糖尿病視網(wǎng)膜病變免疫機制的研究進展△

劉自強 接傳紅 王建偉 鄧 宇 李媛媛

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是我國工作年齡人群中排名第一位的可預(yù)防性致盲性疾病[1]。既往多數(shù)研究認為，DR的病理過程主要包括周細胞喪失、內(nèi)皮細胞增生、基底膜增厚、管腔狹窄或閉塞、視網(wǎng)膜缺血缺氧、血管新生等[2]。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)DR患者血清中存在多種自身抗體，如抗醛縮酶抗體和抗周細胞抗體等[3-4]，抗生素、免疫抑制劑和皮質(zhì)類固醇藥物治療DR的有效性表明[5]，免疫系統(tǒng)失調(diào)和炎癥是DR病理生理學的重要因素。因此，本文從血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)、小膠質(zhì)細胞、補體系統(tǒng)、細胞因子等方面進行綜述，探討免疫機制在DR血管病變和神經(jīng)變性中的作用。

1 BRB

視網(wǎng)膜受高度復(fù)雜免疫機制的保護，BRB作為視網(wǎng)膜與人體免疫系統(tǒng)間的一道天然物理屏障，是視網(wǎng)膜免疫防護的第一道防線。BRB由血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(iBRB)和血-視網(wǎng)膜外屏障(oBRB)組成。其中iBRB由視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞間的緊密連接構(gòu)成，oBRB由位于Bruch膜上的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞之間的緊密連接構(gòu)成[6]。BRB將視網(wǎng)膜與外源性病原體隔離，使組織與全身免疫系統(tǒng)避免免疫監(jiān)視，為視網(wǎng)膜提供第一層免疫保護，一旦BRB被突破，則觸發(fā)視網(wǎng)膜免疫抑制，啟動第二道、第三道免疫防護[7]。

在DR中，由于廣泛的BRB損傷，視網(wǎng)膜免疫特權(quán)被破壞，免疫耐受性大幅度降低，免疫偏離功能喪失，大量循環(huán)免疫細胞浸潤視網(wǎng)膜，激活先天性免疫或獲得性免疫，導致視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元的進行性退化[8]。BRB可能通過以下途徑參與DR的免疫學發(fā)?。?1)BRB的損傷導致血漿成分外滲和脂蛋白修飾，引起自身抗體合成，進而導致免疫復(fù)合物的形成。DR中免疫復(fù)合物形成與周細胞丟失、白細胞淤滯、巨噬細胞活化等有關(guān)[4]。(2)在DR的早期階段，視網(wǎng)膜周細胞抗體可能與周細胞表面抗原發(fā)生反應(yīng)，通過激活補體系統(tǒng)誘導周細胞損傷，導致iBRB的破壞[9]。同時，iBRB的破壞使免疫球蛋白和補體因子進入視網(wǎng)膜周細胞，誘導細胞毒性效應(yīng)，導致視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)的進一步損傷。(3)高血糖下視網(wǎng)膜的BRB被破壞，周細胞表達II型膠原蛋白增加，II型膠原蛋白與免疫活性細胞直接接觸，激活自身免疫機制，誘發(fā)DR的發(fā)生發(fā)展[10]。Nakaizumi等[11]發(fā)現(xiàn)，DR患者血清中II型膠原蛋白IgG抗體水平顯著高于非炎癥性眼病患者。Balashova等[12]亦報道了DR患者的血清和淚液中II型膠原蛋白抗體和免疫復(fù)合物水平增高。

2 小膠質(zhì)細胞

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中先天免疫系統(tǒng)的吞噬細胞，視網(wǎng)膜和視神經(jīng)作為CNS眼部的外延，小膠質(zhì)細胞在眼病的免疫學發(fā)病中扮演著重要角色[13]。小膠質(zhì)細胞主要位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)層、內(nèi)叢狀層、外叢狀層，作為免疫細胞參與免疫反應(yīng)，維持視網(wǎng)膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)[14-15]。在高血糖、缺血、缺氧、血脂異常等環(huán)境下，小膠質(zhì)細胞異常激活，由分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜖?，進一步發(fā)生增殖、遷移和極化，發(fā)揮著保護和損傷視網(wǎng)膜組織的雙重作用[14]。

近年來，DR中小膠質(zhì)細胞的激活已通過基礎(chǔ)和臨床研究得到證實。早期實驗研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠發(fā)病4個月后，視網(wǎng)膜各層小膠質(zhì)細胞密度明顯增加，且分枝狀突起變厚變短，小膠質(zhì)細胞呈激活狀態(tài)[16]；另一項研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增加，表明其增殖、遷移能力增強[17]； Arroba等[18]在5周齡DR小鼠模型視網(wǎng)膜內(nèi)核層中發(fā)現(xiàn)了活化的小膠質(zhì)細胞，并檢測到雙免疫陽性細胞的增加，表明小膠質(zhì)細胞在DR的早期階段就表現(xiàn)出M2抗炎表型。在人類視網(wǎng)膜中，小膠質(zhì)細胞激活存在于DR的不同階段[19]。Zeng等[19]使用HLA-DR抗原、CD45或CD68抗體對不同階段DR患者視網(wǎng)膜中的小膠質(zhì)細胞進行免疫標記，發(fā)現(xiàn)在DR的不同階段小膠質(zhì)細胞數(shù)量均明顯增多，并呈肥大狀態(tài)，且在部分黃斑囊樣水腫患者的視網(wǎng)膜中，小膠質(zhì)細胞浸潤到視網(wǎng)膜外部和視網(wǎng)膜下間隙中； Scott等[3]使用多西環(huán)素治療輕中度非增生型DR(NPDR)患者、Cukras等[20]使用米諾環(huán)素治療DR患者，均取得了較好的臨床療效。而多西環(huán)素、米諾環(huán)素均屬于抑制小膠質(zhì)細胞活化的藥物，亦從側(cè)面證明小膠質(zhì)細胞激活在DR發(fā)病中扮演著重要角色。

小膠質(zhì)細胞可能通過以下途徑參與DR的發(fā)生發(fā)展：(1)小膠質(zhì)細胞通過吞噬RGC，造成其丟失[14，21]。Anderson等[22]通過實驗發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞通過結(jié)合補體受體3，吞噬非凋亡新生RGC，來調(diào)節(jié)胚胎小鼠的RGC密度。Bai等[23]發(fā)現(xiàn)，醛酮還原酶1可通過激活核因子κB(NF-κB)通路誘導小膠質(zhì)細胞活化，進而抑制RGC的活性并促進其凋亡。(2)小膠質(zhì)細胞分泌細胞毒性物質(zhì)、炎癥因子介導RGC的凋亡和死亡。Altmann等[24]認為，活化的小膠質(zhì)細胞通過激活NF-κB和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，釋放細胞毒性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)，介導RGC凋亡。(3)小膠質(zhì)細胞通過破壞BRB的結(jié)構(gòu)和功能，參與DR的發(fā)病。還有研究表明，小膠質(zhì)細胞通過改變視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞間的緊密連接蛋白、誘導內(nèi)皮細胞和周細胞的丟失等途徑破壞iBRB，從而在DR發(fā)病中發(fā)揮作用[25]。Yun等[26]在小鼠視網(wǎng)膜上發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞通過分泌白細胞介素(IL)-6誘導STAT3通路的激活，降低緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達來增加小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮通透性。目前關(guān)于小膠質(zhì)細胞在oBRB中的作用尚不完全明確。Jo等[27]在不同類型的DR小鼠模型中觀察到小膠質(zhì)細胞在RPE層的聚集，提示激活的小膠質(zhì)細胞可能以跨RPE細胞的方式向視網(wǎng)膜外遷移。該團隊進一步發(fā)現(xiàn)IL-6處理的小膠質(zhì)細胞分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)，進而通過激活NF-κB通路降低RPE細胞中ZO-1的表達，從而破壞DR中的oBRB。(4)小膠質(zhì)細胞誘導視網(wǎng)膜新生血管形成[15]。Boeck等[28]在氧誘導視網(wǎng)膜病變 (OIR) 的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)具有增殖和遷移表型的小膠質(zhì)細胞在視網(wǎng)膜的缺血和新生血管區(qū)域聚集。Xu等[29]使用OIR小鼠視網(wǎng)膜冷凍切片進一步研究發(fā)現(xiàn)，阿米巴狀小膠質(zhì)細胞存在于表層和神經(jīng)纖維層中，與新生血管形成密切相關(guān)。

3 補體系統(tǒng)

補體的發(fā)現(xiàn)可以追溯到19世紀末， Ling等[30]在血液中發(fā)現(xiàn)了一種未知的不耐熱的裂解物質(zhì)，它對各種細菌具有活性，后被命名為補體。補體系統(tǒng)由30多種血漿蛋白、膜結(jié)合受體和調(diào)節(jié)蛋白組成，是非特異性先天免疫反應(yīng)的重要組成部分。大多數(shù)血清中的補體是無活性的酶原狀態(tài)，通過經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑被激活，激活后表現(xiàn)出明顯的生物活性。

研究表明，DR中的視網(wǎng)膜血管損傷與補體系統(tǒng)激活密切相關(guān)[8]。Gerl等[31]發(fā)現(xiàn)，DR患者的Bruch膜、脈絡(luò)膜毛細血管含有較高水平的C3d和C5b-9復(fù)合物，同時具有膜攻擊復(fù)合物的沉積；Laura等[32]發(fā)現(xiàn)高濃度的補體C3與DR的風險增加有關(guān)； Xu等[33]發(fā)現(xiàn)補體C5基因多態(tài)性與PDR具有相關(guān)性。

補體系統(tǒng)激活可能通過以下途徑促進DR的發(fā)生發(fā)展：(1)經(jīng)典途徑：目前缺乏對DR患者視網(wǎng)膜中經(jīng)典途徑蛋白的檢測，故對經(jīng)典途徑在DR發(fā)病機制中的作用研究相對較少。García-Ramírez等[34]研究發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體中C4b、C3、C9、因子B相關(guān)補體蛋白明顯高于非糖尿病患者，其中對C3、因子B進一步行蛋白免疫印跡實驗，與RT-PCR定量定時測定mRNA表達結(jié)果一致，說明DR發(fā)病與經(jīng)典途徑補體激活有密切聯(lián)系。孫洪巖等[35]發(fā)現(xiàn)，C4在DR患者血清中呈高表達，推測DR病理進程中有補體所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和經(jīng)典途徑補體系統(tǒng)的激活； Huang等[36]通過實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠外泌體中缺乏IgG會導致視網(wǎng)膜血管損傷減少，并進一步通過C1激活實驗推測血漿中載有IgG的外泌體可能通過結(jié)合C1復(fù)合物，使C1復(fù)合物蛋白水解被激活，從而激活經(jīng)典補體途徑，導致下游視網(wǎng)膜血管損傷。(2)替代途徑：DR患者中存在補體替代途徑早期階段被過度激活，表明補體介導的炎癥可能有助于加速DR[37]。在人類和小鼠糖尿病研究中已經(jīng)證實，補體系統(tǒng)的兩種膜結(jié)合抑制劑CD55和CD59的水平降低，這些發(fā)現(xiàn)表明DR中存在補體替代途徑的激活[38]； Mandava等[39]研究發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體內(nèi)16種補體成分水平顯著高于非糖尿病患者，其中C3a/C3、C5a/C5和Ba/因子B的比率較對照組更高，C3、C5和因子B的局部和眼內(nèi)激活表明PDR患者補體替代途徑的激活。(3)凝集素途徑： Geng等[40]通過橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，DR患者血清甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)水平高于健康受試者，且MBL水平隨著DR嚴重程度的增加而升高，提示補體凝集素激活途徑參與DR的發(fā)生； Holt等[41]發(fā)現(xiàn)，血清中凝集素途徑蛋白MAp44、MASP-2高水平與DR相關(guān)，同時高水平的H-ficolin與單純視網(wǎng)膜病變的發(fā)生相關(guān)，提示凝集素途徑補體激活在DR的早期階段可能起著更為突出的作用。

4 細胞因子

細胞因子是由免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導多種細胞合成并分泌的具有廣泛生物學活性的低相對分子質(zhì)量的蛋白或多肽[42]。眾多細胞因子在機體內(nèi)相互促進或相互制約，形成復(fù)雜的細胞因子免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。高糖環(huán)境刺激局部和全身炎癥因子和趨化因子的表達增加，其導致的持續(xù)輕度炎癥被認為促進了DR血管和免疫系統(tǒng)的相關(guān)損傷，誘導BRB的破壞，進一步導致黃斑水腫和視網(wǎng)膜新生血管的形成[43]。

4.1 ILIL最初定義為傳遞免疫信號，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的增殖、活化，免疫信息的調(diào)節(jié)和傳遞，調(diào)控機體的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用，目前在DR的發(fā)病中IL-6和IL-1β研究相對較多。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠、DR患者中均有IL-6表達的升高[44-45]。且有研究表明IL-6是炎癥性血管滲漏的關(guān)鍵介質(zhì)，通過直接或間接影響血管內(nèi)皮細胞在DR的發(fā)病中發(fā)揮作用[46]。Valle等[47]發(fā)現(xiàn)，IL-6轉(zhuǎn)信號通路通過誘導細胞間黏附分子-1表達的上調(diào)，導致iBRB的破壞； Yun等[48]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，IL-6通過降低緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達，激活視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中的STAT3信號通路，增加小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮的通透性和血管滲漏；此外，IL-6可誘導血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生，并促進新生血管的生成， Zhou等[49]亦發(fā)現(xiàn)IL-6水平與PDR患者的新生血管程度呈正相關(guān)。多項研究表明，IL-1β通過誘導血管滲漏、促使血管收縮和神經(jīng)變性，已成為DR發(fā)病早期的重要炎癥因子[50]。在2月齡嚙齒動物的視網(wǎng)膜和早期DR患者體內(nèi)，IL-1β表達均上調(diào)[51]。同時，向非糖尿病大鼠玻璃體內(nèi)注射重組IL-1β，可促進視網(wǎng)膜毛細血管細胞的氧化應(yīng)激和凋亡，而這正是DR的組織病理學特征[52]。另外，IL-1β可通過激活NF-κB信號通路促進IL-6等炎癥因子表達上調(diào)，引起一系列炎癥反應(yīng)[52]。除了其有效的促炎能力外，IL-1β 還可以通過誘導新生血管的形成促進PDR的發(fā)展， Stahel等[53]在PDR患者中使用canakinumab (Ilaris) 抑制全身IL-1β，發(fā)現(xiàn)可適度消退新生血管，血管滲漏和黃斑水腫也持續(xù)減輕。

4.2 腫瘤壞死因子TNF-α是由巨噬細胞和單核細胞分泌的一類炎癥因子，在DR的發(fā)病中起著重要作用。DR患者玻璃體液、房水甚至淚液中TNF-α含量高于正常水平， Feng等[54]發(fā)現(xiàn)5年和10年DR組房水中TNF-α水平高于對照組，并與DR的病程和嚴重程度呈正相關(guān)。Amil-Bangsa等[55]通過橫斷面研究發(fā)現(xiàn)淚液中TNF-α含量亦與DR嚴重程度相關(guān)。體外和體內(nèi)研究表明，TNF-α通過增加白細胞對視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的黏附，增加BRB的通透性，從而在DR的發(fā)病中發(fā)揮作用。Aveleira等[56]發(fā)現(xiàn)TNF-α通過PKC/NF-κB途徑降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中緊密連接蛋白claudin-5和ZO-1的表達并改變其分布，從而導致通透性增加；同時TNF-α的基因變異可能增加DR發(fā)生的風險， Gao等[57]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因中的-308 A和-238 A等位基因可能增加DR發(fā)生的風險，并在不同種族中具有差異。

4.3 趨化因子趨化因子是一個小肝素結(jié)合蛋白家族，在機體中主要發(fā)揮免疫監(jiān)視和炎癥作用。研究表明，趨化因子通過介導炎癥、激活信號通路以及促進新生血管的形成等方面發(fā)揮在DR發(fā)病機制中的作用[58]。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是CC趨化因子家族的重要成員，多項臨床研究表明MCP-1在DR患者房水、玻璃體液和血清中含量增高，且與病情的嚴重程度呈正相關(guān)[59-60]。Dong等[61]在嚙齒動物DR模型中發(fā)現(xiàn)，MCP-1表達上調(diào)發(fā)生于DR的早期階段，通過激活視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞，從而觸發(fā)免疫反應(yīng)和輕度炎癥反應(yīng)； Tonade等[62]發(fā)現(xiàn)野生型糖尿病小鼠通過釋放MCP-1，改變視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞間緊密連接，破壞iBRB；同時，MCP-1附著在受體CCR2上，通過募集和累積單核細胞、巨噬細胞，使其聚集在視網(wǎng)膜血管內(nèi)，引起視網(wǎng)膜毛細血管阻塞，導致血管滲漏及無灌注[58]；此外，遺傳學研究表明，MCP-1基因多態(tài)性可能對DR的發(fā)病機制產(chǎn)生嚴重影響。Jiang等[59]發(fā)現(xiàn)MCP-1的-2518 GG基因型和G等位基因與中國漢族人群PDR風險增加有關(guān)。Wang等[63]通過薈萃分析進一步證明了上述結(jié)果。

DR的發(fā)病還與CCL3、CCL5、CCL21、CX3CL1、CXCL16等多種趨化因子相關(guān)。 Zeng等[64]發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體液中多種趨化因子濃度高于對照組，其中趨化因子CCL3與DR早期視網(wǎng)膜損傷機制相關(guān)，CCL5和CCL21與PDR中纖維血管膜的形成有關(guān)； El-Asrar等[65]亦發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體樣本中CXCL16、CX3CL1水平均顯著增加。

5 小結(jié)

綜上，免疫系統(tǒng)失調(diào)和炎癥是DR發(fā)生發(fā)展的重要因素，其中BRB是視網(wǎng)膜的第一道免疫防線，小膠質(zhì)細胞具有保護和傷害視網(wǎng)膜的雙重作用，補體系統(tǒng)的損傷程度與DR進展呈正相關(guān)，多種細胞因子相互作用影響免疫調(diào)節(jié)。目前治療DR的主要方法有視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)、玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物、皮質(zhì)類固醇類藥物、玻璃體切割術(shù)等，但均存在諸多局限性。因此，認清DR發(fā)病的本質(zhì)才是解決DR的根本方式。近年來，免疫機制研究成為DR研究熱點，但是免疫機制在DR中發(fā)揮的具體作用還有待深入研究，進而為臨床治療DR提供新的依據(jù)和策略。