蔣雅嫻， 王志萍*， 陳 俊， 黎 芳， 李曉霞， 蘇佳昇

(1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西高校中藥制劑共性技術研發(fā)重點實驗室，廣西 南寧 530001)

盆腔炎性疾病后遺癥是指女性上生殖道的一組感染性疾病，常為急性盆腔炎沒有得到徹底治療而引發(fā)的疾病[1]，癥狀為白帶異常、腹痛，其主要病理機制為炎癥反應。IL-10主要抑制炎癥反應，促進組織的修復和再生，具有減輕炎癥細胞過度活化狀態(tài)的作用[2]。TLR4通路在介導炎癥反應過程中起關鍵作用，TLR可能是細菌感染與炎癥形成的橋梁，細菌性病原體與TLR4結合，激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路調控下游炎性介質，參與盆腔炎大鼠炎癥進程[3]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4通路可獲得較好的抗炎效果[4]，如TLR4抑制劑能改善慢性盆腔炎大鼠病理形態(tài)學[5]。

在壯醫(yī)臨床實踐中，“咪花腸”疾病中月經病、白帶病的癥狀與盆腔炎性疾病后遺癥相同。壯藥金母顆粒由金剛刺、火炭母、土茯苓、虎杖、白背葉根、大血藤、苦參、梨頭草、黃柏組成，治療白帶病效果好。其原方(婦雅凈顆粒)能夠干預盆腔炎性疾病后遺癥大鼠NF-κB信號通路，起到改善盆腔炎性疾病后遺癥的作用[6]，但對于壯藥金母顆粒的抗炎作用未見報道。本研究通過檢測壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織TLR4/MyD88/NF-κB通路表達的影響，探討壯藥金母顆粒發(fā)揮抗盆腔炎性疾病后遺癥的作用機制，為治療盆腔炎性疾病后遺癥的藥物開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雌性大鼠70只，體質量(200±20)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2019-0002。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學動物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2)℃，相對濕度為40%～60%，12 h/12 h明暗交替。實驗前適應性喂養(yǎng)7 d，自由進食飲水。

1.2 試劑與藥物 壯藥金母顆粒(廣西高校中藥制劑共性技術重點實驗室研制，每1 g顆粒相當于3.63 g生藥，批號G20190601)；花紅顆粒(廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)集團股份公司，批號20180403)；復方醋酸地塞米松片(廣東南國藥業(yè)有限公司，批號171202)。RIPA細胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司，批號R0020)；大鼠IL-1β、IL-10試劑盒(武漢華聯(lián)科生物技術有限公司，批號RA20020-S、RA20090)；總RNA試劑提取盒(美國Promega公司，批號LS1040)；cDNA第一條鏈合成試劑盒康為試劑(北京康為世紀生物科技有限公司，批號CW2582M)；ECL發(fā)光試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號sc-2048)；TLR4抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號bs20595R)；NF-κB p65抗體(美國Affinity公司，批號AF5006)；MyD88抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號BA2321)?；旌暇河蓮V西中醫(yī)藥大學微生物與免疫實驗中心提供。

1.3 儀器 低溫高速離心機、蛋白濃度定量儀(德國Eppendorf公司)；全波長掃描酶標儀(上海天能科技有限公司)；PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；超低溫冰箱(日本三洋電機株式會社)；電熱恒溫箱(上海精宏實驗設備有限公司)；全電腦自動組織脫水機、全自動組織包埋機、漂烘處理儀(常州市華利電子有限責任公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)；石蠟切片機(上海創(chuàng)迅醫(yī)療器械有限公司)；正置熒光數(shù)碼成像顯微鏡(日本Olympus公司)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；半干轉膜儀系統(tǒng)(美國ATTO公司)；渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 將70只大鼠隨機分為空白組，模型組，花紅顆粒組(2.70 g/kg)，醋酸地塞米松組(0.135×10-3g/kg)，壯藥金母顆粒高、中、低劑量組(5.40、2.70、1.35 g/kg)，每組10只。造模前24 h禁食不禁水，模型組與各給藥組大鼠次日腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)進行麻醉，剪去下腹正中部的毛，使皮膚暴露，用碘伏、醫(yī)用酒精消毒后于下腹正中切1小口(0.8～1 cm)，開腹后使子宮暴露并固定，用磨去針頭尖的4號針頭在子宮分叉處分別朝兩側子宮方向進針，并于子宮宮腔內往返抽拉2次，注射1.5×108/mL細菌混懸液0.1 mL，分離肌肉層和皮膚層，縫合腹部，消毒手術區(qū)；空白組大鼠不做任何處理，手術后恢復飲水，正常飼養(yǎng)，用碘伏消毒手術區(qū)7 d。造模后第15天，各給藥組大鼠灌胃給予相應藥物，模型組與空白組大鼠灌胃給予等體積純凈水，劑量為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)14 d。

2.2 ELISA法檢測大鼠血清IL-1β、IL-10水平 給藥14 d后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血后進行解剖。血液室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，分裝保存于-80 ℃。按照ELISA試劑盒說明書，檢測大鼠血清IL-1β、IL-10水平。

2.3 子宮組織病理檢測 剪取一半大鼠子宮，用4%多聚甲醛固定，經脫水、透化、石蠟包埋后，制備2～3 μm組織切片，HE染色后用中性樹膠進行封片，在光鏡下(×100)觀察切片，根據(jù)表1對子宮病理形態(tài)變化進行分級。

表1 分級標準

2.4 RT-qPCR法檢測大鼠子宮組織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達 取大鼠子宮組織30～100 mg，按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，再按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄cDNA合成，配制所需的反應液，反應條件為25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。使用Real-time PCR儀進行擴增，反應條件為95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40個循環(huán)。反應結束后進行熔解曲線分析，以β-actin為內參，采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達。引物序列見表2。

表2 引物序列

2.5 Western blot檢測大鼠子宮組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達 取適量大鼠子宮組織，剪碎后置于離心管中，加入RIPA裂解液提取蛋白質，用BCA法檢測蛋白質濃度，加入4倍量蛋白質上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。各組取等量蛋白，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，250 mA恒流轉移到PVDF膜，封閉液中室溫封閉2 h，加入一抗工作液4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶3 000)室溫孵育90 min，ECL試劑盒發(fā)光顯影。采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，檢測各目的蛋白及內參蛋白β-actin條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達。

3 結果

3.1 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮病理形態(tài)的影響

3.1.1 宮腔黏連與擴張病理評分 與空白組比較，模型組大鼠宮腔黏連與擴張評分升高(P<0.01)；與模型組比較，壯藥金母顆粒高劑量組和醋酸地塞米松組大鼠宮腔黏連與擴張評分降低(P<0.05)，其余各給藥組大鼠宮腔黏連與擴張評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠宮腔黏連與擴張情況的影響(n=10)

3.1.2 內膜充血水腫病理評分 與空白組比較，模型組大鼠子宮內膜充血水腫評分升高(P<0.01)；與模型組比較，壯藥金母顆粒高劑量組和醋酸地塞米松組大鼠子宮內膜充血水腫評分降低(P<0.01)，其余各給藥組大鼠子宮內膜充血水腫評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

3.1.3 上皮細胞增生病理評分 與空白組比較，模型組大鼠子宮上皮細胞增生評分升高(P<0.01)；與模型組比較，壯藥金母顆粒高劑量組、花紅顆粒組和醋酸地塞米松組大鼠子宮上皮細胞增生評分降低(P<0.05，P<0.01)，見表5。

表4 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮內膜充血水腫情況的影響(n=10)

表5 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮上皮細胞增生情況的影響(n=10)

3.1.4 子宮組織病理形態(tài)學 空白組大鼠子宮宮腔結構層次基本清晰，子宮內膜上皮完整，無充血、紅腫現(xiàn)象；模型組大鼠主要病變?yōu)樽訉m宮腔粘連或擴張，內膜充血水腫，上皮細胞增生呈分支乳頭狀，伴有一定程度炎癥細胞浸潤等病變，基本符合臨床盆腔炎性疾病后遺癥病變特征；壯藥金母顆粒高劑量組和醋酸地塞米松組大鼠子宮宮腔結構層次基本清晰，內膜上皮完整，偶可見宮腔粘連或擴張<1/3或上皮細胞呈高柱狀、固有膜輕微充血水腫；花紅顆粒組大鼠子宮組織輕微擴張但未見粘連，內膜局部充血紅腫，但能改善上皮細胞增生情況；壯藥金母顆粒中、低劑量組大鼠宮腔粘連或擴張1/3～2/3，個別有明顯充血水腫，上皮細胞呈高柱狀，見圖1。

3.2 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠血清IL-1β、IL-10水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1β水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，壯藥金母顆粒高、中劑量組，花紅顆粒組和醋酸地塞米松組大鼠血清IL-1β水平降低(P<0.05)，壯藥金母顆粒高劑量組和醋酸地塞米松組大鼠血清IL-10水平升高(P<0.05)，見表6。

表6 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠血清IL-1β、IL-10水平的影響

3.3 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠子宮組織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠子宮組織中TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達均降低(P<0.01)，見表7。

表7 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達的影響

3.4 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠子宮組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠子宮組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達均降低(P<0.01)，見表8、圖2。

表8 壯藥金母顆粒對盆腔炎性疾病后遺癥大鼠子宮組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達的影響

4 討論

盆腔炎性疾病后遺癥病名在古籍中沒有記載，根據(jù)其癥狀，中醫(yī)認為該病屬于帶下病、痛經、癥瘕、經病疼痛、經不調、婦人腹痛、不孕癥等病癥范疇[7]，而壯醫(yī)認為其屬于“月經病”“帶下病”[8]，病機是由于濕熱下注而使帶下量多，熱毒積蒸、損傷龍路，濕毒積結、淤阻花腸，故小腹疼痛、腰骶痠痛[9]，治則清熱毒，除濕毒。又因積濕化熱，濕熱積結于火路，日久生蟲，蟲毒侵蝕陰部則癢痛不寧，龍路、火路失調，花腸功能失調，故使帶下量多，色黃如膿、稠粘臭穢。濕熱浸漬，則陰部瘙癢，甚則灼痛，治則以清熱解毒祛濕、補花腸、殺蟲止癢、調理三道二路。壯藥金母顆粒是由課題組前期研制的獲得專利授權的新制劑改良而來，由金剛刺、火炭母等組成，具有清熱毒、除濕毒、滅蟲毒、止瘙癢、消腫痛等功效。

Toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)/核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路在免疫及炎癥機制中發(fā)揮作用[10]。TLR4為跨膜蛋白，是Toll樣受體家族成員之一。外源性配體主要是病原體相關分子如細菌性病原體、真菌性病原體等[11-12]，與TLR4結合，引起炎癥瀑布反應。白細胞介素(如IL-1β、IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等與TLR4結合，胞外炎性信號呈遞給胞內MyD88[13],募集轉導分子發(fā)生級聯(lián)反應，磷酸化IKβ激酶(IKK)復合物(如IKKα、IKKβ、IKKγ)將IκB磷酸化，NF-κB與IκB解離，活化并進入細胞核與下游基因上的特定位點結合，啟動并調控下游基因的轉錄，合成并釋放細胞因子(如IL-1β、IL-2，IL-6、TNF-α等)[14-15]。細胞因子又通過正反饋調節(jié)激活炎癥NF-κB通路[16]，加重炎癥反應。多種抑制該信號通路的抗炎藥均能起到較好的抗炎效果[17]，以TLR4/MyD88/NF-κB為靶標，將成為治療盆腔炎性疾病后遺癥的新思路。

本研究運用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的混合菌液加機械損傷法建立盆腔炎性疾病后遺癥大鼠模型。結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠子宮病理組織評分升高，符合臨床盆腔炎性疾病后遺癥病變特征，證明造模成功[5]。模型組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達升高，提示TLR4、MyD88、NF-κB p65被活化，誘導炎性因子的轉錄，產生炎癥效應，增加活化的NF-κB p65能促進下游IL-1β炎癥因子的合成與分泌。與模型組比較，壯藥金母顆粒高劑量組大鼠子宮病理組織評分降低，證實其可以抑制盆腔炎性疾病后遺癥的炎癥反應。壯藥金母顆粒各劑量組大鼠組織TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達降低，提示壯藥金母顆?？赏ㄟ^抑制TLR4、MyD88、NF-κB p65的表達，減少下游IL-1β炎癥因子的合成與分泌。IL-1β作為TLR4/MyD88/NF-κB通路下游的炎癥因子，高、中劑量壯藥金母顆粒對其有抑制效果，但低劑量抑制效果不明顯。IL-10是促進組織修復和再生的因子，而盆腔炎性疾病后遺癥是需要較長時間形成的慢性炎癥，修復組織是需要漫長的過程，因此，壯藥金母顆粒對IL-10水平的影響敏感度不高，可能該通路是通過影響其他炎癥因子起到抗炎作用的，有待開展進一步研究。

綜上所述，壯藥金母顆粒能夠抑制盆腔炎性疾病后遺癥大鼠的炎癥反應，其機制可能是通過調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的傳導而實現(xiàn)的。