張 濤， 馬書杰， 葉 斌， 嚴(yán)雋陶*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；2.上海市第二康復(fù)醫(yī)院，上海 201900；3.上海市第三康復(fù)醫(yī)院，上海 200070)

膝骨關(guān)節(jié)炎是以膝關(guān)節(jié)周圍關(guān)節(jié)軟骨退變和繼發(fā)性骨反應(yīng)為特征的關(guān)節(jié)疾病，在60歲以上的老年人中致殘率超過20%[1]，不僅會(huì)影響患者的身心健康，還增加了醫(yī)療系統(tǒng)和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)成本[2]。目前，臨床常用的短期對癥治療藥物主要為非甾體類抗炎藥，但其心血管風(fēng)險(xiǎn)、上消化道刺激、出血等不良反應(yīng)明顯[3]。研究證實(shí)，中醫(yī)藥在膝骨關(guān)節(jié)炎的防治中具有較好的療效，而且不良反應(yīng)相對較少，臨床應(yīng)用廣泛[4]。

中醫(yī)理論中將膝骨關(guān)節(jié)炎歸屬為“骨痹”“膝痹”范疇，其發(fā)病多因年老體衰、肝腎虧虛而致筋骨失于濡養(yǎng)，或因風(fēng)寒濕熱之邪流注肌肉、筋骨、關(guān)節(jié)而致經(jīng)絡(luò)痹阻，氣血運(yùn)行不暢，肢體筋脈拘急而發(fā)病。牛膝與杜仲皆入肝、腎經(jīng)，均可補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，前者還可逐瘀通經(jīng)，后者還能祛除關(guān)節(jié)濕邪，二藥合用可補(bǔ)益肝腎以治本，化瘀化濕以治標(biāo)。現(xiàn)代研究也顯示，牛膝-杜仲藥對是膝骨關(guān)節(jié)炎治療中使用頻率最高的藥對之一[5]，但迄今為止尚無該藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)機(jī)制考察。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測牛膝-杜仲藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)和信號通路，并結(jié)合分子對接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，以期系統(tǒng)全面地揭示藥物與疾病間的關(guān)系，并為相關(guān)臨床應(yīng)用和機(jī)制研究提供新的證據(jù)和思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫、軟件及分析平臺(tái) 詳見表1。

1.2 活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(tái)(TCMSP)篩選牛膝-杜仲藥對活性成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug like，DL)≥0.18為篩選條件，將篩選出的活性成分與其潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行配對，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換出作用靶點(diǎn)的通用基因名稱，未被轉(zhuǎn)換的靶點(diǎn)使用手動(dòng)檢索，最后去除重復(fù)基因，即為活性成分作用靶點(diǎn)。

表1 數(shù)據(jù)庫、軟件及分析平臺(tái)

1.3 膝骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)預(yù)測 以“knee osteoarthritis”為搜索詞，在GeneCard、OMIM數(shù)據(jù)庫中搜索人類膝骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)基因，合并去除重復(fù)項(xiàng)后獲得膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 使用在線BMK Cloud平臺(tái)，將牛膝-杜仲藥對藥物活性成分作用基因與膝骨關(guān)節(jié)炎基因取交集，并繪制交集基因的維恩圖。

1.5 藥物-疾病交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行交集靶點(diǎn)的蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，使用Cytoscape中的“Network analyzer”插件，通過拓?fù)鋵W(xué)分析計(jì)算出PPI網(wǎng)絡(luò)各靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)的度值(Degree)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值大小選定網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，度值越大，該基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中的作用越大。

1.6 GO、KEGG富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析，探尋牛膝-杜仲藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的生物功能。通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，探究牛膝-杜仲藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的主要信號通路，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路”拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建牛膝-杜仲藥對與膝骨關(guān)節(jié)炎交集靶點(diǎn)的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，“Network analyzer”插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析得出上述網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值，根據(jù)度值大小確定重要活性成分和靶點(diǎn)。

1.8 活性成分與靶點(diǎn)蛋白的分子對接驗(yàn)證 從PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)，從TCMSP平臺(tái)下載主要活性成分mol2文件，然后使用PyMOL軟件對關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去水、加氫等操作，通過AutoDockTools 1.5.6、AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對接，記錄結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及作用靶點(diǎn) 牛膝-杜仲藥對活性成分共323種，其中牛膝176種，杜仲147種，按照口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選后，最終確定牛膝活性成分17種，杜仲活性成分21種，見表2。同時(shí)，篩選出牛膝-杜仲藥對作用靶點(diǎn)共234個(gè)。

2.2 膝骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點(diǎn)預(yù)測 合并GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中有關(guān)膝骨關(guān)節(jié)炎的基因，去除重復(fù)項(xiàng)，獲得疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)3 090個(gè)。

2.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 使用在線BMK Cloud平臺(tái)，獲得牛膝-杜仲藥對與膝骨關(guān)節(jié)炎的藥物-疾病交集靶基因共132個(gè)，見圖1。

2.4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING數(shù)據(jù)庫將132個(gè)交集靶點(diǎn)以最低要求互動(dòng)得分0.7為篩選參數(shù)分析，最終得出778條邊和132個(gè)節(jié)點(diǎn)。采用Cytoscape軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，Network Analyzer工具分析網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值，節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺反映度值大小，根據(jù)其排序確定核心靶點(diǎn)(圖2)，度值排名前10的蛋白見表3，可知這些靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的作用，即為牛膝-杜仲藥對有效成分調(diào)控膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 GO、KEGG富集分析 將132個(gè)交集靶點(diǎn)基因上傳到DAVID在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的GO條目共749條，其中生物學(xué)進(jìn)程(biological process，BP)585條，細(xì)胞組分(cellular component，CC)62條，分子功能(molecular function，MF)102條，靶點(diǎn)基因主要參與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對缺氧的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控等生物學(xué)進(jìn)程等；主要在細(xì)胞外基質(zhì)、線粒體、核漿、胞質(zhì)等細(xì)胞組分處發(fā)揮作用，參與的分子功能主要包括蛋白、蛋白激酶、以及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合等。圖3展示了每個(gè)模塊P值最小的前10個(gè)條目，其值越小，顏色越偏向紅色，反之則偏向藍(lán)色；點(diǎn)的大小表示富集的基因數(shù)。KEGG分析顯示，靶點(diǎn)基因富集了108條相關(guān)通路，圖4列出了P值排序最小的20個(gè)條目。另外，靶點(diǎn)基因主要涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、破骨細(xì)胞分化、Toll樣受體信號通路、細(xì)胞凋亡以及Nod樣受體通路等，與細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、轉(zhuǎn)化以及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)。

表2 牛膝-杜仲活性成分

2.6 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 圖5(顏色越深，度值越大)顯示，度值排名前5位的化合物分別是MOL000098(槲皮素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000173(漢黃芩素)、MOL002714(黃芩素)、MOL002773(β-胡蘿卜素)。

2.7 活性成分與靶點(diǎn)蛋白的分子對接 選擇疾病-活性成分-靶點(diǎn)-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果度值排名前5的活性成分，與靶點(diǎn)基因進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，使用AutoDock軟件進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測，構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能越低，通常結(jié)合能<0 kcal/mol提示分子之間具有結(jié)合活性，<-5.0 kcal/mol提示分子之間具有較強(qiáng)的結(jié)合活性[6]。將5種活性成分與5個(gè)靶蛋白對接后，發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素與AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF均有較好的結(jié)合能力，見表4。再采用PyMOL軟件對靶點(diǎn)蛋白與成分對接的最佳構(gòu)象進(jìn)行可視化分析，直觀展示其構(gòu)象關(guān)系，以槲皮素為例，見圖6。

表3 藥物-疾病核心靶點(diǎn)基因

表4 藥物-疾病核心靶點(diǎn)基因

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了牛膝-杜仲藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的現(xiàn)代分子生物學(xué)以及藥理學(xué)機(jī)制。結(jié)果顯示，牛膝-杜仲藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)共132個(gè)，核心靶點(diǎn)包括IL6、TP53、AKT1、VEGFA、MMP9等，并可能通過參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控等生物學(xué)進(jìn)程，影響蛋白、酶、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合等分子功能[7]。TP53便具有抑制DNA復(fù)制，阻斷細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，加速軟骨降解的作用[8]，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)牛膝提取物可以在體外抑制大鼠變性軟骨細(xì)胞中p53的表達(dá)[9]。AKT1是PI3K信號通路中重要的下游靶點(diǎn)激酶，其參與的PI3K/AKT信號通路是抗軟骨細(xì)胞凋亡的重要通路[10]。研究證實(shí)促炎因子IL-6在膝骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液、滑膜，軟骨下骨和軟骨中表達(dá)升高。IL-6還可引起基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9表達(dá)的升高，抑制蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的合成，加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，并可通過激活破骨細(xì)胞在骨吸收中起關(guān)鍵作用[11]。VEGFA同樣參與了膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變和骨贅形成等病理反應(yīng)[12]，研究顯示VEGFA可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂進(jìn)而促進(jìn)血管的新生，加速膝關(guān)節(jié)的營養(yǎng)物質(zhì)的交換以及炎性產(chǎn)物的代謝[13]，促進(jìn)軟骨滑膜細(xì)胞的修復(fù)，此外VEGFA具有加速骨形成同時(shí)抑制骨吸收的作用[14]。

本研究顯示，牛膝-杜仲藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的有效成分主要為槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素以及β-胡蘿卜素等，這些小分子成分大多具有抗氧化、抗炎以及軟骨保護(hù)作用。槲皮素是一種具有抗炎、抗氧化作用的多酚類生物黃酮，研究表明其可清除活性氧自由基，改善機(jī)體的氧化應(yīng)激[15]，緩解膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀，并可減緩大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)展速度[16]，亦可抑制基質(zhì)降解蛋白酶和炎性介質(zhì)的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)軟骨合成代謝因子的產(chǎn)生，減輕膝關(guān)節(jié)軟骨的降解以及軟骨細(xì)胞的凋亡[17]，而黃芩素、山柰酚與槲皮素作用相似[18]。漢黃芩素已被證實(shí)可通過抑制炎性介質(zhì)如IL6、COX-2等的表達(dá)，并降低基質(zhì)金屬蛋白酶如MMP-13、MMP9等的表達(dá)，發(fā)揮其抗炎及軟骨保護(hù)作用[19]。β-胡蘿卜素可用于治療多種因衰老引起的退行性病變，已被證實(shí)可通過抑制NF-κB信號通路抑制炎性因子的表達(dá)[20]。

牛膝-杜仲藥對在治療膝骨關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)蛋白涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、破骨細(xì)胞分化、Toll樣受體信號通路等，與軟骨細(xì)胞的凋亡、分化及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、骨的重塑與吸收等密切相關(guān)。TNF-α可與膜受體結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和MAPK信號通路，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)進(jìn)而誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，并誘導(dǎo)IL6等炎癥因子產(chǎn)生，加劇軟骨的破壞[21]。HIF-1是維持軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和支持細(xì)胞分化的重要因素[22]，研究表明HIF-1α可通過抑制β-catenin轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)軟骨細(xì)胞中MMP13的表達(dá)，從而延緩骨關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)展，缺乏HIF-1α則可加速軟骨的分解代謝[23]。Toll樣受體(TLR)是跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，研究顯示，TLRs在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[24]，TLR1-7和TLR9在關(guān)節(jié)炎患者的滑膜中上調(diào)，而TLR4與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度有關(guān)[25]，TLR2/TLR4信號通路誘導(dǎo)IL-1和MMPs表達(dá)，增加NO和PGE2的產(chǎn)生，加速蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞，并促進(jìn)膝骨關(guān)節(jié)炎的形成[26-27]。作為骨關(guān)節(jié)炎的重要治療靶點(diǎn)，破骨細(xì)胞可參與骨吸收以維持骨重塑的動(dòng)態(tài)平衡[28]，已有研究證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎的形成與趨化因子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化異常有關(guān)[29]。分子對接顯示，牛膝-杜仲藥對關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白結(jié)合時(shí)的結(jié)合能均小于0 kcal/mol，提示其結(jié)合活性較好，證實(shí)了牛膝-杜仲藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的靶向作用。

綜上所述，牛膝-杜仲藥對在膝骨關(guān)節(jié)炎的治療中可能涉及不同靶點(diǎn)和通路，并在調(diào)控細(xì)胞凋亡、軟骨基質(zhì)降解、炎癥反應(yīng)以及骨重塑中發(fā)揮治療作用，延緩膝骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。