王瑋 德吉卓嘎 白央 田蕾 蘭利瓊 陳浩 孫群 高鵬**

（1.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院；2.國家藥品監(jiān)督管理局中藥（藏藥）質(zhì)量控制重點實驗室，西藏 拉薩 850000；3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；4.四川省原子能研究院；5.輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都 610000）

藏醫(yī)藥學(xué)是中國醫(yī)學(xué)寶庫中的重要的一部分，是頗具代表性的優(yōu)秀傳統(tǒng)文化，也是世人普遍公認(rèn)的中華民族醫(yī)藥寶庫中一顆璀璨明珠，藏醫(yī)藥學(xué)也是迄今世界醫(yī)學(xué)中原始形態(tài)保存最完好的醫(yī)學(xué)之一[1，2]。藏醫(yī)藥學(xué)在不斷實踐中得到傳承與創(chuàng)新，時至今日，自身已發(fā)展成為一套完整且科學(xué)的醫(yī)學(xué)體系[3]。其中藏成藥組方獨特，通常處方藥味眾多，動物和礦物藥材使用廣泛，以其獨特的工藝成為藏醫(yī)藥最為獨特的一面[4]。藏藥十一味能消丸為典型的藏藥水丸劑，其主要成分為藏木香、小葉蓮、干姜、沙棘膏、訶子肉、蛇肉（制）、大黃、方海、北寒水石、硇砂、堿花（制），主要用于化瘀行血，通經(jīng)催產(chǎn)，經(jīng)閉，月經(jīng)不調(diào)，難產(chǎn)，胎盤不下，產(chǎn)后瘀血腹痛[5]。十一味能消丸中主要成分大黃是多種蓼科大黃屬的多年生植物，具有止血、調(diào)節(jié)血脂、免疫調(diào)控等功效。本研究主要以測定其中大黃素和大黃酚在輻照前后的變化為研究基準(zhǔn)[6]。

藏藥近幾年雖然發(fā)展快速，但其微生物污染問題比較突出，已較為明顯地影響到藏藥的生產(chǎn)、銷售和品質(zhì)，為藏藥固體制劑尋求一種經(jīng)濟、高效的滅菌方法已迫在眉睫[7]。目前常用的中藥滅菌方法包括干熱滅菌、濕熱滅菌、輻照滅菌、和環(huán)氧乙烷氣體滅菌等，這些方法各有其特點[8]。輻射滅菌法被稱為“冷滅菌”，不會引起被輻照物明顯溫度升高，對有揮發(fā)性和熱敏性中藥的殺菌有突出的優(yōu)越性[9-11]。輻照滅菌中常用的輻照源有60Co-γ射線和電子束，其中60Co-γ射線輻照滅菌具有高效、操作簡單，穿透力強等優(yōu)點，但存在射線利用率不高、放射核素衰減、特別是輻射源運輸、貯存和廢源處理等安全問題[12]。電子束輻照具有操作安全簡便、穿透性強、加工效率高、安全環(huán)保、裝備易于安裝等特點，特別是其具有更易于質(zhì)量控制、無核廢料等優(yōu)點，工作后可關(guān)閉[13-17]。目前，輻照滅菌所用劑量一般參照2015 年版《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》，其中規(guī)定中藥最大總體平均輻照劑量原則上不超過10 kGy。

綜合考慮輻照技術(shù)的發(fā)展趨勢和安全環(huán)保問題，本研究通過不同劑量的電子束輻照處理藏藥十一味能消丸，研究電子束輻照對藏藥十一味能消丸的輻照滅菌效果和有效成分的影響，同時與7 kGy 的60Co-γ射線輻照處理組比較，探究不同類型射線的輻照效應(yīng)，以期為電子束輻照技術(shù)在藏藥十一味能消丸的滅菌處理的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 材料與試劑

十一味能消丸（A 企業(yè)，批號為20150，選自拉薩市；B 企業(yè)，批號為20210301，選自山南地區(qū)；C 企業(yè)，批號為151217，選自阿里地區(qū)），樣品選取以地區(qū)差異性和生產(chǎn)工藝差異性為首要考慮條件。

大黃酚（純度為99.4%，中國食品藥品檢定研究院，批號為110796-201922）；大黃素（純度為96.0%，中國食品藥品檢定研究院，批號為110756-201913）；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號為206403）；硫酸（AR，批號為20110808）；磷酸（AR，批號為2016080201）；三氯甲烷（AR，批號為2020021901），無水硫酸鈉（批號為20130220）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Waters）2695（美國沃特斯公司，出廠編號為K10SM4214A）；HTY-761 勻漿儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；電子天平（瑞士梅特勒公司，型號為AE200,精度為萬分之一）；微量電子天平（瑞士梅特勒公司，型號為XP205,精度為十萬分之一）；電子天平（德國賽多利斯公司，型號為BSA2202S-CW，精度為百分之一）；電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，型號為HWS-26）；數(shù)顯式電熱恒溫三用箱（上海躍進醫(yī)療器械廠，型號為S·HH·W21·420S）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒，型號為CHP-9270N）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠，型號PYX-DHS-60×75）；霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒，型號為MJ-250Ⅱ）；高壓蒸汽滅菌器（重慶雅馬拓公司，型號為SQ810C）。

1.3 培養(yǎng)基和菌種

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號為200224）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號為200709）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號為201214）；RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號為190823）；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號為190627）；麥康凱液體培養(yǎng)基（批號為210218）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號為201214）；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號為191231）；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號為191224）；以上培養(yǎng)基選用品牌為“北京陸橋”。大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44 102〕；乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）〔CMCC（B）50 094〕；以上菌種由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法

2.1 樣品準(zhǔn)備與輻照處理

首先，將三個廠家的樣品進行分裝，分裝15 份，每份40 g，以無菌采樣袋密封，準(zhǔn)備輻照處理。電子束輻照處理樣品在四川潤祥輻照技術(shù)有限公司進行（高能電子加速器，10 MeV，20 KW），60Co-γ 輻照處理樣品于四川省原子能研究院開展。每個廠家的樣品中3 份不做任何操作，作為對照組（0 kGy）；其余12份分別以電子加速器5kGy、7kGy、10kGy，以及60Co-γ 的7 kGy 進行輻照滅菌處理，作為試驗組。根據(jù)《中國藥典》的檢測方法要求，每組樣品后續(xù)測試都進行2 次平行試驗。試驗組樣品在輻照后將每個吸收劑量中的1 份立即進行在49 ℃下加速貯藏3個月處理，后續(xù)與試驗組進行相同的含量檢測和微生物檢測。

2.2 微生物限度測定

按2020版《中國藥典（四）部）》非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查（通則1105）：微生物計數(shù)法；非無菌產(chǎn)品微生物限度檢測（通則1105）：控制菌檢查法；非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107）[5]。按照上述方法對對照組和試驗組進行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌進行檢測，同時接種大腸埃希氏菌和乙型副傷寒沙門菌觀察陽性對照反應(yīng)。

2.3 含量測定

按2020 版《中國藥典（一部）》中“十一味能消丸”下“含量測定”方法對輻照前后樣品進行有效成分“大黃酚”“大黃素”及總和測定[5]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（M±SD）。

3 結(jié)果與分析

3.1 滅菌前后性狀觀察

經(jīng)觀察，A、B、C 三個廠家樣品輻照前后無明顯差異，均為棕色至黃褐色的水丸，氣微，味咸、微苦、澀。

圖1 不同吸收劑量處理后樣品性狀

3.2 微生物限度檢測

樣品經(jīng)輻照后立即以及加速貯藏3個月后的微生物限度檢測結(jié)果分別見表1和表2。可見，廠家A、C在未經(jīng)輻照滅菌前微生物限度不符合2020版《中國藥典（四）部）》非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107）中非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（丸劑需氧菌總數(shù)6×104CFU/g，霉菌、酵母菌總數(shù)200 CFU/g，控制菌大腸埃希菌和沙門菌不得檢出，耐膽鹽革蘭氏陽性菌＜10 CFU/g）[5]，其中三個廠家樣品控制菌未經(jīng)輻照均都符合規(guī)定要求。經(jīng)電子束5 kGy輻照處理廠家A、B均能符合《中國藥典》規(guī)定要求，C廠家需氧菌總數(shù)和霉菌、酵母菌總數(shù)也有明顯下降，且三個廠家微生物限度結(jié)果都已符合《中國藥典》中的規(guī)定。由表2可看出，經(jīng)過加速貯藏三月后樣品中的微生物總數(shù)沒有增殖。

表1 不同吸收劑量處理對十一味能消丸微生物存活數(shù)的影響

表2 不同吸收劑量處理十一味能消丸經(jīng)49 ℃加速貯藏三個月后微生物存活數(shù)

3.3 有效成分含量測定

三個廠家十一味能消丸經(jīng)不同吸收劑量處理后立即測定和加速貯藏后測定的大黃素、大黃酚、大黃素大黃酚總和結(jié)果見表3和表4。

表3 不同吸收劑量處理下十一味能消丸的活性成分即測含量

表4 不同吸收劑量處理十一味能消丸的活性成分在49 ℃加速貯藏后的含量

由結(jié)果看出，廠家A 樣品在不同劑量電子束輻照后大黃素和大黃酚的含量沒有明顯變化；同一吸收劑量下，60Co-γ 輻照后樣品中其含量與電子束輻照相比也無明顯變化；廠家B 樣品在不同劑量電子束輻照大黃素和大黃酚含量隨著吸收劑量的增加有一定下降趨勢；同一吸收劑量下，60Co-γ 輻照后樣品中其含量與電子束輻照相比有下降趨勢，但趨勢不明顯。同時，輻照后廠家C 樣品中即測大黃素和大黃酚的含量沒有明顯變化，而加速貯藏后含量有明顯下降趨勢；同一吸收劑量下，60Co-γ 輻照后樣品中其含量與電子束輻照相比有下降趨勢。

由此可見，在5～10 kGy 的劑量范圍內(nèi)，電子束輻照對十二味能消丸的有效成分含量無明顯影響；同一吸收劑量下，60Co-γ 輻照和電子束輻照對其有效成分含量的影響并無明顯差異；加速貯存條件下，個別廠家的樣品輻照后其有效成分含量有稍微下降，這跟貯藏條件、樣品和生產(chǎn)工藝差異、有效成分具有光敏性等因素有一定相關(guān)性。

4 討論

藏藥多為生藥原粉直接入藥，較容易引入的微生物污染問題。當(dāng)下濕熱蒸汽滅菌和微波滅菌等技術(shù)均不能完全解決此問題，如含有揮發(fā)性藥材的散劑，濕熱蒸汽滅菌一方面導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分損失而影響其藥效，另一方面因吸濕、結(jié)塊，容易影響后續(xù)生產(chǎn)工藝。藏藥的微生物污染問題得不到有效解決，導(dǎo)致其按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗不合格，一定程度阻礙了藏藥的推廣、銷售和使用。鈷60在中藥材輻照方面開展的研究已有多年歷史，隨著技術(shù)更新和裝備升級，電子束輻照技術(shù)成為新興的發(fā)展趨勢，而電子束在產(chǎn)生機理、作用特征與伽馬射線都存在實質(zhì)性差異，其滅菌的生物學(xué)效應(yīng)以及安全性等還未有系統(tǒng)性研究，因此，開展電子束在藏藥滅菌中的應(yīng)用研究具有重要實際意義。

本試驗以藏藥十一味能消丸為對象，研究了電子束對其輻照滅菌效果和有效成分的影響。研究結(jié)果表明：三個廠家的樣品在輻照前后性狀沒有發(fā)生變化；經(jīng)不同劑量處理后，電子束輻照和60Co-γ 輻照均能顯著降低十一味能消丸內(nèi)微生物的含量，且電子束吸收劑量5 kGy 就能滿足將微生物數(shù)量降低至《中國藥典》所規(guī)定的限度；在5～10 kGy的劑量范圍內(nèi)，電子束輻照對十一味能消丸的大黃素和大黃酚含量無明顯影響；同一吸收劑量下，60Co-γ 輻照和電子束輻照對大黃素和大黃酚含量的影響并無明顯差異（其中廠家B 樣品中的含量隨著吸收劑量增加而有所遞減，但趨勢不明顯）；49℃加速貯藏3 個月后，廠家A、B 在原有吸收劑量影響基礎(chǔ)上其有效成分含量沒有發(fā)生明顯變化，而廠家C 樣品有所降低，分析原因可能有以下三點：（1）試驗設(shè)計時樣品的選擇依據(jù)是有效成分的含量要有差異性，試驗中的三個廠家來自西藏不同地區(qū)，原料藥來源有差異性，生產(chǎn)工藝和水平也存在差距，可考察輻照對不同品質(zhì)樣品中有效成分的影響；（2）不同廠家成品藥包裝的差異性：A 廠家為鋁塑包裝，B、C 廠家為塑料透明包裝；（3）大黃素和大黃酚為光敏物質(zhì)，在輻照和加速貯藏過程中可能產(chǎn)生光學(xué)影響［18］。因此，在實際輻照滅菌過程中，一要嚴(yán)格按照《中國藥典》要求，控制生產(chǎn)工藝和藥品品質(zhì)；二要根據(jù)藥品性質(zhì)特點和貯存條件要求進行包裝，避免因操作不當(dāng)造成藥品損失。

綜上，本研究結(jié)果顯示電子束輻照技術(shù)對十一味能消丸微生物數(shù)量有顯著降低作用，達到《中國藥典》規(guī)定的微生物限度，而且對其有效成分含量和性狀無顯著影響，藏藥十一味能消丸輻照滅菌的最佳電子束吸收劑量為5 kGy，此結(jié)果可為電子束作為藏藥十一味能消丸的滅菌方式提供數(shù)據(jù)支持。另外，西藏作為國家重要的生態(tài)屏障，是我國重要河流的發(fā)源地，在生態(tài)環(huán)境保護與發(fā)展相協(xié)調(diào)的前提下［19］，電子束輻照滅菌在藏藥加工生產(chǎn)中具有突出技術(shù)優(yōu)勢，本文結(jié)論也可為電子束在其它藏藥輻照滅菌研究提供技術(shù)支撐。