劉 瑾， 楊宗統(tǒng)， 袁 敏， 梁瑞雪

(山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

慢性前列腺炎是男科常見病，患者以成年男性為主[1]，約50%男性在一生中的某個階段會受前列腺炎的困擾[2]，其中慢性非細(xì)菌性前列腺炎約占90%～95%[3]，且呈逐年上升趨勢[4-5]。慢性前列腺炎臨床癥狀復(fù)雜多變且缺乏特異性，導(dǎo)致病情纏綿難愈、病程遷延，從而成為男性難治疾病之一。目前西醫(yī)治療慢性前列腺炎尚缺乏特異性的治療藥物和方法，多以抗生素[6-7]、α受體阻滯劑[8-9]和非甾體抗炎藥[10-11]為主，臨床療效并不理想。中醫(yī)藥治療慢性前列腺炎具有明顯的優(yōu)勢，其在改善臨床癥狀、消退局部炎癥等方面優(yōu)于西醫(yī)治療。

淋必通顆粒是臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗方，由蒲公英、苦地丁、金錢草、石韋、綿萆薢、王不留行、益母草、皂角刺、牛膝組成，具有清熱利濕、散結(jié)通淋之功效，臨床用于治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎效果顯著。本課題組前期研究表明，淋必通顆粒對角叉菜膠所致大鼠慢性前列腺炎有較好的治療作用[12]，為了進(jìn)一步探討淋必通顆粒對慢性前列腺炎的治療效果，本實驗采用大鼠前列腺內(nèi)注射消痔靈注射液的方法建立動物模型，觀察不同劑量淋必通顆粒對大鼠前列腺組織病理形態(tài)學(xué)及IL-6、IL-10水平影響，初步探討其治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎的作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 淋必通顆粒(本院中藥制劑室自制，批號20190529)；普樂安片(陽性對照，云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號ZAC1910)；消痔靈注射液(吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，批號18031806，臨用時以生理鹽水配制)。戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司，批號05-01-02)；0.9%氯化鈉注射液(山東華魯制藥有限公司，規(guī)格250 mL，批號SA19112010)；甲醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號20191205)。IL-6、IL-10 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號A306H91234、A310H91124)。

1.2 動物 健康雄性Wistar大鼠64只，SPF級，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0011。

1.3 儀器 X-30R全能高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)；FA1204B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；xMark酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；RM2235病理石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；Excelsior AS病理全自動組織脫水機(jī)、CTM6全自動封片機(jī)、Gemini AS全自動染色機(jī)、Histostar包埋機(jī)、PrintMate 150包埋盒打號機(jī)、SlideMate玻片打號機(jī)(美國Thermo Fisher公司)；生物組織攤烤片機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；CX31生物顯微鏡、DP27顯微鏡專用數(shù)碼相機(jī)、cellSens v 1.18成像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 模型制備 參考《藥理實驗方法學(xué)》進(jìn)行操作[13]。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，禁食不禁水12 h后稱定體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)選取12只作為假手術(shù)組，剩余52只用于造模。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，碘伏和酒精對腹部皮膚進(jìn)行消毒，沿腹中線切口，剪開皮膚直達(dá)腹腔，提出膀胱及兩側(cè)精囊，暴露出前列腺背側(cè)葉，注入25%消痔靈注射液0.2 mL，每側(cè)0.1 mL，將精囊及膀胱送回原位置，縫合腹壁肌肉、皮膚；假手術(shù)組于同樣部位注射0.9%氯化鈉注射液0.2 mL。術(shù)后第7天，隨機(jī)選取造模組、假手術(shù)組大鼠各2只進(jìn)行病理切片，若造模組前列腺間質(zhì)高度充血、水腫、呈疏松網(wǎng)狀，纖維細(xì)胞增生，有多量中性粒細(xì)胞浸潤等病理變化，表明造模成功。

2.2 分組與給藥 造模成功后，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、普樂安片組及淋必通顆粒低、中、高劑量組，每組10只，淋必通顆粒各劑量組灌胃給予含藥混懸液10 mL/kg(分別相當(dāng)于2.7、5.4、10.8 g/kg藥物)，普樂安片組灌胃給予含藥混懸液10 mL/kg(相當(dāng)于1.08 g/kg生藥)，假手術(shù)組、模型組灌胃給予蒸餾水10 mL/kg，每天1次，連續(xù)30 d。

2.3 前列腺指數(shù)檢測 連續(xù)給藥30 d后，大鼠禁食不禁水12 h，稱定體質(zhì)量，解剖取前列腺組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸取多余水分，電子天平稱定濕質(zhì)量，計算前列腺指數(shù)[14-15]，公式為前列腺指數(shù)=(前列腺濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量)×100%，腫脹率=[(造模組大鼠前列腺指數(shù)-假手術(shù)組大鼠前列腺指數(shù))/假手術(shù)組大鼠前列腺指數(shù)]×100%，腫脹抑制率=[(模型組腫脹率-用藥組腫脹率)/模型組腫脹率]×100%。

2.4 前列腺組織IL-6、IL-10水平檢測 取大鼠左側(cè)前列腺組織，稱定質(zhì)量，加入2倍生理鹽水進(jìn)行勻漿，靜置，3 000 r/min離心15 min，取上清，采用ELISA法檢測前列腺組織勻漿液中IL-6、IL-10水平。

2.5 前列腺組織形態(tài)學(xué)觀察 取大鼠右側(cè)前列腺組織，置于10%甲醛中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，按照病變程度分為3個等級進(jìn)行定量評價，對各項病理變化評分，計算總和作為整體評分，評分標(biāo)準(zhǔn)[16]為(1)腺體形態(tài)，腺上皮單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，細(xì)胞呈柱狀、立方形，腺體上皮向管腔內(nèi)折疊形成皺襞，計為2分；腺上皮輕度增生，有損傷，腺體上皮皺襞減少，計為4分；腺上皮受損變形嚴(yán)重，腺上皮皺襞減少或無，計為6分；(2)炎癥表現(xiàn)情況及炎性細(xì)胞浸潤程度，腺腔偶見炎性細(xì)胞，計為2分；腺腔中度炎性細(xì)胞浸潤，計為4分；腺腔充滿炎性細(xì)胞，伴有充血現(xiàn)象，計為6分；(3)纖維組織增生程度，極少纖維組織增生，計為2分；纖維組織增生程度較輕，計為4分；腺體周圍有大量纖維組織增生，包被腺體，計為6分。

3 結(jié)果

3.1 淋必通顆粒對大鼠體質(zhì)量、前列腺濕質(zhì)量、前列腺指數(shù)的影響 各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明造模和給藥對大鼠體質(zhì)量增長無明顯影響。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺濕質(zhì)量、前列腺指數(shù)升高(P<0.01)，表明造模成功；與模型組比較，淋必通顆粒中、高劑量組和普樂安片組大鼠前列腺濕質(zhì)量、前列腺指數(shù)、前列腺腫脹率降低(P<0.05)，呈劑量依賴性，見表1。

表1 淋必通顆粒對大鼠前列腺指數(shù)的影響

3.2 淋必通顆粒對大鼠前列腺組織IL-6、IL-10水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺組織IL-6水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.01)，表明造模成功；與模型組比較，淋必通顆粒中、高劑量組和普樂安片組大鼠前列腺組織IL-6水平降低(P<0.05，P<0.01)，淋必通顆粒高劑量組和普樂安片組IL-10水平升高(P<0.05)，見表2。

表2 淋必通顆粒對大鼠前列腺組織IL-6、IL-10水平的影響

3.3 淋必通顆粒對大鼠前列腺組織形態(tài)學(xué)變化的影響 造模第7天，造模組大鼠前列腺間質(zhì)高度充血、水腫、呈疏松網(wǎng)狀，有較多中性粒細(xì)胞浸潤，腺上皮細(xì)胞增生等病理變化；假手術(shù)組大鼠腺體松散分布、形態(tài)正常，腺腔大小均勻、量少、寬窄不一，間質(zhì)疏松未見炎癥細(xì)胞浸潤和纖維組織增生，表明造模成功，見圖1。

連續(xù)給藥30 d后，假手術(shù)組大鼠前列腺腺體形態(tài)正常，腺腔大小均勻，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤和纖維組織增生；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺部分腺腔閉鎖呈實體狀，腺上皮增生、受損嚴(yán)重(P<0.01)，腺腔內(nèi)分泌物減少甚至消失，腺腔內(nèi)可見嚴(yán)重炎癥細(xì)胞浸潤(P<0.01)，間質(zhì)水腫增寬，纖維組織增生明顯(P<0.01)；與模型組比較，普樂安片組和淋必通顆粒高劑量組大鼠腺體變形明顯改善，腺上皮受損變形較輕，腺上皮皺襞增多，腺體形態(tài)正常(P<0.01)，前列腺腺腔擴(kuò)大，腺腔內(nèi)分泌物增多，炎癥細(xì)胞浸潤減少(P<0.01)，纖維組織增生得到較好改善(P<0.01)；淋必通顆粒中、低劑量組大鼠腺腔部分恢復(fù)正常，部分腺腔內(nèi)分泌物增多，炎癥細(xì)胞浸潤有一定減輕，纖維組織增生也有一定程度緩解，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、表3。

4 討論

慢性前列腺炎是男科常見病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為慢性前列腺炎是由免疫炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子介導(dǎo)的局部免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致前列腺局部免疫功能異常增強(qiáng)[17]。IL-6為促炎性細(xì)胞因子，可促進(jìn)趨化因子、環(huán)氧合酶-2、細(xì)胞間粘附分子的釋放，對局部組織造成損傷并引起疼痛，是慢性前列腺炎臨床癥狀的重要發(fā)生機(jī)制之一[18]。甘進(jìn)等[19]研究表明IL-6水平在慢性前列腺炎患者精液中升高，并且和慢性前列腺炎癥狀指數(shù)癥狀評分呈正相關(guān)性，推測可能參與患者疼痛癥狀的產(chǎn)生。IL-10是抗炎性細(xì)胞因子，可抑制Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，對炎癥細(xì)胞遷移和致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生起到抑制效應(yīng)，發(fā)揮了較強(qiáng)的抗炎及免疫抑制活性[20]。

表3 淋必通顆粒對大鼠前列腺組織間質(zhì)增生和腺體形態(tài)的影響

本實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前列腺組織勻漿中IL-6水平升高，IL-10水平降低，表明慢性前列腺炎模型大鼠存在前列腺局部的免疫功能紊亂。與模型組比較，中、高劑量淋必通顆粒可以降低慢性前列腺炎模型大鼠前列腺組織IL-6水平，高劑量淋必通顆粒可以有效提高慢性前列腺炎模型大鼠前列腺組織IL-10水平，表明淋必通顆?？梢杂行呖寡仔约?xì)胞因子IL-10水平，抑制促炎性細(xì)胞IL-6的釋放，緩解慢性前列腺炎模型大鼠前列腺局部的炎癥反應(yīng)。大鼠前列腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察也顯示，淋必通顆粒中、低劑量組炎癥細(xì)胞浸潤有一定減輕，纖維組織增生也有一定程度緩解；淋必通顆粒高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤減少，纖維組織增生得到明顯改善，說明淋必通顆?？梢愿纳葡天`注射液所致大鼠前列腺組織病理形態(tài)學(xué)改變，減輕前列腺組織局部的炎癥反應(yīng)。本結(jié)果為臨床應(yīng)用淋必通顆粒治療慢性前列腺炎提供了實驗依據(jù)，但淋必通顆粒多靶點、多途徑治療慢性前列腺炎的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。