王瑩瑩,沈瑞芬,梁耀軍

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，蘭州 730030)

腹膜透析是終末期腎病的一種替代治療方法。腹膜炎是腹膜透析最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是腹膜透析技術(shù)失敗最常見(jiàn)的原因[1-2]。急性腹膜炎的特點(diǎn)是腹膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮交換面積增加、小溶質(zhì)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)增加、滲透梯度下降，最后導(dǎo)致超濾失敗，透析液蛋白丟失增加[3-4]。理想的動(dòng)物腹膜透析模型能夠充分模擬人體腹膜透析過(guò)程，體現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)的病理生理學(xué)特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)變化以及腹膜局部防御機(jī)制，為臨床前研究提供研究基礎(chǔ)。腹膜透析動(dòng)物模型的造模方法有多種，不同研究選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類和品系、造模方法、造模試劑等也存在差異[5-8]。腹膜炎動(dòng)物模型可分為急性腹膜炎模型和慢性腹膜炎模型。急性腹膜炎模型造模時(shí)間短，研究單次腹腔注射造模介質(zhì)對(duì)腹膜的影響，主要用于研究水和溶質(zhì)的滲透性以及透析液、干預(yù)劑、炎癥介質(zhì)等的相互作用[9]。慢性腹膜炎模型的造模時(shí)間較長(zhǎng)，是先給動(dòng)物腹腔植入腹膜透析導(dǎo)管，通過(guò)導(dǎo)管灌注腹透液數(shù)天后再灌入造模試劑，主要用于評(píng)估長(zhǎng)期腹膜透析后腹膜的變化，其過(guò)程更接近于人體腹膜透析過(guò)程。慢性腹膜炎模型可用于研究腹膜纖維化、包裹性腹膜硬化、反復(fù)發(fā)作的腹膜炎和腹膜形態(tài)學(xué)改變[10]?，F(xiàn)從腹膜透析相關(guān)性腹膜炎動(dòng)物模型的動(dòng)物選擇、造模試劑及具體操作方法、模型評(píng)價(jià)、模型應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

構(gòu)建腹膜透析相關(guān)性腹膜炎模型的動(dòng)物可分為大型動(dòng)物(如家兔、狗、豬、羊、袋鼠)和小型動(dòng)物(如大鼠、小鼠)，目前主要采用小型動(dòng)物建模。每種動(dòng)物模型都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)[3,6,11-14]。家兔的預(yù)期壽命長(zhǎng)，腹膜透析導(dǎo)管植入更容易，但家兔較敏感，飼養(yǎng)和繁殖困難；鼠類易繁殖、費(fèi)用低,但壽命較短、體積小,并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高[12]。在腹膜透析相關(guān)性腹膜炎動(dòng)物模型的構(gòu)建中大鼠和小鼠使用最廣泛，大鼠模型和小鼠模型造模方法、模型結(jié)果相似，主要區(qū)別是建立模型所需的時(shí)間和所使用的透析液或藥物的劑量不同，大鼠模型的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得更多的樣本，特別是血液、腹透液和尿液樣本。小鼠建模獲得的樣本量少，但由于轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用，小鼠模型在機(jī)制研究方面具有優(yōu)勢(shì)[3,13-14]。如需了解腹膜透析對(duì)殘余腎功能的影響，腹膜透析動(dòng)物模型必須與腎功能不全模型結(jié)合使用，腎功能不全模型常采用5/6腎切除術(shù)，也可以采用雙腎切除模型[3]。但在5/6腎切除和腹膜透析雙重應(yīng)激下模型動(dòng)物存活率較低，如僅為了闡明腹膜透析過(guò)程中腹膜的變化，只需要建立腎功能正常的動(dòng)物模型。腹膜透析相關(guān)性腹膜炎動(dòng)物模型多采用腎功能正常模型。

2 造模試劑及劑量

細(xì)菌性腹膜炎是腹膜透析技術(shù)失敗的主要原因，最常用的造模試劑為革蘭陰性菌(常見(jiàn)為大腸埃希菌)及其來(lái)源的脂多糖，此外表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等也是引起腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的常見(jiàn)細(xì)菌。此外，也可采用其他微生物(如酵母菌)致真菌性腹膜炎。

2.1脂多糖和革蘭陰性菌 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎動(dòng)物模型造模選用最多的造模試劑為脂多糖，脂多糖主要來(lái)源于革蘭陰性菌[14-16]。最常見(jiàn)的革蘭陰性菌是大腸埃希菌，而脂多糖是大多數(shù)革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分，也是炎癥強(qiáng)有力的誘發(fā)劑，反復(fù)向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射大腸埃希菌可導(dǎo)致腹膜持續(xù)炎癥[15-17]。脂多糖大多來(lái)自大腸埃希菌，血清型為0111∶B4，造模方法是腹腔內(nèi)單次注射脂多糖。在大鼠模型中，脂多糖的單次注射劑量為1 mg/kg；在小鼠模型中，脂多糖的單次注射劑量為10 mg/kg[15,17-18]。文獻(xiàn)報(bào)道，單次給予脂多糖劑量為2 mg/kg時(shí)會(huì)致全部大鼠死亡，給予1 mg/kg時(shí)可致不同比例的大鼠死亡，給予<0.1 mg/kg劑量的脂多糖全部大鼠存活[19]。單次腹腔注射脂多糖，急性腹膜炎常發(fā)生在48 h內(nèi)[17]。與脂多糖模型相比，大腸埃希菌暴露模型可誘導(dǎo)更強(qiáng)的白細(xì)胞浸潤(rùn)，透析液中白細(xì)胞數(shù)量顯著增加，但兩種模型中水通道蛋白1的表達(dá)均未發(fā)生變化[5]。小鼠模型可用采用109/ml菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)的大腸埃希菌稀釋于2 ml透析液中進(jìn)行造模[5,19]，或用2×107CFU，每周注射1次，共注射4次造模[16,19]。另外，通常在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最終的注射劑量。

2.2革蘭陽(yáng)性菌 革蘭陽(yáng)性菌，特別是凝固酶陰性葡萄球菌，是腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的常見(jiàn)致病菌[1-2]。表皮葡萄球菌是最常見(jiàn)的凝固酶陰性葡萄球菌，給予每只小鼠熱殺傷表皮葡萄球菌5×108CFU，每周注射1次，共注射4次，小鼠可以存活49 d[14,20]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，給予每只小鼠腹腔注射表皮葡萄球菌5×108CFU的劑量不致命，急性感染發(fā)生在注射后24～36 h[16]。另一種方法是模擬與器械相關(guān)的腹膜炎，將擬植入的腹膜透析導(dǎo)管在表皮葡萄球菌1457中培養(yǎng)120 h，誘導(dǎo)導(dǎo)管生物膜形成，再將導(dǎo)管植入動(dòng)物體內(nèi)，每24小時(shí)沖洗1次導(dǎo)管進(jìn)行造模[17]。

金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的常見(jiàn)細(xì)菌，感染后表現(xiàn)為腹腔導(dǎo)管出口部位及隧道炎癥、腹膜炎及腹腔膿腫。向C57BL/6 J和BALB/c小鼠腹腔注射金黃色葡萄球菌2×108CFU可導(dǎo)致0～25%的小鼠在15 d內(nèi)死亡，接種量增加到(5～7)×108CFU，50%～70%的小鼠在24 h死亡，劑量繼續(xù)增加至1×109CFU可導(dǎo)致90%的小鼠在12 h內(nèi)死亡，尸檢和組織病理學(xué)檢查均顯示接種點(diǎn)腹腔膿腫[12]。van Westrhenen等[21]分別給予大鼠含1×104、1×106、1×108CFU的金黃色葡萄球菌ATCC 25923懸液0.5 ml單次腹腔注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn),這3種劑量的細(xì)菌菌落都會(huì)導(dǎo)致大鼠發(fā)生非致命性腹膜炎，高劑量組大鼠存活率低于劑量組。

2.3其他微生物 真菌性腹膜炎是一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，致死率高，預(yù)后較差。酵母菌常用于腹膜透析相關(guān)性真菌性腹膜炎造模。真菌性腹膜炎多采用腹膜刮擦法進(jìn)行造模，造模關(guān)腹時(shí)腹腔注射含有酵母菌懸浮液的高糖腹膜透析液5 mg/2 ml，關(guān)腹后繼續(xù)給予酵母菌懸浮液直接注射，關(guān)腹后即刻5 mg/5 ml，關(guān)腹后2～4 d每日再給予10 mg/10 ml酵母菌懸浮液，共注射5 d，每次注射后均需按摩腹部，使酵母菌懸浮液在整個(gè)腹腔內(nèi)擴(kuò)散[22-23]。Mizuno和Ito[22]比較了不同劑量酵母菌造模的差異發(fā)現(xiàn)，腹腔壁厚度和炎癥細(xì)胞數(shù)量與酵母菌劑量相關(guān)。

3 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎造模操作

腹膜透析相關(guān)性腹膜炎造模法可概括為3種：腹腔直接注射造模試劑法、通過(guò)腹膜透析導(dǎo)管造模法以及腹膜刮擦法。

3.1腹腔直接注射造模試劑法 在麻醉或不麻醉動(dòng)物的情況下消毒動(dòng)物下腹壁，用注射器和針頭直接向腹腔注射造模試劑或含有一定量造模試劑的透析液，皮膚穿刺僅限于腹部下象限，注射時(shí)左右下象限交替使用，注射過(guò)程中注意避免穿通腸管。重復(fù)注射會(huì)增加腹腔內(nèi)出血和感染的可能，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8,24]。腹腔直接注射造模試劑法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，建立模型需要時(shí)間短，是目前研究中最常選用的方法，該方法的缺點(diǎn)是易引起腸穿孔和透析液滲漏。

3.2通過(guò)腹膜透析導(dǎo)管造模法 動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，在動(dòng)物腹壁正中做一個(gè)小切口，然后將一根特殊的導(dǎo)管通過(guò)皮下隧道插入動(dòng)物頸部或背部，將導(dǎo)管的另一端植入腹腔，最后縫合腹膜和腹壁[3,6,9-10]。每日通過(guò)導(dǎo)管給動(dòng)物注射肝素配比的氯化鈉或等滲氯化鈉，防止導(dǎo)管阻塞。導(dǎo)管多為硅膠材質(zhì)，直徑和長(zhǎng)度可以根據(jù)動(dòng)物體型定制。通過(guò)腹膜透析導(dǎo)管給藥的優(yōu)點(diǎn)是能模擬腹膜炎的病理生理過(guò)程，可用于觀察長(zhǎng)期腹膜透析后腹膜的形態(tài)學(xué)變化，多用于研究反復(fù)發(fā)作性腹膜炎及導(dǎo)管定植菌相關(guān)性腹膜炎[6]。該方法的缺點(diǎn)是手術(shù)操作難度較大，飼養(yǎng)時(shí)感染風(fēng)險(xiǎn)較高，死亡率較高，導(dǎo)管的額外費(fèi)用高[3]。同時(shí)腹腔導(dǎo)管植入增加了腹膜壁層白細(xì)胞滾動(dòng)和外滲、腹膜纖維化和血管化風(fēng)險(xiǎn)[25]。腹膜炎過(guò)程中易發(fā)生導(dǎo)管堵塞和透析液滲漏[6,9]，通過(guò)導(dǎo)管給予肝素后又會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響[8]。

3.3腹膜刮擦法 動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，用15 ml的無(wú)菌聚丙烯管頂端以2次/s的頻率機(jī)械刮擦動(dòng)物右側(cè)腹膜壁層60 s，刮擦方向每隔5 s轉(zhuǎn)換1次(如由垂直方向改為水平方向或反之)，刮擦動(dòng)物腹膜表面時(shí)，用鉗子緊緊捏住打開的腹膜邊緣，防止刮擦過(guò)程中腹膜移動(dòng)。如果在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)需測(cè)量腹膜功能，必須同時(shí)刮擦腹膜左右兩側(cè)[24,26]。切口縫合后通過(guò)腹腔注射酵母菌懸浮液，每次注射后均需按摩腹部，使酵母菌在整個(gè)腹腔內(nèi)擴(kuò)散，刮擦后1～7 d觀察腹膜炎征象。腹膜刮擦法常用于真菌性腹膜炎造模，該方法的缺點(diǎn)是刮擦過(guò)程需要較高的技術(shù)[3,23]。

4 腹膜組織的處理及觀察

4.1腹膜標(biāo)本取樣和處理 與腹膜透析患者不同，動(dòng)物模型極少應(yīng)用引流裝置。膜透析相關(guān)性腹膜炎動(dòng)物模型造模成功的診斷不能基于透析液細(xì)胞數(shù)量的增加，診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是腹膜組織存在廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[21]。腹膜組織非常脆弱，暴露在空氣中會(huì)迅速干燥，易損傷,在處理模型動(dòng)物時(shí)必須謹(jǐn)慎。剪腹壁時(shí)，動(dòng)作要輕柔避免用力拉伸，在模型動(dòng)物上腹部左上象限或腹部中線附近的左下象限或置管位置對(duì)側(cè)的橫切面收集壁腹膜[11]。壁腹膜覆蓋在腹壁肌肉組織上，需與腹壁肌肉組織一同取下固定，注意避開穿刺部位。剪下腸系膜及網(wǎng)膜，留取臟腹膜。真菌性腹膜炎取腹膜標(biāo)本前應(yīng)仔細(xì)檢查腹壁刮擦部位，確定取材部位[22]。收集壁腹膜和臟腹膜，標(biāo)本用10%緩沖甲醛固定，石蠟包埋，薄切片；臟腹膜可用液氮冷凍[6,17,23]。

4.2腹膜病理學(xué)表現(xiàn) 腹膜炎的特征是腹膜白細(xì)胞浸潤(rùn)，病理切片上表現(xiàn)為腹膜厚度增加、明顯水腫、大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，腹膜血管增生伴擴(kuò)張[5,15,18]。組織切片可用蘇木精-伊紅染色和Masson染色，蘇木精-伊紅染色可觀察腹膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況及腹膜厚度，Masson染色下測(cè)量腹膜厚度，在每個(gè)切片上隨機(jī)取5～6個(gè)位置測(cè)量腹膜厚度，取其平均值。小天狼星紅染色可用于觀察膠原蛋白，采用內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31標(biāo)記后,沿腹膜橫切面全長(zhǎng)進(jìn)行腹膜血管計(jì)數(shù)，記為腹膜血管數(shù)/mm。亦可用免疫印跡、免疫組織化學(xué)、免疫熒光等觀察腹膜組織[5]。

5 腹膜平衡實(shí)驗(yàn)

腹膜平衡實(shí)驗(yàn)是監(jiān)測(cè)腹膜透析過(guò)程中溶質(zhì)和液體轉(zhuǎn)運(yùn)情況的重要方法，用于評(píng)價(jià)腹膜功能。腹膜平衡實(shí)驗(yàn)需要在短時(shí)間內(nèi)收集腹膜透析液，常采用腹腔注射或向腹腔植入腹膜透析導(dǎo)管的方法注入透析液[3]。關(guān)于腹膜透析動(dòng)物模型腹膜平衡實(shí)驗(yàn)的腹腔灌入量存在爭(zhēng)議，通常大鼠腹膜透析模型的腹腔灌注量為10～30 ml，小鼠為1.5～2.5 ml[26]。大量灌注腹透液會(huì)引起模型動(dòng)物疼痛和腹腔滲漏[3,18]。對(duì)于大鼠腹膜透析模型：通常向腹腔內(nèi)注入25 ml含4.25%葡萄糖的常規(guī)腹膜透析液，保留4 h后收集腹腔內(nèi)透析液，記錄標(biāo)本容積并測(cè)量尿素氮、肌酐、葡萄糖的水平，腹膜超濾量通過(guò)計(jì)算灌入前后腹透液差值獲得，同時(shí)需通過(guò)尾靜脈、頸內(nèi)動(dòng)脈或心臟穿刺留取動(dòng)物血液標(biāo)本。在小鼠模型中，接受2 h腹膜透析液交換，使用4.25%或7%的葡萄糖透析液2 ml進(jìn)行腹膜平衡實(shí)驗(yàn)[18]。腹透液標(biāo)本收集可以通過(guò)導(dǎo)管留取或?qū)?dòng)物處死后打開腹腔收集殘存的腹透液。為了便于收集腹腔內(nèi)所有液體，打開腹膜腔時(shí)用巴斯德吸管收集透析液或使用稱重法預(yù)先稱重一塊紗布，可通過(guò)計(jì)算紗布被腹腔液體浸泡前后的重量變化計(jì)算吸收的液體量[9,18]。

6 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎動(dòng)物模型的應(yīng)用

腹膜透析相關(guān)性腹膜炎動(dòng)物模型主要應(yīng)用于：①腹膜透析相關(guān)性腹膜炎發(fā)生機(jī)制、腹膜結(jié)構(gòu)及功能變化的研究，如水和溶質(zhì)在腹膜中的轉(zhuǎn)運(yùn)、腹膜炎癥過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞因子、趨化因子和補(bǔ)體的作用等[15,17,20,27-30]。②觀察某些新型阻斷炎癥因子的化合物在腹膜炎中的抗炎、抗氧化活性及可能的毒性作用，為后期治療急性腹膜透析相關(guān)性腹膜炎提供依據(jù)[5,8,17]。

7 小 結(jié)

腹膜透析相關(guān)性腹膜炎仍是導(dǎo)致腹膜透析患者技術(shù)失敗的主要原因之一,是終止腹膜透析轉(zhuǎn)至血液透析的主要原因。研究腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的一個(gè)重要步驟是建立可以模擬臨床情況并可復(fù)制的動(dòng)物模型，而腹膜炎動(dòng)物模型的建立是實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究中不可或缺的部分。腹膜透析相關(guān)性腹膜炎動(dòng)物模型的構(gòu)建過(guò)程要結(jié)合不同的研究設(shè)計(jì)方案、目的，選擇不同的造模動(dòng)物，合適的干預(yù)試劑及造模操作方法。腹膜炎模型建立過(guò)程中除了要注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作過(guò)程中需普遍注意的事項(xiàng)外，還要掌握腹膜取樣及保存方法，腹膜平衡實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程的細(xì)節(jié)問(wèn)題。目前腹膜炎動(dòng)物模型相關(guān)研究中大多采用急性模型，但在反復(fù)發(fā)作性腹膜炎及導(dǎo)管定植相關(guān)的腹膜炎研究中仍需采用慢性模型。慢性腎衰竭模型并發(fā)癥多，模型動(dòng)物死亡率高，在腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的動(dòng)物模型中大多數(shù)采用腎功能正常的模型，不能完全模擬終末期患者腹膜透析的過(guò)程。因此，在未來(lái)腹膜透析相關(guān)的臨床前研究中，仍需要積極探索更好的模擬終末期腎病人體腹膜透析過(guò)程的動(dòng)物模型。