié)束后，模型組大鼠體質(zhì)量低于空白組(P<0.05)；與模型組比較，炎寧糖漿和阿奇霉素均能升高大鼠體質(zhì)量(P<0.05，P<0.01)，左氧氟沙星組和中成藥組大鼠體質(zhì)量有所回升，阿莫西林組大鼠體質(zhì)量降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

經(jīng)LPS造模后，模型組大鼠死亡率達(dá)42.9%；連花清瘟膠囊組和炎寧糖漿中、低劑量組大鼠死亡率較低，分別為16.7%、25.0%、33.3%，見圖1B。由此提示，炎寧糖漿和阿奇霉素對(duì)大鼠體質(zhì)量和行為學(xué)恢復(fù)具有較好的改善作用，連花清瘟膠囊和炎寧糖漿中、低劑量均可一定程度緩解LPS對(duì)大鼠造成的毒性，分別降低了61.07%、41.72%、22.38%。

3.2 炎寧糖漿與5種常用藥物對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響 如表3所示，與空白組比較，模型組大鼠全血中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中間細(xì)胞和粒細(xì)胞密度均升高(P<0.05)，血小板密度降低了約82.57%(P<0.01)，表明大鼠機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，而且免疫功能出現(xiàn)紊亂。與模型組比較，炎寧糖漿組和阿奇霉素組大鼠血小板密度均呈升高趨勢(shì)，其中炎寧糖漿高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，阿奇霉素組大鼠全血中間細(xì)胞、粒細(xì)胞密度分別降低了60.00%、87.41%(P<0.05)，連花清瘟膠囊組大鼠全血中間細(xì)胞密度降低了52.00%(P<0.05)。炎寧糖漿與5種常用藥物對(duì)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用(P>0.05)，阿莫西林、左氧氟沙星和蒲地藍(lán)消炎口服液對(duì)大鼠5項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用(P>0.05)。以上結(jié)果表明，炎寧糖漿高劑量、阿奇霉素、連花清瘟膠囊對(duì)大鼠部分異常血常規(guī)指標(biāo)具有一定改善作用。

3.3 炎寧糖漿與5種常用藥物對(duì)大鼠肺水腫的改善作用 如表4所示，與空白組比較，模型組大鼠肺組織濕干重比升高了5.38%(P<0.05)，說(shuō)明大鼠肺水腫嚴(yán)重；與模型組比較，炎寧糖漿中劑量組大鼠肺組織濕干重比降低了4.32%(P<0.05)，其余各給藥組大鼠肺組織濕干重比有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中，阿莫西林組大鼠肺濕重低于模型組(P<0.05)，可能與阿莫西林組大鼠體質(zhì)量減輕有關(guān)。以上結(jié)果表明，炎寧糖漿中劑量在改善大鼠肺水腫方面可能優(yōu)于其他抗生素及中成藥。

表3 各組大鼠血常規(guī)指標(biāo)

表4 各組大鼠肺組織濕干重比

3.4 炎寧糖漿與5種常用藥物對(duì)大鼠肺組織病理變化的影響 如圖2所示，與空白組比較，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡腔和肺組織間質(zhì)內(nèi)伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔偶見透明膜形成，亦可見蛋白質(zhì)殘留物，且模型組大鼠肺損傷評(píng)分升高(P<0.01)，表明大鼠肺部病理?yè)p傷嚴(yán)重。與模型組比較，炎寧糖漿中、高劑量組、阿奇霉素組和蒲地蘭消炎口服液組大鼠肺泡壁變薄，肺泡壁和肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量及肺泡腔內(nèi)透明膜和蛋白質(zhì)碎片減少，肺損傷評(píng)分降低(P<0.05，P<0.01)；炎寧糖漿低劑量組、阿莫西林組、左氧氟沙星組和連花清瘟膠囊組大鼠恢復(fù)程度不如其他給藥組，肺泡腔和肺組織間質(zhì)內(nèi)有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺損傷評(píng)分無(wú)明顯變化(P>0.05)。以上結(jié)果表明，中、高劑量炎寧糖漿、阿奇霉素及蒲地蘭消炎口服液對(duì)大鼠肺組織形態(tài)異常的改善作用可能較其他給藥組更為明顯。

3.5 炎寧糖漿與5種常用藥物對(duì)大鼠血清、肺組織細(xì)胞因子的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清Th1型(IFN-γ)、Th2型(IL-2、IL-4)、Th17型(IL-17A)、Treg型(IL-10)、IL-6水平均降低(P<0.01)，而模型組大鼠肺組織上述7種細(xì)胞因子水平均無(wú)明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，炎寧糖漿能上調(diào)血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17A水平(P<0.05，P<0.01)，阿奇霉素能上調(diào)血清IL-4、IL-10水平(P<0.05)，左氧氟沙星能上調(diào)血清IL-17A水平(P<0.05)，蒲地藍(lán)消炎口服液能上調(diào)血清IL-2、IL-4、IL-17A水平(P<0.05，P<0.01)，見圖3。與模型組比較，炎寧糖漿能下調(diào)肺組織IL-6水平(P<0.05)，阿奇霉素能上調(diào)肺組織IL-17A水平(P<0.05)，蒲地蘭消炎口服液能下調(diào)肺組織IL-2、IL-6水平(P<0.05，P<0.01)，連花清瘟膠囊能下調(diào)肺組織IL-6、IL-10水平(P<0.01)，而阿莫西林對(duì)大鼠血清和肺組織上述7種細(xì)胞因水平子均無(wú)顯著調(diào)節(jié)作用(P>0.05)，見圖4。上述結(jié)果提示，炎寧糖漿、蒲地蘭口服液均能較好地改善大鼠血清中免疫抑制狀況，促進(jìn)血液中受阻的Th1型、Th2型和Th17型細(xì)胞因子分泌，從而一定程度上恢復(fù)機(jī)體免疫平衡。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制及嚴(yán)重免疫功能障礙常發(fā)生于臨床敗血癥并發(fā)急性肺損傷患者后期，患者脾臟細(xì)胞出現(xiàn)促炎因子和抗炎因子分泌大量減少，嚴(yán)重威脅患者生存[3-5]。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后模型組大鼠血清中多種促炎因子和抗炎因子分泌嚴(yán)重受阻，表明機(jī)體發(fā)生免疫功能障礙且處于全身性免疫抑制及繼發(fā)性低炎狀態(tài)中。與血清細(xì)胞因子不同，模型組大鼠肺組織多種細(xì)胞因子與空白組比無(wú)明顯差異，推測(cè)可能作為急性肺損傷最早受累且損傷最嚴(yán)重的器官[20]，肺臟仍處于“高炎”向“低炎”過(guò)渡階段，較急性肺損傷機(jī)體血液系統(tǒng)恢復(fù)更緩慢。

中藥對(duì)大鼠改善作用研究多采用預(yù)防給藥模式[21-23]，與臨床差異較大。本研究采用腹腔注射LPS大鼠模型，模擬臨床多發(fā)的由肺外因素導(dǎo)致急性肺損傷的發(fā)病特征，同時(shí)結(jié)合“先病后治”特點(diǎn)，在造模后給予不同藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中、高劑量炎寧糖漿可減輕肺組織病理?yè)p傷，在減輕急性肺損傷大鼠肺水腫和改善血小板減少方面作用較突出，但在改善白細(xì)胞水平方面不及阿奇霉素和連花清瘟膠囊。炎寧糖漿能有效逆轉(zhuǎn)多種炎癥因子如IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17A等異常分泌，以高劑量作用最顯著。研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ、IL-2主要由Th1細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，發(fā)揮對(duì)抗胞外病原菌作用，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答[24-25]。IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，能促進(jìn)抗體生成并介導(dǎo)體液免疫。IL-17A是Th17細(xì)胞特異性分泌的細(xì)胞因子，不僅可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在炎癥部位聚集，還能延遲活化的中性粒細(xì)胞在炎癥部位凋亡，但也可能導(dǎo)致組織損傷[26-27]。因此推測(cè)炎寧糖漿可能通過(guò)促進(jìn)急性肺損傷大鼠免疫抑制狀態(tài)下Th型和Treg型細(xì)胞因子分泌以促進(jìn)機(jī)體免疫功能恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素(大環(huán)內(nèi)酯類抗生素)對(duì)大鼠的改善作用較其他2種抗生素更突出，主要體現(xiàn)在改善急性肺損傷大鼠肺組織結(jié)構(gòu)，逆轉(zhuǎn)大鼠血液中白細(xì)胞及炎癥因子水平的異常變化等。連花清瘟膠囊、蒲地蘭消炎口服液和左氧氟沙星(喹諾酮類抗生素)對(duì)大鼠部分異常指標(biāo)具有一定調(diào)控作用。此外，連花清瘟膠囊在降低動(dòng)物致死率方面作用突出，但在其他藥效指標(biāo)上不及炎寧糖漿和阿奇霉素，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。阿莫西林(β-內(nèi)酰胺類抗生素)對(duì)LPS誘導(dǎo)后大鼠各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯調(diào)控作用。不同藥物調(diào)控急性肺損傷大鼠血清與肺組織細(xì)胞因子的種類和程度存在差異，可能與藥物特性有關(guān)。而3種中成藥雖對(duì)血清中IL-6無(wú)顯著調(diào)控作用，但均能降低肺組織IL-6水平，可能通過(guò)中藥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)控肺臟，從而加快靶器官渡過(guò)“高炎期→低炎期”的機(jī)體修復(fù)進(jìn)程。

綜上所述，抗生素阿奇霉素較阿莫西林和左氧氟沙星更有效減輕LPS誘導(dǎo)后大鼠癥狀；中成藥(炎寧糖漿、蒲地蘭消炎口服液和連花清瘟膠囊)對(duì)大鼠均具有一定改善作用但特點(diǎn)不同，其中，炎寧糖漿在改善急性肺損傷大鼠肺水腫、血小板減少、多種炎癥因子分泌失調(diào)等方面發(fā)揮了較好作用。