覃冬杰， 張 鵬， 鐘文俊， 覃華亮， 劉永逸*

(1.柳州市質量檢驗檢測研究中心，廣西 柳州 545006；2.廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)集團股份公司，廣西 柳州 545007)

陳香露白露片由陳皮、川木香等9種藥材組成，具有健胃和中、理氣止痛的功效[1]，因處方中陳皮易發(fā)霉變質，而且所有藥材均為生粉入藥，故根據(jù)2020年版《中國藥典》規(guī)定，處方中含有易污染的藥材及生粉投料的中成藥品種應注意相關真菌毒素的檢測[2]。

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的有毒代謝物，對人體有致畸、致癌、致突變作用[3-6]，較為成熟的相關檢測方法有氣相色譜法[7]、液相色譜法[8]、液質聯(lián)用法[9]。其中，液質聯(lián)用法以其高靈敏度、高選擇性、多目標物同時檢測的優(yōu)點，成為了目前常用手段。在前處理方面，大多采用固相萃取柱[10-12]、分散固相萃取[13-15]凈化，其中QuEChERS法以其快速、簡便、廉價、有效、耐用、安全、回收率高等優(yōu)點，正越來越多地應用于真菌毒素的檢測。因此，本實驗采用QuEChERS-LC-MS/MS聯(lián)用技術測定陳香露白露片中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，以期為評價該制劑安全性提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-30AD超高效液相色譜儀(日本島津公司)；Triple Quad 4500三重四極桿質譜儀(美國AB SCIEX公司)；SK8200HP超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)；3-3OK臺式高速離心機(德國Sigma-Aldrich公司)；VIBRAX VXR振蕩器(德國IKA集團)；TTL-DCII型氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；XP26電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；24 UV超純水器(德國默克密理博公司)。

1.2 材料 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對照品，純度均大于95%，購于青島普瑞邦生物工程有限公司。13C18-玉米赤霉烯酮(25 μg/mL)、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(25 μg/mL)標準溶液均購于美國Romer Labs公司。陳香露白露片共20批，由廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)集團股份公司提供，批號分別為20190402、20190705、20190922、20191001、20191106、20200102、20200301、20200502、20200522、20200630、20200701、20200715、20200724、20200817、20201101、20201103、20201105、20201106、20201109、20201114。流動相所用甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國Thermo Fisher公司；其余試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 Boltimate C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；流動相[0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸銨](A)-[甲醇-乙腈(1∶1)](B)，梯度洗脫(0～2.0 min，95%A；2.0～2.1 min，95%～60%A；2.1～7.0 min，60%～45%A；7.0～10.0 min，45%～10%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。

2.1.2 質譜條件 電化學噴霧ESI離子源；正、負離子模式，多反應監(jiān)測(MRM)模式采集；離子源溫度550 ℃；氣簾壓力25 psi(1 psi=0.133 kPa)；霧化器壓力45 psi；輔助加熱器壓力55 psi。質譜參數(shù)見表1，MRM色譜圖見圖1。

表1 各真菌毒素質譜參數(shù)

2.2 對照品溶液制備 精密稱取黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素對照品適量，加甲醇制成質量濃度為5 μg/mL的單標貯備液；精密稱取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對照品適量，加甲醇制成質量濃度為500 μg/mL的單標貯備液，置于-20 ℃冰箱中備用；精密量取13C18-玉米赤霉烯酮、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液適量，加甲醇制成質量濃度分別為40、4 μg/mL的混合內標溶液，置于-20 ℃的冰箱中備用，即得。

2.3 供試品溶液制備 取片劑50片，研細，精密稱取2 g，置于50 mL離心管中，精密加入混合內標溶液100 μL，待溶劑揮干后精密加入乙腈-10%甲酸(9∶1)20 mL，超聲處理10 min，加入4 g無水MgSO4、1 g NaCl，渦旋2 min，10 000 r/min離心5 min，精密量取上清液5 mL至10 mL離心管中，加入100 mg C18、300 mg無水MgSO4，渦旋2 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液至10 mL離心管中，40 ℃氮氣吹至近干，加入初始流動相定容至1 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 基質效應 以基質標準曲線的斜率與溶劑標準曲線的斜率的比值來評價基質效應，發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分別為67.3%、70.5%、81.4%、84.5%、88.6%、68.9%、126.1%、131.0%、58.6%、65.8%，大部分有明顯的基質效應，故需采用基質標準曲線法進行定量分析。

2.5 線性關系考察 取空白樣品，按“2.3”項下方法處理，制備空白基質液，用以配制混合系列標準工作液，在“2.1”項條件下進樣測定。以各真菌霉素峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，再分別以各組分3、10倍基線噪音時所對應的質量濃度為檢出限、定量限，結果見表2，可知各真菌毒素在各自范圍內呈良好的線性關系。

表2 各真菌毒素線性關系

2.6 方法學考察 取空白樣品，加入一定量對照品溶液，按“2.3”項下方法分別制備低、中、高水平供試品溶液(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮添加水平為1、5、10 μg/kg，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素添加水平為10、50、100 μg/kg，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇添加水平為100、500、1 000 μg/kg)，每個水平平行6份。取中水平1份，在“2.1”項條件下進樣測定6次，計算精密度RSD；另取1份，于0、4、8、12、24 h在“2.1”項條件下進樣測定，計算穩(wěn)定性RSD；另取6份，在“2.1”項條件下進樣測定，計算重復性RSD；3種水平各取6份，在“2.1”項條件下進樣測定，計算回收率。結果，10種真菌毒素精密度RSD為0.7%～2.2%，穩(wěn)定性RSD為1.3%～3.3%，重復性RSD為0.9%～2.8%，平均加樣回收率為80.7%～109.6%，均符合相關要求。

2.7 樣品含量測定 以建立的方法對20批樣品進行測定，發(fā)現(xiàn)有2批檢出黃曲霉毒素B1，質量分數(shù)分別為0.6、0.7 μg/kg；有1批檢出赭曲霉毒素A，質量分數(shù)為3.3 μg/kg；其余真菌毒素均未檢出。

3 討論

3.1 前處理考察

3.1.1 提取條件 比較不同比例的乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)9∶1時回收率最高。進一步比較了不同pH值對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著甲酸加入，伏馬毒素B1、B2的回收率顯著提高，當以乙腈-10%甲酸(9∶1)為提取溶劑時，各真菌毒素回收率均大于80%。

3.1.2 凈化方式 比較了GCB、PSA、C18與無水MgSO4作為凈化材料對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)當加入GCB時，玉米赤霉烯酮回收率明顯下降；當加入PSA時，伏馬毒素B1、B2和赭曲霉毒素A回收率也明顯下降；僅用C18與無水MgSO4作為凈化材料時，有最好的凈化效果，回收率最高，最優(yōu)凈化材料為100 mg C18和300 mg無水MgSO4。

3.2 色譜條件考察 比較了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶1)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在甲醇-乙腈(1∶1)系統(tǒng)下各組分有較適宜的出峰時間，可在較短時間內完成分析測定。水相加入甲酸時，正離子模式組分的響應值明顯提高，但其體積分數(shù)過高時，負離子模式組分的響應值會降低；當加入甲酸銨時，情況則相反。由于本實驗是正負離子同時采集，為兼顧所有組分，最終以0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸銨作為水相，此時各真菌毒素響應值最高。

3.3 質譜條件考察 分別取各真菌毒素單標液，分別在正、負離子模式下進行母離子掃描，選取各自響應值最高的模式進行采集。二級質譜分析時，選取響應值高而穩(wěn)定的2個子離子分別作為定性、定量離子，通過儀器自動優(yōu)化最佳的去簇電壓和碰撞能量，使響應值最高。

4 結論

本實驗建立的方法簡便快速，準確靈敏，經(jīng)方法學驗證，各項指標均滿足分析要求，可作為陳香露白露片中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇10種真菌毒素含量的快速測定方法。