陸馨雨， 張澤宇， 司鵬飛， 秦路平， 王小艷

(浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310000)

新冠肺炎病毒肺炎(COVID-19)是影響全球社會發(fā)展的重大公共衛(wèi)生事件[1]。中醫(yī)認為，COVID-19屬于“寒濕疫”的范疇[2]，病因為濕毒[3]，病機為濕毒壅肺、阻遏氣機，病位在肺，多涉及脾、胃，重癥期可波及心、腎[4]。我國臨床醫(yī)生及科研團隊嘗試運用中醫(yī)藥經(jīng)典方劑或現(xiàn)有中成藥對新冠肺炎開展辨證施治，從中篩選抗新型冠狀病毒的有效藥物，復方板藍根顆粒(FFBLG)是一種實驗有效的陽性候選藥物。

復方板藍根顆粒的主要組成為大青葉與板藍根，兩者植物基源相同[5]。中醫(yī)認為，這2味藥物性味均苦寒，善能清熱解毒，此外還具涼血、消腫之效，因而被歷代醫(yī)家廣泛用于治療各類傳染性疫病(古稱“天行”)，尤其是伴有出血、發(fā)斑或咽喉腫痛者。在現(xiàn)代臨床治療中，復方板藍根顆粒主要用于風熱感冒、咽喉腫痛等癥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，板藍根及大青葉對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腮腺炎病毒、流感病毒、乙肝病毒等均有一定的抑制作用。本研究運用中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺(TCMIP)V2.0[6]，旨在通過數(shù)據(jù)挖掘與分析，構建方劑-中藥材-成分-核心靶標-通路-疾病多維關系網(wǎng)絡，闡釋復方板藍根顆粒干預新型冠狀病毒肺炎的潛在作用機制，為臨床應用及新藥開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 有效成分及相應靶標分析 采用TCMIP V2.0平臺(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)，在“中藥材數(shù)據(jù)庫”模塊中檢索板藍根、大青葉所有化學成分，根據(jù)結構類似的生物分子化合物具有類似的理化性質和生物活性原理，在TCMIP V2.0中采用化合物二維結構相似性搜索，通過與FDA上市藥物進行Tanimoto系數(shù)計算相似性分值，預測有效成分相應靶標[7]。本研究選擇相似性≥0.8作為篩選條件，得到有效成分預測作用靶標，并進一步數(shù)據(jù)標準化，自主創(chuàng)建數(shù)據(jù)集“復方板藍根顆粒方劑庫”。

1.2 COVID-19疾病靶標分析 TCMIP V2.0平臺中疾病相關的靶標基因及其相關數(shù)據(jù)來源于基因相關性數(shù)據(jù)庫(DisGeNET)、人類表型本體數(shù)據(jù)庫(HPO)、Drugbank數(shù)據(jù)庫、治療靶標數(shù)據(jù)庫(TTD)等[8]，本研究選擇“疾病相關分子集及其功能挖掘”模塊，根據(jù)COVID-19在臨床上的3個主要癥狀，即“肺炎(pneumonia)”“發(fā)燒(fever)”“咳嗽(cough)”，挖掘獲得相應的靶標基因，由此構建相關疾病靶標[9-10]。

1.3 干預COVID-19潛在作用靶標分析 采用Venn Diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，將“1.1”“1.2”項下所得復方板藍根顆粒有效成分的靶標與COVID-19疾病靶標進行映射，從而獲得干預COVID-19的潛在作用靶標。

1.4 靶點蛋白互作網(wǎng)絡構建及核心靶標篩選 采用TCMIP V2.0平臺中的“中醫(yī)藥關聯(lián)網(wǎng)絡挖掘”模塊，得到靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡。在選擇核心節(jié)點的基礎上，以連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)的中位數(shù)為卡值，以同時滿足三者為條件篩選出核心靶標。

1.5 基因功能GO分析、信號通路Reactome Pathway富集分析 采用TCMIP V2.0平臺中的“中醫(yī)藥關聯(lián)網(wǎng)絡挖掘”模塊，對“1.4”項下所得核心靶標進行基因功能GO分析和信號通路Reactome Pathway富集分析，以P值升序排列，其值越小，分析可信度越高。

2 結果與討論

2.1 有效成分與相應靶標預測 復方板藍根顆粒中板藍根、大青葉所含有效成分共39種，前者25種，后者24種；相應靶標389個，前者290個，后者336個。

2.2 COVID-19疾病靶標 根據(jù)COVID-19在臨床上的3個主要癥狀，獲得COVID-19相關的疾病靶標共258個。

2.3 干預COVID-19的潛在作用靶標 將“2.1”“2.2”項下復方板藍根顆粒有效成分靶標與COVID-19疾病靶標映射取交集，共獲得16個干預COVID-19的潛在作用靶標(圖1)，包括VCP、ABCC2、ABL1、ADA、AK2、FBP1、HBB、NME1、PRKAR1A、TLR4、TP53、ACTA1、NFκB1、NFκB2、PNP、PRKCD。其中，AK2定位于線粒體的膜間隙，主要功能是作用于底物AMP，并通過催化可逆的磷酸基轉移反應來激活ATP濃度敏感的信號通路[7,11]，在細胞凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用[12]；NME1基因是一種腫瘤轉移抑制基因，其啟動子區(qū)rs16949649、rs3760468、rs3760469、rs2302254等單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點基因多態(tài)性與肺癌易感性和預后存在關聯(lián)，SNPs基因突變可影響NME1基因啟動子與轉錄因子的結合, 進而影響其轉錄和蛋白表

達，并影響腫瘤發(fā)生風險和預后[13]；TLR4主要通過激活核轉錄因子κB炎癥通路后啟動轉錄調控、炎癥反應及免疫調節(jié)等作用[14]，與病源相關分子模式和損傷相關分子模式相結合，促進IL-6、IL-1、IFN-γ、TNF-α等免疫炎癥因子分泌，進而趨化、激活巨噬細胞及中性粒細胞，導致呼吸道、肺泡及肺血管炎癥反應產生[15]；TP53是編碼腫瘤蛋白p53的抑癌基因，為人類多種癌癥中最常見的突變基因之一[16]，其突變型可促進腫瘤細胞增殖、遷移、生存、侵襲，增強腫瘤細胞耐藥性，破壞正常組織的生理結構，促進腫瘤細胞代謝[17]；NF-κB是一種廣泛存在于真核生物內的轉錄因子，NFκB1、NFκB2為其家族成員，其通路在細胞增殖、存活、早期病毒應答及細胞因子分泌、促炎等方面具有重要作用[18]。根據(jù)交叉靶標目前已發(fā)現(xiàn)的功能特點來推測，復方板藍根顆粒干預COVID-19時可能主要參與炎癥反應、激活ATP、調節(jié)細胞凋亡、參加免疫反應、抑制細胞增殖分化、清理氣道、改善通氣等，通過修復或緩解肺損傷、咳喘、呼吸困難等主要癥狀起到防治作用。

2.4 干預COVID-19的多維關系網(wǎng)絡 采用TCMIP V2.0的數(shù)據(jù)分析平臺，構建復方板藍根顆粒干預COVID-19的方劑-中藥材-成分-核心靶標-通路-疾病多維關系網(wǎng)絡，見圖2。由此可知，干預作用主要與5種有效成分相關聯(lián)，作用于17條主要通路的76個核心靶標，即能通過多途徑、多靶標、多環(huán)節(jié)來干預COVID-19。

2.5 干預COVID-19的核心靶標網(wǎng)絡 核心靶標共26個，見表1。其中，Akt1是PI3K途徑中重要的分子，活化后可磷酸化下游多個細胞激酶[19]，PI3K/Akt信號通路是腫瘤研究的熱門通路，在肺腺癌中被激活，并與低分化、進展期和淋巴結轉移等相關，并且Akt1是肺腺癌預后的影響因素之一[20]；TSC1/2復合體位于PI3K-Akt下游，Akt磷酸化可通過抑制TSC1/TSC2的活性來對細胞增殖產生影響，同時TSC1對細胞的增殖具有調節(jié)作用[21-22]，TSC1表達升高有助于抑制人胚肺成纖維細胞的增殖與分化，對肺纖維化起到抑制作用[23]；IL10通過作用于不同的免疫細胞介導免疫抑制，使其產生相關細胞因子或抑制某些分子的表達，介導體內抗腫瘤免疫抑制，從而使機體出現(xiàn)細胞增殖失控、免疫逃逸[24-27]，主要由Treg、Breg細胞的某些特定亞型分泌抑制性調節(jié)因子，肺癌患者體內往往都存在不同程度的免疫抑制，兩者作為腫瘤微環(huán)境的重要負性調節(jié)成分，介導免疫抑制[28]；IL-6/IL-10對重癥肺炎具有較好診斷價值，可用于鑒別入院時重癥肺炎，有助于篩查可能發(fā)生嚴重并發(fā)癥的風險，對臨床治療具有一定指導意義[29]；JAK2激活后可使STAT的酪氨酸磷酸化，JAK2/STAT3信號通路的激活參與肺癌發(fā)生發(fā)展及機體細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程[30-31]；BCL2位于線粒體外膜上，其家族在凋亡基因調控中起著重要作用[32]，主要通過促進抗凋亡基因的表達、抑制促凋亡基因表達、干擾線粒體膜的通透性來阻礙肺癌細胞凋亡。根據(jù)核心靶標目前已發(fā)現(xiàn)的功能特點推測，復方板藍根顆粒可能參與炎癥反應、調節(jié)細胞凋亡、參加免疫反應、抑制細胞增殖分化、抑制肺纖維化等，推測可能通過抗炎、調節(jié)免疫、修復肺功能等途徑來干預COVID-19。

表1 復方板藍根顆粒干預COVID-19核心靶標

2.6 核心靶標生物功能注釋和通路富集 表2顯示，復方板藍根顆粒干預COVID-19主要通過影響細胞因子介導的信號通路、凋亡過程、蛋白質磷酸化、磷酸化、轉錄正調控、DNA模板、細胞對DNA損傷刺激的反應、B細胞增殖、凋亡過程的負調控、凋亡的調控、I-κB激酶/NF-κB信號傳導、DNA損傷誘導蛋白磷酸化、基因表達的正調控、B細胞分化、對脂多糖的反應、病毒過程、細胞對機械刺激的反應、對UV-B的反應、細胞周期停滯、對γ射線的反應、B細胞活化等生物過程發(fā)揮作用。表3顯示，復方板藍根顆粒干預COVID-19主要通過影響白介素4和白介素13信號、IκBA變體導致EDA-ID、RHO GTPases激活NADPH氧化酶、磷酸化調節(jié)TP13活性、白介素7信號、ZBP1進行RIP介導的NFκB激活、白介素10信號、顆粒狀外源抗原的交叉展示、RUNX2調節(jié)成骨細胞分化、TRAF6介導的NF-κB激活、白介素9信號、白介素23信號、TP53調節(jié)代謝基因、白細胞介素受體SHC信號、白介素12信號、MAPK3(ERK1)激活、白介素21信號、在NMDAR下游激活AMPK，LκB1-AMPK對mTOR的能量依賴性調節(jié)、白介素6信號等信號通路發(fā)揮作用。

表2 復方板藍根顆粒干預COVID-19核心靶點GO功能分析(前20條生物過程)

表3 復方板藍根顆粒干預COVID-19核心靶標的Reactome Pathway分析(前20條信號通路)

復方板藍根顆粒干預COVID-19核心靶標的Reactome Pathway富集分析見圖3，可知白介素信號通路較為主要。已有研究表明，白介素信號通路影響多種生物過程，如IL-13能夠對氣道炎癥與免疫反應進行有效調節(jié)[33]；IL-7高表達與非小細胞肺癌分期、淋巴結轉移和預后不良正相關[34]；IL-10是一種重要的抑炎性細胞因子，可參與機體的免疫功能和炎癥過程，具有廣泛的抑制炎性因子的作用[35]；IL-9和IL-10之間存在密切聯(lián)系，兩者相互作用影響，前者可作用于參與哮喘等多種疾病發(fā)病的炎癥細胞中[36]；IL-17是由輔助性T細胞17(Th17)分泌的一種促炎癥細胞因子；IL-23是一種促進Th17細胞產生IL-17表達的調節(jié)因子[37]；IL-12主要由抗原刺激的單核細胞/巨噬細胞產生, 可通過調控JAK-STAT信號通路分別誘導干擾素γ (IFN-γ)、IL-17表達，從而發(fā)揮促炎作用[38]；IL-21可促進IL-17的表達，兩者協(xié)同作用時可誘導TNF-α、IL-6、GM-CSF等促炎因子，影響氣道纖維結締組織的形成和平滑肌的增生[39]；IL-6是早期炎癥反應的細胞因子，由纖維母細胞、上皮細胞、單核/巨噬細胞及T、B淋巴細胞等產生，可誘導細胞毒性T淋巴細胞的增殖分化，增強自然殺傷細胞(NK細胞)活性，促使?jié){細胞分泌抗體，刺激肝細胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應[40]。因此，白介素信號通路多與肺部損傷、炎癥與免疫反應有關。

3 結論

本研究基于TCMIP V2.0平臺的數(shù)據(jù)挖掘與分析功能，獲得并預測了復方板藍根顆粒組方中兩味中藥的有效成分及其作用靶標，同時根據(jù)COVID-19的3個主要臨床癥狀構建了COVID-19相關的疾病靶標，通過靶標映射、基因功能GO分析、信號通路Reactome Pathway富集分析等研究發(fā)現(xiàn)，復方板藍根顆?？赡苤饕ㄟ^影響白介素信號通路等，以達到抗炎、調節(jié)免疫、調節(jié)細胞凋亡、抑制細胞增殖分化、修復肺部損傷等多方面的作用，從而起到干預COVID-19的綜合功效。此外，根據(jù)新冠肺炎4個病期的證候以及臨床表現(xiàn)[41]，本研究推測復方板藍根顆?？赡軐π鹿诜窝椎母煽?、咳嗽喘憋、呼吸困難、動輒氣喘或需要輔助通氣等癥狀起到一定的干預治療作用，適用于COVID-19各個病期階段的治療，相關的功效物質基礎及其作用機制還有待進一步實驗研究及臨床驗證。