何沛霖， 涂如霞， 梅小利， 張 莉， 黃崇剛， 占敏霞， 陳 慧

(重慶市中藥研究院藥理毒理研究所，重慶 400065)

青蒿素及其衍生物是目前抗瘧藥物中作用最快和療效最高的一線抗瘧藥物[1-2]。雖然目前對(duì)青蒿素藥理作用的研究有了重要進(jìn)展，但其確切的機(jī)制仍有待闡明[3-6]。青蒿素除了具有抗寄生蟲的作用外，還具有抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用。雙氫青蒿素是水溶性好、吸收快、毒性較小及抗瘧作用明顯的具有良好開發(fā)前景的藥物[7-9]?；鸢鸦ǜ怯衫ッ魃胶Ｌ娜テず透竞蠖兄瞥傻闹谐伤?，具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抑制病理性免疫反應(yīng)作用，已被廣泛用于自身免疫性疾病的治療[10-12]。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種病因不明以炎性滑膜炎為主的慢性全身性疾病，以慢性、對(duì)稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)[13]，但其具體機(jī)制仍不明確。前期研究顯示雙氫青蒿素與火把花根配伍的免疫抑制作用強(qiáng)于單獨(dú)用藥，且毒性更低，但其作用機(jī)制尚不明確[14-15]，本文擬研究雙氫青蒿素與火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，以期為兩者聯(lián)合用藥在臨床治療中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 雙氫青蒿素(片)，昆藥集團(tuán)重慶武陵山制藥有限公司，批號(hào)C00120181113，含量100.4%，配制時(shí)滴加2～3滴吐溫-80碾磨后再用0.5% CMC-Na混勻稀釋至實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)量濃度；火把花根浸膏，重慶市中藥研究院中藥化學(xué)研究所，批號(hào)GST190501，每1 g浸膏含生藥量15.67 g，使用時(shí)加入0.5% CMC-Na碾磨混勻至實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)量濃度。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)211002300046310、211002300048140。檢疫及適應(yīng)性飼養(yǎng)合格后用于實(shí)驗(yàn)，大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度50%～70%，自由飲食和飲水，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和喂養(yǎng)均嚴(yán)格遵照動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)所規(guī)定的有關(guān)條款，該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審查通過。

1.3 試劑 弗氏完全佐劑(FCA)、戊巴比妥鈉，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)SLBK7817V、P1302716；TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、VEGF試劑盒，深圳欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)R190929-102a、R190929-101a、R190929-007a、R190929-003a、R190929-103a；MMP-1試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)3W33F4DAXU；VEGFA、MMP-1、MIF抗體，英國(guó)Abcam公司，批號(hào)GR3200812-2、GR242901-33、GR270048-26；兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)K216713D、K217721A；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，日本TaKaRa公司，批號(hào)AI12244A、AJ12464A、AHF1910A。

1.4 儀器 R2000-3型電子計(jì)重計(jì)數(shù)天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；BS224S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PV-200型足跖容積測(cè)量?jī)x，成都泰盟科技有限公司；ST-360型酶標(biāo)儀，上?？迫A試驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Tanon-5200型凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)Labworks公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI 公司；高級(jí)智能脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國(guó)徠卡公司；光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Mias-2000型病理圖像處理系統(tǒng)，四川大學(xué)圖像圖形研究所。

2 方法

2.1 模型建立及給藥 取10只雄性SD大鼠設(shè)為正常組，不作處理；其余大鼠于右后足跖皮內(nèi)注射FCA 0.1 mL/只[16-17]，注射后第14天，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組，即模型組、雙氫青蒿素+火把花根配伍組(0.05 g/kg+3.75 g/kg)、雙氫青蒿素(0.1 g/kg)組、火把花根(7.5 g/kg)組，每組10只。給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組灌胃給予等體積0.5% CMC-Na溶液，容量1 mL/100 g，每天1次，連續(xù)給藥21 d。

2.2 關(guān)節(jié)腫脹度檢測(cè)

2.2.1 測(cè)量足跖容積 造模前、給藥前和給藥第7、14、21天分別測(cè)量大鼠左后足(繼發(fā)病變側(cè))及右后足的容積1 次，測(cè)量范圍為踝關(guān)節(jié)及以下，計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹率。

2.2.2 關(guān)節(jié)指數(shù) 給藥前和給藥第7、14、21天根據(jù)大鼠前后肢踝關(guān)節(jié)、趾關(guān)節(jié)紅腫程度及受影響關(guān)節(jié)指數(shù)進(jìn)行評(píng)分。0分，正常，無紅腫；1分，1個(gè)關(guān)節(jié)紅腫；2分，2個(gè)及2個(gè)以上關(guān)節(jié)紅腫；3分，踝關(guān)節(jié)以下足掌嚴(yán)重紅腫；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪紅腫且不能負(fù)重。四肢分別進(jìn)行評(píng)分，累計(jì)總和即為關(guān)節(jié)指數(shù)。

2.3 ELISA法檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子水平 末次給藥后1 h，大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈采血，離心得血清，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、VEGF、MMP-1水平。

2.4 HE染色觀察關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)改變 將大鼠的右足跖關(guān)節(jié)固定在10%甲醛中16 h以上，10% EDTA脫鈣，脫水，浸蠟，包埋，切片，HE染色。鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜增生及炎癥程度，并進(jìn)行半定量評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 組織半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.5 Western blot檢測(cè)足跖關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF、MMP-1及MIF蛋白表達(dá) 收集各組大鼠右足跖關(guān)節(jié)滑膜組織，提取蛋白，BCA檢測(cè)總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗(VEGF及MMP-1，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST清洗，曝光顯影，采用Tanon-5200成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)VEGF、MMP-1、MIFmRNA表達(dá) 提取各組大鼠右足跖關(guān)節(jié)滑膜組織RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Green熒光染料法進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表2。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法進(jìn)行半定量分析。

表2 引物序列

3 結(jié)果

3.1 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠足跖容積的影響 與正常組比較，模型組大鼠左后足、右后足關(guān)節(jié)腫脹率均升高(P<0.01)，說明造模成功；與模型組比較，給藥第14、21天，配伍組大鼠左后足、右后足關(guān)節(jié)腫脹率降低(P<0.05)，提示雙氫青蒿素與火把花根配伍對(duì)弗氏完全佐劑所致的關(guān)節(jié)炎模型有明顯抑制作用，見表3～4。

表3 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠左后足關(guān)節(jié)腫脹率的影響

表4 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠右后足關(guān)節(jié)腫脹率的影響

3.2 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥第21天，配伍組大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)降低(P<0.05)，見表5。

表5 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)的影響

3.3 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子水平升高(P<0.01)；與模型組比較，配伍組大鼠血清IFN-γ、VEGF及MMP-1水平降低(P<0.05，P<0.01)，雙氫青蒿素組和火把花根組VEGF及MMP-1水平降低(P<0.05，P<0.01)，見表6。

3.4 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理改變的影響 如圖1所示，模型組大鼠關(guān)節(jié)囊結(jié)締組織壞死、水腫伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生；與模型組比較，配伍組大鼠踝關(guān)節(jié)囊結(jié)締組織壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，纖維組織增生降低。組織半定量評(píng)分結(jié)果如表7所示，與模型組比較，配伍組大鼠組織評(píng)分結(jié)果降低(P<0.05)。提示，雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)模型大鼠造模處軟組織損傷有明顯改善和修復(fù)作用。

表6 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥細(xì)胞因子的影響

表7 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠組織半定量評(píng)分的影響

3.5 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGFA、MMP-1及MIF蛋白表達(dá)的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGFA、MMP-1及MIF蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組VEGFA、MMP-1及MIF蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。

3.6 雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF、MMP-1及MIFmRNA表達(dá)的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF、MMP-1及MIFmRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF、MMP-1及MIFmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，見圖3。

4 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜組織增生、肥厚以及骨損傷為特征的慢性全身性自身免疫疾病。佐劑性關(guān)節(jié)炎模型是一種與人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理極為相似的一種免疫炎癥模型，作為研究人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本研究顯示，模型組大鼠足關(guān)節(jié)腫脹率、關(guān)節(jié)指數(shù)升高，造模處踝關(guān)節(jié)有明顯的病理變化，且血清中炎癥因子水平升高，表明佐劑性關(guān)節(jié)炎模型制備成功；雙氫青蒿素-火把花根配伍降低佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹率、關(guān)節(jié)指數(shù)，明顯改善和修復(fù)造模處軟組織損傷，且配伍組修復(fù)效應(yīng)強(qiáng)于單獨(dú)用藥組，提示配伍用藥具有增效的作用。

在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中，促炎性與抑炎性細(xì)胞因子失去平衡會(huì)導(dǎo)致滑膜炎癥。IFN-γ通過活化巨噬細(xì)胞從而介導(dǎo)局部炎癥的免疫應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)中起到重要調(diào)節(jié)作用[18]。TNF-α通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，以促進(jìn)血管內(nèi)皮和白細(xì)胞黏附滲透，導(dǎo)致局部炎癥引起組織損傷，并同時(shí)促進(jìn)成纖維細(xì)胞和滑膜巨噬細(xì)胞增殖，從而直接導(dǎo)致軟骨和骨損傷[19]。IL-1β與機(jī)體炎癥程度呈正相關(guān)，能誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生，IL-6參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)抗體的合成，從而引起免疫功能紊亂[20-21]。本研究結(jié)果顯示，佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥因子水平升高，經(jīng)配伍組治療，大鼠血清炎癥因子水平降低，表明雙氫青蒿素-火把花根配伍能抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的炎癥反應(yīng)。

血管生成在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中會(huì)加劇軟骨和骨的破壞，VEGF是促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎新血管生成和分化的主要因子[22]。MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分降解過程中必不可少的酶，可促進(jìn)血管新生[23]。MIF通過活化巨噬細(xì)胞并抑制其移動(dòng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞在炎癥局部的聚集和浸潤(rùn)，從而極大地促進(jìn)炎癥和免疫反應(yīng)[24]。本研究結(jié)果顯示，雙氫青蒿素-火把花根配伍抑制大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF、MMP-1及MIF表達(dá)，降低血清中炎癥因子水平，提示雙氫青蒿素-火把花根配伍改善大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)與抑制VEGF、MMP-1及MIF表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，雙氫青蒿素-火把花根配伍對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有治療作用，其機(jī)制可能是通過抑制VEGF、MMP-1及MIF的表達(dá)，調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子產(chǎn)生和分泌，進(jìn)而抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、滑膜組織的增生及新血管的生成，減輕軟骨和骨破壞，從而發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，本研究將為雙氫青蒿素-火把花根治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用中兩者聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)，具有潛在的應(yīng)用前景。